Orientador: Caris Maroni Nunes / Banca: Paulo Roberto Martins Ribolla / Banca: Valéria Marçal Felix de Lima / Resumo: A importância da leishmaniose visceral no contexto da saúde pública tem aumentado na ultima década. A manifestação da leishmaniose visceral nos cães é variável e estudos sobre a genética e a sua relação com a leishmaniose visceral têm indicado alguns genes envolvidos na susceptibilidade e resistência a esta doença. O objetivo deste estudo foi avaliar a relação entre as variantes alélicas dos gene Slc11a1 (solute carrier family 11 member 1) e DLA-DRB1 (dog leukocyte antigen) com a positividade para leishmaniose, determinada por meio da amplificação de DNA de cinetoplasto de Leishmania sp., por PCR, e pela presença de anticorpos anti-Leishmania sp. ao teste ELISA indireto. Foram observadas associações estatisticamente significantes entre a positividade para leishmaniose e: i. a presença do alelo (141, 145 ou 149) da região microssatélite (TAAA)n localizada no íntron 1 do gene Slc11a1 (P< 0,0001) ii. a variação do número de guaninas (8 ou 9 G) da região promotora (P=0,0280) (em ambos os casos quando analisados separadamente) e iii. a presença de qualquer dos alelos da região microssatélite associado a 8 ou 9 G da região promotora (P= 0,0025). A presença do alelo 141 foi estatisticamente associada à negatividade em cães (P<0,0001). Não foi observada associação estatisticamente significante entre a positividade à leishmaniose e a freqüência dos alelos do exon 2 do gene DLA- DRB1, embora tenha sido observada associação significante entre a freqüência dos alelos DRB1-W, DRB1*00101 ou DRB1-T e o resultado negativo para leishmaniose, podendo ser estes potenciais marcadores para resistência à leishmaniose em cães / Abstract:he importance of visceral leishmaniasis in the context of public health has increased in the last decade. The manifestation of visceral leishmaniasis in dogs is variable and genetic studies and its relationship with visceral leishmaniasis have shown some candidate genes involved in susceptibility and resistance to this disease. This study aimed at evaluating the relationship between polymorphism of the genes Slc11a (solute carrier family 11 member 1), and DLA-DRB1 (dog leukocyte antigen) and the positivity to leishmaniasis determined by the amplification of Leishmania sp. kinetoplast DNA by PCR and the presence of anti-Leishmania sp. the indirect ELISA. We observed statistically significant associations between the leishmaniasis positive diagnosis and i. the presence of intron 1 microsatellite region alleles (141, 145 or 149) (P<0.0001), ii. the variation on the guanine number (8 or 9) in the promoter region (P=0.0280) (in both cases when analyzed separately), iii. the presence any of the microsatellite alleles associated to 8 or 9 G in the promoter region (P=0.0025). Microsatellite allele 141 was associated to negativity to leishmaniasis (P<0.0001). There was no association between the presence of any of the exon 2 DLA-DRB1 alleles and the leishmaniasis positive animals, although significant association between the frequency of the alleles DRB1-W, DRB1*00101 or DRB1-T and negative results to leishmaniasis were observed. These might be potential markers for dog's resistance to visceral leishmaniasis / Mestre

A taxa de infecção mínima (TIM) em flebotomíneos é uma informação útil para estudos epidemiológicos em leishmaniose. Quando estes estudos de campo contem grande número de insetos, a PCR é a indicada para caracterização por Leishmania nos vetores. Este estudo avaliou a PCR na identificação da (TIM) natural por Leishmania spp. em Lutzomyia longipalpis e, ao mesmo tempo, determinou as (TIM) por Leishmania spp em uma micro-região endêmica do Estado de São Paulo. Na primeira parte deste estudo, as avaliações do desempenho das PCRs convencional (cPCR) e em tempo real (qPCR) foram realizadas em 66 amostras de conteúdo intestinal de flebotomíneos utilizados no xenodiagnóstico (30 positivas e 36 negativas). O material contido nas lâminas foi transferido para tubos com solução salina estéril e congeladas a -20° C por cerca de 12 meses. Os marcadores moleculares utilizados foram RV1/RV2 para L. (L.) infantum na cPCR; e Linj31 para sub gênero (L.) (Leishmania) na qPCR. Das 30 amostras positivas, 20 (67%) e 21 (70%) foram positivas utilizando os marcadores RV1/RV2 e Linj31, respectivamente. Das 36 amostras negativas no xenodiagnóstico, 2 (5%) foram positivas em todos os marcadores moleculares. Na segunda parte foram analisados insetos capturados durante 2 a 3 noites/mês durante 11 meses (janeiro a novembro de 2012) usando 10 armadilhas automáticas de luz do tipo CDC ao redor de um canil em uma transição entre bairro periurbano e urbano de Dracena. As áreas de captura foram agrupadas em 3 zonas para determinar a TIM. Um total de 1.690 Lu. longipalpis foram capturadas durante o período estudado. Destes, 292 (17,25%) eram fêmeas de flebotomíneos e foram agrupadas em 165 pools (1 a 5 insetos) para extração de DNA e análise por PCR. Resultados positivos para L. (L.) infantum na cPCR e qPCR foram vistos em 7,28% (12/165) e 4,85% (8/165) das amostras, respectivamente. Estes dados confirmam que espécimes capturados na área de estudo estavam infectados por L. (L.) infantum. A TIM durante os 11 meses de capturas foi de 4,10% (292 fêmeas coletadas). Os ecótopos com TIM mais altos foram canil, galinheiro e casa 2. Flebotomíneos infectados estavam presentes nos locais de captura com abundância de hospedeiros. O maior número de pools positivos (6/93) foi obtido no galinheiro, todavia a maior TIM foi obtido em um domícilio (1/6) 16,67%. / The minimum infection rate (MIR) in sandflies is a useful information for epidemiological studies on leishmaniasis. When these field studies consider large numbers of insects, PCR is indicated for identification and characterization of Leishmania in the vectors. This study evaluated a PCR in the identification of natural (MIR) by Leishmania spp. in Lutzomyia longipalpis and, at the same time, determined MIR by Leishmania spp in a micro region endemic in São Paulo State . In the first part of this study, the performance evaluation of conventional PCR (cPCR) and real-time PCR (qPCR) were carried out on 66 intestinal contents samples of non-xenodiagnostic sandflies (30 positive and 36 negative). The material contained in the slides was transferred to tubes with sterile saline solution and frozen at -20 ° C for about 12 months. The molecular markers used were RV1 / RV2 for L. (L.) infantum in cPCR; E Linj31 for sub genus (L.) Leishmania on qPCR. From the 30 positive samples, 20 (67%) and 21 (70%) were positive using the RV1 / RV2 and Linj31 markers, respectively. From the 36 negative xenodiagnostic samples, 2 (5%) were positive in all molecular markers. In the second part, we analyzed insects captured during 2 to 3 nights / month for 11 months (January to November 2012) using 10 CDC automatic light traps around a kennel in a transition between urban and suburb of Dracena. Capture areas were grouped into 3 zones to determine MIR. A total of 1,690 Lu. longipalpis were captured during the study period. From these, 292 (17.25%) were female sand flies and were grouped into 165 pools (1 to 5 insects) for DNA extraction and PCR analysis. Positive results for L. (L.) infantum in cPCR and qPCR were seen in 7.28% (12/165) and 4.85% (8/165) of the samples, respectively. These data confirm that the specimens captured in the study area were infected by L. (L.) infantum. The MIR during the 11 months of captures was 4.10% (292 females collected). The highest MIR ecotopes were kennel, chicken coop and house 2. Infected sandflies were presented at capture sites with host abundance. The highest number of positive pools (6/93) was obtained in henhouse, however the highest MIR was obtained in a domicile (1/6) 16.67%.

As infecções sistêmicas causadas por Candida spp. representam importante causa de morbidade e mortalidade em pacientes pediátricos internados em unidades de cuidados intensivos. A utilização de fármacos imunodepressores em pacientes submetidos a transplantes, antibioticoterapia prolongada, nutrição parenteral, presença de cateter venoso central, entre outros fatores, contribuem para o aumento na freqüência destas infecções oportunísticas. Embora Candida albicans permaneça como a espécie mais freqüentemente isolada de episódios de candidemia, tem ocorrido aumento do número de infecções causadas por espécies não albicans. Os métodos convencionais de cultivo apresentam sensibilidade limitada, além de demandar tempo prolongado para a identificação das espécies infectantes. A Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) requer pequenos volumes de sangue para análise, situação ideal para crianças gravemente enfermas, propiciando diagnóstico rápido e identificação precisa das espécies de Candida. Este estudo teve como objetivos padronizar técnicas de PCR de dupla amplificação, para identificar cinco espécies de Candida em amostras de sangue de pacientes pediátricos com risco de desenvolver candidemias, e comparar os resultados com as hemoculturas. Foram analisadas amostras de sangue de 80 pacientes pediátricos internados na Unidade de Terapia Intensiva do Instituto da Criança do Hospital das Clínicas da FMUSP, alocados em dois grupos: 58 pacientes que apresentavam duas ou mais condições predisponentes que elevam o risco de infecção fúngica (Grupo 1); e 22 pacientes em condições clínicas de menor gravidade e risco mais baixo, que foram estudados para avaliação da freqüência de resultados falso-positivos por PCR (Grupo 2). A primeira amplificação identificou fragmento da região ITS do DNA ribossômico, e a segunda etapa amplificou fragmentos espécie-específicos para C.albicans, C.glabrata, C.parapsilosis, C.tropicalis e C.krusei. Para as amostras com detecção de Candida spp. somente por PCR, foram realizadas restrições enzimáticas e seqüenciamentos, para a confirmação da especificidade dos amplificados. A concordância entre os resultados das hemoculturas e das PCR foi avaliada pelo teste de McNemar, com nível de significância de 5%. As hemoculturas foram positivas em 15,5% dos pacientes do grupo 1, enquanto as amplificações por PCR detectaram DNA de Candida spp. em 25,9% dos casos, incluindo todos os pacientes com culturas positivas. Houve concordância na identificação das espécies em 88,9% dos casos. Em dois pacientes, a PCR identificou mais de uma espécie infectante, o que não ocorreu pelas hemoculturas. Nos seis casos em que somente a PCR detectou Candida spp. nas amostras de sangue, as restrições enzimáticas e os seqüenciamentos confirmaram a especificidade das amplificações. No grupo 2, as hemoculturas foram negativas em todos os 22 casos, e a PCR detectou C.glabrata em um paciente, cujos amplificados, após seqüenciamento, apresentaram 98% de homologia com o protótipo. O teste de McNemar mostrou que a discordância encontrada entre os métodos é estatisticamente significante e favorece a PCR (p = 0,031). Os resultados do presente estudo demonstraram que a técnica de PCR apresentou maior poder de detecção de Candida spp. em amostras de pacientes com risco de desenvolver candidemia, quando comparada às hemoculturas. A PCR foi ainda capaz de detectar mais de uma espécie infectante na mesma amostra de sangue / Disseminated candidiasis is an important cause of morbidity and mortality in immunocompromised and critically ill pediatric patients. Increased use of immunosupressive drugs, indwelling catheters, broad-spectrum antibiotics, parenteral nutrition and other predisposing conditions have contributed to the increment of Candida bloodstream infections. Although Candida albicans remains the leading species, a growing number of nonalbicans isolates has been reported. Laboratory diagnosis of candidemia is troublesome due to the lack of blood cultures sensitivity. Detection of Candida DNA by polymerase chain reaction (PCR) in tiny blood volumes may provide a more rapid and reliable candidemia detection in critically ill children. The present study aimed at standardizing nested-PCR amplifications for identification of five Candida species, comparing results with those obtained by blood cultures. Eighty patients admitted to the pediatric intensive care unit of the Instituto da Criança do Hospital das Clínicas da Faculdade de Medicina da Universidade de São Paulo were divided into two groups: 58 patients presenting with two or more predisposing conditions to develop candidemia (Group 1), and 22 patients with lower risk, enrolled to establish the frequency of PCR false-positive results (Group 2). Nested amplifications were targeted to Candida ITS sequence, the first round yielding a gender specific fragment, and the second round identified five Candida species corresponding to C. albicans, C. tropicalis, C. glabrata, C. parapsilosis and C. krusei. When PCR positive results were not confirmed by blood cultures, enzymatic restriction and DNA sequencing were performed. Agreement between both methods was assessed by the McNemar test, adopting a level of significance of 5%. Blood cultures were positive in 15.5% of group 1 patients, whereas nested-PCR identified Candida species in 25.9%, including all culture positive patients. PCR was 88.9% concordant with blood cultures species identification, but only the molecular technique identified dual candidemia in two patients. Amplification products of six patients with negative blood cultures submitted to enzymatic restriction and sequencing analysis showed high degree of homology with Candida reference strains, confirming the specificity of PCR. Blood cultures were negative in all patients of group 2, but PCR detected C.glabrata in one case whose amplification products resulted in 98% of homology with the reference strain. The McNemar test showed disagreement between both methods, favoring PCR (p=0.031). In the present study, PCR was more sensitive to detect Candida species in comparison to blood cultures, being also able to identify dual candidemia

As amostras sangüíneas de 108 pacientes com diagnóstico clínico e laboratorial de Fibrose Cística foram analisadas com o objetivo de padronizar uma PCR clássica e uma PCR- ASO para a detecção da mutação delta F508. Dos 108 pacientes analisados, 23 eram homozigotos para a deleção delta F508 (21,29%), 50 eram heterozigotos (46,29%), e 35 não portadores (32,40%). Ambas as PCR apresentaram reprodutibilidade de 100%, e houve concordância absoluta entre os resultados deste estudo e aqueles dos laboratórios de referência. Concluímos que as padronizações propostas foram bem sucedidas, e recomendamos que os pacientes sejam testados com as duas técnicas, o que, encarece a investigação laboratorial, porém, aumenta significativamente o grau de confiabilidade dos resultados / Blood samples were drawn from 110 clinically and laboratory diagnosed Cystic Fibrosis patients in order to standardize one classical amplification and one ASO-PCR for detecting the delta F508 mutation. Twenty-four of 110 patients (21,8%) were homozygous for the delta F508 deletion, 51 were heterozygous, and the remaining 35 (31,8%) were non-carriers. Both PCR techniques presented with 100% reproducibility, and there were no discrepancies between our results and those from the reference laboratories. We concluded that the 2 amplification systems were successfully standardized in this study, and recommended that all patients should be tested by both techniques in order to increase reliability, albeit the increment of laboratory costs

Abstract not available

Includes bibliographies. / [xvii], 173, [38] leaves, [18] leaves of plates : / Title page, contents and abstract only. The complete thesis in print form is available from the University Library. / This thesis presents the development of an assay for reverse transcription-polymerase chain reaction (RT-PCR) to be applied to the immunomagnetic isolation of carcinoma cells, as a possible means of detecting small numbers of breast cancer cells in a haemopoietic environment. The messenger RNA expression of two different genes, CD44 and the cytokeratin K19, is assessed for suitability as tumour markers for the Immunobead RT-PCR method, and clinical results using K19 are presented. / Thesis (M.D.)--University of Adelaide, Dept. of Medicine, 1977?

Thesis (Ph. D.)--University of Hong Kong, 2007. / Title proper from title frame. Also available in printed format.

<p>Nuts of all kinds are common ingredients in food. For nut allergy sufferers the frequent use of nuts cause problems and "hidden" nuts in food products may elicit allergic reaction when such foods are consumed. Methods for detecting and quantifying walnut (and other nuts) with high sensitivity and specificity are therefore very important.</p><p>The objective of this project was to verify the specificity of a rabbit antiserum against walnut with immunodiffusion and to determine the size of the dominant walnut antigens with Western blotting. In addition, a commercial sandwich ELISA for walnut quantification was validated and compared with a qualitative real-time PCR.</p><p>The rabbit antiserum proved to be less specific but after absorption with cross-reacting nuts and seeds it showed high specificity. The ELISA kit reacted, except for walnut, with pecan and slightly with other nuts and seeds tested. The PCR showed an absolute specificity to walnut. As low levels as 2.5mg walnut/kg can be quantified with the ELISA. This is 8 to 100 fold less than with the PCR method. It is therefore concluded that the ELISA kit is more sensitive than the PCR method but the PCR method is more specific than the ELISA kit.</p>

<p>The project aim is to determine if good quality DNA can be extracted from barley, malt and hop, ingredients used in beer brewing. Good quality DNA is important in DNA fingerprinting techniques which can be used for identification of ingredients. The 3 methods tested are the cetyltrimethylammonium bromide (CTAB) method, QIAGEN DNeasy Plant Mini Kit and Meyer’s method as published in 1996 with QIAGEN DNeasy Plant Mini Kit in combination. To evaluate the DNA quality after extraction we used 3 different techniques:</p><p>(i) spectrophotometry to estimate purity by using the ratio A260/A280; (ii) agarose gel electrophoresis after DNA extraction to determine the success of the extraction and evaluate the amount of high molecular weight DNA and degradation; and (iii) the polymerase chain reaction with 4 different primer pairs, together with agarose gel electrophoresis, to determine if the extracted DNA could be used in downstream applications, see the effect of inhibitors and estimate the fragmentisation of the DNA. The results achieved using the above mentioned methods were then used to evaluate the success of each of the extraction methods in their function of extracting high quality DNA from barley, malt and hop as well as determining whether the treatment of the ingredients has an effect on the DNA quality.</p>

Thesis (M.S.)--University of Missouri-Columbia, 2006. / The entire dissertation/thesis text is included in the research.pdf file; the official abstract appears in the short.pdf file (which also appears in the research.pdf); a non-technical general description, or public abstract, appears in the public.pdf file. Title from title screen of research.pdf file viewed on (Feb. 23, 2007). Includes bibliographical references.