Memoria para optar el título de Bioquímico / La periodontitis crónica es una enfermedad de etiología infecciosa, caracterizada por la respuesta inflamatoria e inmune exacerbada por parte del hospedero que produce la destrucción de tejidos de soporte del diente. Actualmente, se postula que para el establecimiento de esta patología se produce una sucesión ecológica desde una comunidad microbiana asociada a salud hacia una asociada a enfermedad periodontal. En esta sucesión es imprescindible la presencia de ciertos patógenos que faciliten el remodelamiento de la microbiota oral y la progresión hacia enfermedad, siendo Porphyromonas gingivalis un patógeno clave en este proceso. P. gingivalis es una bacteria anaerobia estricta capaz de invadir y permanecer al interior de células epiteliales gingivales. Interesantemente, la infección por P. gingivalis produce una mayor viabilidad celular, mediante la modulación de proteínas relacionadas con apoptosis. Se ha sugerido que la proteína inhibidora de la apoptosis, survivina, podría contribuir a la inhibición de la apoptosis mediada por P. gingivalis; sin embargo, su participación en este proceso no está completamente dilucidada. En esta memoria de título se estudió si P. gingivalis es capaz de modular los niveles de survivina en la línea celular de epitelio gingival OKF6/TERT2 y si esta modulación está relacionada con el grado de virulencia de la bacteria. Para ello, se infectaron células OKF6/TERT2 utilizando dos cepas de referencia y un aislado clínico, cada una con diferente virulencia. Luego, se determinaron los niveles de proteína y transcrito de survivina a tiempos tempranos y tardíos post-invasión, mediante Western blot y RT-PCR. Los resultados obtenidos indican que P. gingivalis es capaz de disminuir los niveles de survivina y que esta modulación podría estar relacionada con la virulencia de la bacteria. Sin embargo, la disminución de survivina no estaría relacionada directamente con la inhibición de apoptosis que genera la infección por P. gingivalis / Chronic periodontitis is an infectious disease characterized by an exacerbated inflammatory and immune response by the host, which causes the destruction of the tooth supporting tissues. Nowadays, it is assumed that for the onset of this pathology an ecological succession from a bacterial community associated to health, to one associated with periodontal disease is produced. In this succession, the presence of certain pathogens facilitate the remodeling of the oral microbiota and the consequent progression to disease, being Porphyromonas gingivalis a key pathogen in this process. P. gingivalis is a strict anaerobic bacterium capable of invading and persisting within gingival epithelial cells. Interestingly, infection by P. gingivalis produce an increase in the viability of these cells by modulation of apoptosis related proteins. It has been suggested that the apoptosis inhibitory protein, survivin, could contribute to the inhibition of apoptosis mediated by P. gingivalis; however, its participation in this process is still unknown. In this work, we studied whether P. gingivalis is capable of modulate survivin levels in gingival epithelial cells OKF6/TERT2 and if this modulation is related to bacterial virulence. To achieve this goals we infected OKF6/TERT2 cells with two reference strains and one clinical isolate, each with different virulence. Survivin protein and transcript levels were determined at early and late post-infection times by Western blot and RT-PCR. The results of this work indicated that P. gingivalis is capable of decreasing survivin levels and this modulation could be related to virulence features of the bacterium. Nevertheless, survivin decrease would not be directly related to the inhibition of apoptosis induced by P. gingivalis

Trabajo de Investigación Requisito para optar al Título de Cirujano Dentista / Autor no autoriza el acceso a texto completo de su tesis en el Portal de Tesis Electrónicas / INTRODUCCIÓN: Especies bacterianas anaeróbicas potencialmente patogénicas constituyen un porcentaje significativo de la microbiota normal de la cavidad bucal y hoy se sabe que su capacidad de colonizar y sobrevivir durante la niñez temprana, depende de las condiciones medioambientales que ofrezca el hospedero. Sin embargo, se desconoce la edad en que estas especies bacterianas comienzan a colonizar la cavidad bucal de los niños, como es el caso de Porphyromonas gingivalis, considerado uno de los periodontopatógenos más importantes. Esta especie posee múltiples factores de virulencia, entre los cuales se ha destacado la expresión de fimbrias, apéndices externos que juegan un rol determinante en la adhesión e invasión de los tejidos periodontales. Las fimbrias están constituidas por una subunidad proteica denominada fimbrilina (FimA), codificada por el gen fimA. Se han descrito 6 tipos de genes fimA en base a su secuencia de nucleótidos, codificando cada uno un tipo de fimbria diferente, las que se han asociado con distintos grados de salud y enfermedad periodontal. OBJETIVO: Investigar la presencia de Porphyromonas gingivalis, genotipos fimA-I, II, III y IV, en la microbiota bucal de niños de 4 a 8 años de edad. METODOLOGÍA: Se tomo muestras de hisopado de dorso lingual de 92 niños, de 4 a 8 años de edad, a quienes se les realizó un examen en búsqueda de signos clínicos de gingivitis y se distribuyeron según edad. La presencia de Porphyromonas gingivalis se investigó mediante cultivo microbiológico, pruebas bioquímicas y Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR). La detección de los genotipos fimA se llevó a cabo mediante PCR. RESULTADOS: Se detectó Porphyromonas gingivalis en el 11,95% de los niños (n=11), mediante cultivo y PCR, y 3 sujetos resultaron positivos a la presencia del genotipo fimA-IV de esta especie. Los 8 sujetos restantes no presentaron ninguno de los otros genotipos analizados en este estudio. CONCLUSIONES: Porphyromonas gingivalis puede ser miembro de la microbiota comensal de niños de 4 a 8 años de edad. La detección del genotipo fimA-IV podría indicar una colonización preferencial a edades tempranas por parte de este genotipo, lo que ameritaría una revisión en el tiempo, para evaluar su permanencia, reemplazo o asociación con la aparición de patologías periodontales

Trabajo de Investigación Requisito para optar al Título de Cirujano Dentista / Autor no autoriza el acceso a texto completo de su tesis en el Portal de Tesis Electrónicas / Introducción: Porphyromonas endodontalis es una especie de bacilos anaerobios, Gram-negativo, que ha sido fuertemente asociada a infecciones endodónticas, pudiendo ser encontrada en casos de necrosis pulpar, participando en la infección del sistema de canales radiculares (SCR) y en la periodontitis apical. Los estudios que describen la presencia de P. endodontalis en pacientes con Periodontitis Apical Asintomática (PAA) presentan grandes discrepancias respecto de la microbiota encontrada. El objetivo de este estudio es determinar la presencia de P. endodontalis en dientes con diagnóstico de PAA en un grupo de pacientes chilenos. Materiales y Métodos: La muestra del estudio se conformó por 53 pacientes con dientes unirradiculares sin tratamiento endodóntico previo, que presentaran el diagnóstico de PAA. Se tomaron muestras siguiendo el método de Shimauchi en condiciones de asepsia y con el diente aislado en forma absoluta. Las muestras fueron depositadas en viales con medio reducido de transporte (RTF) y llevadas al laboratorio para su procesamiento. Mediante la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) se detectó la presencia de P. endodontalis. Los datos fueron sometidos a un análisis descriptivo. La edad fue analizada con valores promedio y desviación estándar. Resultados: P. endodontalis fue detectada en un 41,5% (22 pacientes) de las muestras microbiológicas obtenidas de dientes diagnosticados con PAA. Conclusión: La detección realizada para P. endodontalis confirma que esta especie forma parte de la microbiota habitual en pacientes con PAA, con un 41,5% en la población estudiada.

Porphyromonas gingivalis is a keystone periodontopathogen and its lipopolysacharide (LPS) is strongly associated with periodontal disease. A long-standing controversy occurs on the role of P. gingivalis LPS in induction of innate host response in different cell types. It has recently been found that P. gingivalis LPS displays remarkable heterogeneity with both tetra- (LPS1435/1449) and penta-acylated (LPS1690) lipid A structures. However, the potential effects of heterogeneous structures of P. gingivalis LPS on modulating host innate responses in human gingival fibrobalsts (HGFs) - the most abundant cells in gingiva remain unclear. To fulfill this research gap, a comprehensive study on the P. gingivalis LPS-HGFs interations was undertaken. The effects of P. gingivalis LPS1435/1449 and LPS1690 on the expression profiles of pro-inflammatory cytokines were investigated (Chapter III). P. gingivalis LPS1690 (not LPS1435/1449) significantly upregulated the expression of IL-6, IL-8 and TNF-α, suggesting that P. gingivalis LPS may differentially modulate the expression of pro-inflammatory cytokines. The effects of P. gingivalis LPS on the expression of MMPs 1-3 and TIMP-1, and regulation of MMP-3 were then determined (Chapter IV). P. gingivalis LPS1690 markedly induced MMP-3 expression through p38 MAPK and ERK signal pathways, whereas TIMP-1 was greatly upregulated by P. gingivalis LPS1435/1449. These findings suggest that P. gingivalis LPS heterogeneity may differentially modulate the expression and regulation of MMP-3. Based on these findings, the involvements of TLR2/4 and the downstream signaling pathways were explored (Chapter V). P. gingivalis LPS1690 induced TLR4 expression, whereas TLR2 was upregulated by P. gingivalis LPS1435/1449. NF-κB pathway played a dominant role in P. gingivalis LPS1690-induced expression of IL-6 and IL-8. These findings suggest that the two isoforms of P. gingivalis LPS critically interact with TLR2 and TLR4, and may determine the subsequent activation of signal transduction cascades that differentially modulate immuno-inflammatory response. P. gingivalis could thereby evade innate host defense and contribute to periodontal pathogenesis. To obtain a holistic profile of heterogeneous P. gingivalis LPS-HGFs interactions, a systems biology-based study through proteomics, metabolomics and bioinformatics approaches was undertaken (Chapter VI). Pro-inflammatory proteins (e.g. Cyclophilin, Annexins, IL-6 and Cathepsins) were induced by P. gingivalis LPS1690. In contrast, anti-inflammatory proteins (e.g. ANXA1, ANXA2 and Gal-1) were upregulated by P. gingivalis LPS1435/1449. P. gingivalis LPS1690 also induced antioxidant defense molecules like MnSOD and PRDXs. Secretomic analysis showed that immuno-inflammatory mediators, extra-cellular proteases and matrix proteins were differentially modulated by the two isoforms of P. gingivalis LPS as well. These findings demonstrate that host responses such as immuno-inflammatory activity, oxidative stress and anti-oxidant defense may be differentially modulated and regulated by the heterogeneous P. gingivalis LPS. Further study shows that P. gingivalis LPS1435/1449 and LPS1690 differentially modulate oxidative stress response and antioxidant expression, and differential regulation of MnSOD could be a critical determinant of periodontal homeostasis (Chapter VII). The present findings may bring new insight into the molecular mechanisms of periodontal pathogenesis. Targeting the mechanisms of shift in lipid A structures of P. gingivalis LPS may be a potential strategy to develop novel approaches to control and prevent periodontal diseases. / published_or_final_version / Dentistry / Doctoral / Doctor of Philosophy

Trabajo de Investigación Requisito para optar al Título de Cirujano Dentista / Introducción: Las periodontitis son un conjunto de enfermedades infecciosas, caracterizadas por la destrucción de los tejidos de inserción de los dientes, cuya causa es el biofilm subgingival. Porphyromonas gingivalisy Aggregatibacter actinomycetemcomitansson bacterias periodonto-patógenas del biofilm subgingival que han sido ampliamente asociadas al inicio, progresión y severidad de la enfermedad.Sobre la base de la cápsula extracelular de P. gingivalis y del Opolisacárido del LPS de A. actinomycetemcomitans se han descrito distintos serotipos bacterianos, denominados K1-K6 y a-f, respectivamente. En distintas poblaciones afectadas de periodontitis, se ha establecido que los serotipos bacterianos más frecuentemente detectados son los serotipos K5 y K6de P. gingivalisy b-cde A. actinomycetemcomitans. En Chile no existen estudios que hayan analizado la frecuencia de detección de estos serotipos bacterianos. Objetivos: Cuantificar la frecuencia de detección de los distintos serotipos de P. gingivalis y A.actinomycetemcomitans en pacientes afectados de periodontitis crónica o periodontitis agresiva. Metodología:Muestras microbiológicas del biofilm subgingival fueron obtenidas de 25 sitios periodontales distintos en pacientes con periodontitis crónica o agresiva. La presencia de P. gingivaliso A. actinomycetemcomitans se estableció identificando las características de las colonias microbianas en cultivo en agar sangre hemina/menadiona o agar TSVB,pruebas bioquímicas de metanol o catalasay por identificación mediante PCR de la subunidad 16Sdel RNA ribosomal (rRNA). Purificados bacterianos fueron aislados y la caracterización del serotipo de P. gingivalis y de A. actinomycetemcomitans se realizó mediante PCR utilizando partidores específicos. Resultados:P. gingivalisfue identificado en el 40% de los pacientes afectados de periodontitis, tanto crónica como agresiva, y A. actinomycetemcomitans en un 16%. Cuando P. gingivalis fue detectado, el 60% fue serotipo K3 y el 50% K2 o K5. En el caso deA. actinomycetemcomitans, el 75% fue serotipo b y el 25% c. 6 Conclusión:En los pacientes con periodontitis existe una frecuencia variable de detección de los distintos serotipos bacterianos. En P. gingivalis los serotipos más frecuentemente detectados fueron el serotipo K3, K2y K5 y en A. actinomycetemcomitans el serotipo b.

Trabajo de Investigación Requisito para optar al Título de Cirujano Dentista / Introducción: La periodontitis apical asintomática (PAA) corresponde a una patología de etiología polimicrobiana que resulta en la destrucción del periodonto apical debido a una reacción inflamatoria crónica. Existe evidencia creciente de que infecciones crónicas en la cavidad oral pueden producir diseminación de productos bacterianos e inflamatorios a la circulación general y activación del sistema inmune con posible inducción de efectos sistémicos adversos. El potencial efecto sistémico asociado a PAA y en especial, a la infección endodóntica por Porphyromonas endodontalis y Porphyromonas gingivalis aún no ha sido investigado. El objetivo de este estudio fue determinar la respuesta inmune humoral y endotoxemia en pacientes con PAA en infección endodóntica con Porphyromonas endodontalis y Porphyromonas gingivalis versus pacientes controles sanos. Material y métodos: Se incluyeron 17 pacientes con diagnóstico de PAA de entre 18 a 34 años de edad, sin enfermedades o factores de riesgo de ECV y 24 controles sanos. Se tomaron muestras de suero a todos los pacientes del estudio y muestras de canales radiculares a los individuos con PAA. Se realizó identificación de aislados de P. endodontalis y P. gingivalis mediante cultivos bacterianos específicos, PCR y secuenciación. Se midió concentración de endotoxinas en suero mediante ensayo comercial Limulus Amebocyte Lysate y niveles de anticuerpos IgG e IgA contra las bacterias anteriormente mencionadas por ensayo ELISA multiserotipo. Los datos fueron analizados mediante el software stata v12. Se determinó significancia estadística con un p<0.05. Resultados: En pacientes con PAA se detectó P. gingivalis en el 11.76% y P. endodontalis en el 29.4% de las muestras. Se observó un aumento de niveles de LPS en suero de pacientes con PAA respecto a controles, pero esta diferencia no fue estadísticamente significativa. Se encontraron diferencias significativas en niveles de endotoxinas (p=0.002) y anticuerpos IgG (p=0.0047) en pacientes con PAA en los que se detectó P. endodontalis versus los que no presentaban la bacteria. Conclusiones: Las especies bacterianas P. endodontalis y P. gingivalis fueron identificadas en canales radiculares de individuos afectados por PAA. En pacientes con PAA existe una tendencia a presentar niveles séricos mayores de endotoxinas y anticuerpos IgG e IgA anti P. endodontalis y P. gingivalis versus individuos sanos, pero sin diferencias estadísticamente significativas. Existen niveles significativamente mayores de anticuerpos IgG anti P. endodontalis en pacientes con PAA con infección endodóntica por este patógeno versus pacientes con PAA en los que no se identificó la bacteria.

Trabajo de Investigación Requisito para optar al Título de Cirujano Dentista / La salud bucal de los niños con cardiopatías congénitas (CC) se encuentra en peor estado que la de niños sistémicamente sanos. La mayoría de estos pacientes con CC requiere cirugía a temprana edad, lo que implica que ingresen a pabellón después de un estricto tratamiento dental con el fin de minimizar el riesgo de complicaciones infecciosas de origen dentario, contar con información sobre la ocurrencia de patógenos bucales podría permitir un enfoque integral basado en la evidencia frente a este tipo de paciente. El objetivo de este estudio fue determinar la ocurrencia de P.gingivalis en el área subgingival de un grupo de cardiópatas y comparar con un grupo control sin enfermedades de base. Se tomó muestras subgingivales a 31 pacientes pediátricos con cardiopatías congénitas y 30 sin enfermedades sistémicas. Las muestras se obtuvieron del primer molar permanente o en su defecto del segundo molar temporal con conos de papel estériles y estas fueron depositadas en un medio de transporte RTF frío hasta su procesamiento en el laboratorio, para realizar cultivo y PCR. Se determinó la presencia de P.gingivalis mediante cultivo microbiológico clásico y PCR, así como el porcentaje del microorganismo en la microbiota total cultivable. Los datos se procesaron mediante Chi cuadrado y Wilcoxon rank- sum. En relación a la presencia de Pg en cardiópatas versus el grupo control sano no hubo diferencias significativas (p> 0,05).Al comparar el porcentaje de Pg en relación a la microbiota total cultivable estas diferencias fueron estadísticamente significativas para ambos grupos (p< 0,05). Se puede concluir que los niños con cardiopatías congénitas estudiados en este trabajo presentan mayor porcentaje de P. gingivalis en relación a MBT en su boca comparados con control sin cardiopatía.

Thesis (Ph.D.) -- University of Adelaide, Dental School, 2003. / "December, 2002" Includes bibliographical references (leaves 211-238).

Thesis (Ph. D.)--University of Washington, 1998. / eContent provider-neutral record in process. Description based on print version record. Includes bibliographical references.

Thesis (Ph. D.)--University of Washington, 1998. / Includes bibliographical references.