L’adaptation des cellules à leur environnement externe repose sur la transduction adéquate de signaux régulés par une pléthore d'événements moléculaires. Parmi ces événements moléculaires, les modifications post-traductionnelles (MPT) de protéines aident à intégrer, à traduire et à organiser de façon spatiotemporelle ces signaux pour que les cellules puissent réagir aux stimuli externes. Parmi les modifications post-traductionnelles, les petites protéines de la famille de l’Ubiquitine (Ublps, Ubiquitin-like proteins) jouent un rôle majeur dans presque toutes les voies de signalisation. Cette thèse rapporte des études fonctionnelles et structurales des interactions covalentes et non covalentes entre SUMO (Small Ubiquitin related MOdifier), un membre de la famille des Ublps, et trois protéines d'échafaudage, TIF1beta, le corépresseur universel des protéines KRAB-multidoigt de zinc, PIAS1, une ligase E3 pour SUMO et PML, un suppresseur de tumeur. La première étude rapporte l'identification et la caractérisation biochimique des sites de SUMOylation de TIF1beta. Nous avons déterminé que la modification covalente de six résidus lysine par SUMO est essentielle à l’activité de répression de la transcription induit par TIF1beta. En outre, nous présentons des évidences indiquant que la SUMOylation de TIF1 exige non seulement sa capacité à homo-oligomériser, mais est aussi positivement régulée par son interaction avec le domaine KRAB des protéines à doigts de zinc. Partant de ce constat, nous postulons que les protéines KRAB-multidoigt de zinc recrutent leur corépresseur TIF1betaà des gènes cibles, mais aussi accentuent son activité répressive grâce à l'augmentation de sa SUMOylation. Notre seconde étude révèle qu’en plus de réprimer la transcription en tant que MPT covalente, SUMO joue aussi un rôle important dans la répression en tant que partenaire non covalent d’interactions protéine-protéine. Nous avons montré que SUMO interagit simultanément avec deux enzymes de la machinerie de SUMOylation, l’unique enzyme de conjugaison E2, UBC9, et la ligase E3 PIAS1 au sein d’un complexe ternaire répresseur. En outre, nous révélons que la formation du complexe ternaire PIAS1:SUMO:UBC9 est modulée par le niveau de phosphorylation de résidus sérine juxtaposés à un motif d’interaction avec SUMO (SIM) dans PIAS1. Ainsi, SUMO agit comme un adaptateur spécifique qui stabilise les interactions UBC9 E2: E3 PIAS1. Partant de ce constat, nous proposons que les enzymes E2 et E3 des autres systèmes Ublps exploitent des mécanismes similaires dans le cadre de leur fonction Enfin, notre troisième étude explore la régulation des interactions non covalentes de SUMO par la phosphorylation. En utilisant une combinaison d'études in vivo et in vitro, nous démontrons que l'interaction entre SUMO1 et PML est régi par la phosphorylation dépendant de CK2 sur quatre résidus sérine de PML. Les structures cristallographiques des complexes PML-SIM:SUMO1 révèlent que les phospho-sérines de PML contactent des résidus de la région basique de SUMO1. Sachant que la kinase CK2 peut être induite par des kinases activables par le stress, ces résultats suggèrent que les interactions non-covalentes avec SUMO sont modulées par le stress cellulaire. Sur la base de cette constatation, nous postulons que des événements analogues affectent des protéines contenant des séquences SIM ciblées par CK2. En résumé, cette étude révèle qu’en plus de son rôle de MPT, SUMO peut fonctionner comme un adaptateur permettant des interactions spécifiques entre protéines tel que pour les enzymes E3 et E2. / Cell adaption to the external environment relies on proper signal transduction that is orchestrated by a plethora of molecular events. Among these molecular events, post-translational modifications (PTMs) of proteins help to spatiotemporally integrate, translate and dispatch signals so cells can respond to external stimuli. Among these post-translational modifications, the Ubiquitin-like proteins (Ublps) play a major role in almost all signaling pathways. This thesis reports functional and structural studies of the covalent and non-covalent interactions between the Small Ubiquitin-related MOdifier (SUMO), a member of the Ublps family, and three scaffold proteins, TIF1beta, the corepressor of KRAB-Multifinger proteins, PIAS1, a SUMO E3 ligase and the Promyleocytic leukemia (PML) tumor suppressor protein. The first study reports the identification and the biochemical characterization of TIF1betaSUMOylation sites. We mapped six SUMOylation sites in TIF1beta and determined that the covalent modification of these sites by SUMO is essential for its transcriptional repression activity. In addition, we present evidence indicating that SUMOylation of TIF1beta requires not only its ability to homo-oligomerize, but is positively regulated through its interaction with KRAB domains found in zinc-finger proteins. Based on this finding, we postulate that these KRAB domain containing multifinger proteins not only recruit TIF1beta co-repressor to target genes but also increase its repressive activity through enhancement of its SUMOylation. The work in the second study reveals that in addition to suppressing transcription as a covalent PTM, SUMO plays an important role in repression as a non-covalent protein-protein interaction partner. We determine that SUMO can form a repressive complex by simultaneously forming non-covalent interactions with UBC9 and PIAS1, the E2 and E3 enzymes in the SUMOylation system. In addition, we report that the formation of the PIAS1:SUMO:UBC9 ternary complex is modulated by the phosphorylation of serine residues juxtaposed to a SUMO-Interacting Motif (SIM) found in PIAS1. Thus SUMO acts as a specific adaptor that stabilizes UBC9 E2: PIAS1 E3 interactions. Based on this finding, we propose that the E2 and E3 enzymes from other Ublps systems exploit similar mechanisms as part of their function Finally, our third study explores the regulation of SUMO non-covalent interactions by phosphorylation. Using a combination of in vivo and in vitro studies we demonstrate that the interaction between SUMO1 and PML is governed by CK2-dependent phosphorylation of four serine residues in PML. Crystal structures of PML-SIM:SUMO1 complexes reveal that these PML phospho-serine specifically contact SUMO1 basic patch residues. Since CK2 kinase is induced by stress activated kinases pathways, this indicates that SUMO non-covalent interactions are regulated by cellular stress. Based on this finding, we postulated that analogous events influence other CK2-targeted SIM-containing proteins. In summary, this study reveals that in addition to its well described function as PTM, SUMO can function as an adaptor enabling specific proteins interactions such as functional E3:E2 enzymes pairs.

Les anticorps monoclonaux (mAbs) sont des glycoprotéines complexes possédant de nombreuses micro-hétérogénéités qui peuvent influencer leur efficacité dans l’organisme. Il est par conséquent nécessaire de développer des méthodes analytiques robustes, sensibles et spécifiques pour les caractériser avec la plus grande précision. L’objectif de cette thèse a été de développer des méthodes analytiques permettant la caractérisation fine et à différents niveaux d’un anticorps monoclonal, le cetuximab, ainsi qu’un anticorps monoclonal conjugués à un principe actif, le brentuximab vedotin, sur des couplages direct ou indirect de l’électrophorèse capillaire et la spectrométrie de masse. Dans une première partie, une approche middle-up protéomique du cetuximab a été réalisé sur le couplage indirect CZE-UV/MALDI-MS afin de séparer et caractériser les variants de charges du fragment F/2 et F(ab)’2 ainsi que la caractérisation top-down des fragments Fc/2. Ensuite une nouvelle stratégie indirecte CZE-UV/nanoESI-MS a été développée pour permettre la caractérisation fine de ce mAbs partiellement digéré. Enfin un couplage direct par CESI-MS a été développé pour permettre l’analyse rapide et précise du cetuximab middle-up. Dans une deuxième partie, la combinaison d’analyse de mAbs d’intact, middle-up et bottom-up protéomique a été réalisée sur le couplage CZE-UV/nanoESI-MS et CESI-MS. Cela a permis la caractérisation à différent niveau du brentuximab vedotin. Cette méthodologie a permis l’analyse du DAR, l’identification de fragments conjugués, la caractérisation simultanée de la séquence complète de l’anticorps, d’un grand nombre de modifications post-traductionnelles, la caractérisation des peptides conjugués ainsi que l’identification d’ions diagnostiques du principe actif. / Monoclonal antibodies (mAbs) are highly complex glycoproteins having a lot of micro-heterogeneities which can influence their effectiveness. As a consequence, it is necessary to develop robust analytical methods, sensitive and specific to characterize them with high accuracy. The purpose of this thesis was to develop analytical methods allowing the multi-level characterization of monoclonal antibody (cetuximab), and antibody drug conjugates (brentuximab vedotin), using on-online or off-line capillary electrophoresis – mass spectrometry coupling. In the first section, a middle-up proteomic approach of cetuximab was carried out using Off-line CZE-UV/MALDI-MS coupling to separate and to characterize Fc/2 and F(ab)’2 charge variants. A top-down characterization of Fc/2 fragments was also employed. Then a new strategy off-line CZE-UV/nanoESI-MS was used to allow the characterization of this partially digest mAbs. Finally, an online coupling by CESI-MS was developed to allow the fast and accurate analysis of middle-up cetuximab. In a second part, the combination of intact, middle-up and bottom-up proteomic carried out on CZE-UV/nanoESI-MS and CESI coupling allowed the most exhaustive characterization of brentuximab vedotin. This methodology allowed the analyze of DAR, the identification of fragments drug conjugates, the simultaneous characterization of the complete structure of antibody, a significant number of post-translational modifications, all peptides drug conjugates and the identification of diagnostic ions.

Le ribosome est responsable de la traduction des ARNm en protéines. Au sein du ribosome, les ARNr jouent un rôle central dans la traduction, et leurs modifications post-transcriptionnelles moduleraient l'activité traductionnelle du ribosome, impactant ainsi sur l'expression génique. Les ARNr humains contiennent 106 2'-O-méthylations, ajoutées par la fibrillarine (FBL). FBL fonctionne au sein d'un complexe snoRNP contenant les protéines Nop56, Nop58, 15.5kDa et un petit ARN nucléolaire (snoARN) à boîte C/D. La régulation de l'activité de la FBL et du complexe snoRNP à boîte C/D ne sont pas connus. Ce travail a exploité des données structurales de FBL et du complexe de méthylation pour construire un modèle permettant d'explorer les relations ses structure-fonction. L'impact de l'acétylation de FBL a également été exploré. Le 5-fluorouracile (5-FU) est un analogue de l'uracile, dont la cytotoxicité dépend de son altération du métabolisme des ARNr. Le 5-FU inhibe la maturation des ARNr et altère la localisation de plusieurs facteurs nucléolaires, dont FBL. Ce travail montre que le 5-FU induit une nouvelle acétylation de FBL en position K292. De plus, le 5-FU réduit l'association de FBL avec les membres protéiques du complexe de méthylation, et induit une baisse globale de ses interactions. De plus, ce travail propose un rôle nouveau de la déacétylase SIRT7 et de l'acétyltransférase CBP sur le complexe de méthylation. Ces enzymes semblent aussi participer aux dérégulations du complexe de méthylation induites par le 5-FU. L'ensemble de ces résultats supportent l'implication des modifications post-traductionnelles dans la régulation du complexe de méthylation des ARNr / The ribosome is responsible for the translation of mRNA into proteins. Within the ribosome, rRNAs play a crucial role in translation, and their post-transcriptional modifications regulate the ribosome’s translational activity and impact on gene expression. The human ribosome contains 106 2’-O-methylations added by fibrillarin (FBL). FBL functions through a box C/D snoRNP complex consisting of Nop56, Nop58 and 15.5kDa along with a box C/D small nucleolar RNA (snoRNA). The regulation of FBL ad the C/D box snoRNP complexe are unknown. This work exploitated strtuctural data on FBL and the methylation complex to build a model allowing the extrapolation of structure-function relationships. The impact of FBL acetylation was also investigated. 5-FU is a uracile analog, and its cytotoxicity depends mostly on its alteration of RNA metabolism. As such, 5-FU inhibits rRNA maturation and alters the localization of nucleolar factors such as FBL. 5-FU induced a novel FBL acetylation at position K292, decreased FBL interaction with the methylation complex proteins, and induced a large scale inhibition of its interactions. This discovered a new role of the deacetylase and the acetyltransferase CBP on snoRNP integrity. Moreover, this work suggests that these enzyme participate in the 5-FU-induced alteration of snoRNP. s. This work supports the involvement of post-translational modifications in the regulation of the rRNA C/D box snoRNP 2’-O-methylation complex

Embryonic stem cells (ESCs) are characterized by their unlimited capacity for self-renewal and the ability to contribute to every lineage of the developing embryo. The promoters of developmentally regulated loci within these cells are marked by coincident epigenetic modifications of gene activation and repression, termed bivalent domains. Trithorax group (TrxG) and Polycomb Group (PcG) proteins respectively place these epigenetic marks on chromatin and extensively colocalize with Oct4 in ESCs. Although it appears that these cells are poised and ready for differentiation, the switch that permits this transition is critically held in check. The derepression of bivalent domains upon knockdown of Oct4 or PcG underscores their respective roles in maintaining the pluripotent state through epigenetic regulation of chromatin structure. The mechanisms that facilitate the recruitment and retention of Oct4, TrxG, and PcG proteins at developmentally regulated loci to maintain the pluripotent state, however, remain unknown. Oct4 may function as either a transcriptional activator or repressor. Prevailing thought holds that both of these activities are required to maintain the pluripotent state through activation of genes implicated in pluripotency and cell-cycle control with concomitant repression of genes required for differentiation and lineage-specific differentiation. More recent evidence however, suggests that the activator function of Oct4 may play a more critical role in maintaining the pluripotent state (Hammachi et al., 2012). The purpose of the studies described in this dissertation was to clarify the underlying mechanisms by which Oct4 functions in transcriptional activation and repression. By so doing, we wished to contextualize its role in pluripotent cells, and to provide insight into how changes in Oct4 function might account for its ability to facilitate cell fate transitions. As a result of our studies we find that Oct4 function is dependent upon post-translational modifications (PTMs). We find through a combination of experimental approaches, including genome-wide microarray analysis, bioinformatics, chromatin immunoprecipitation, functional molecular, and biochemical analyses, that in the pluripotent state Oct4, Akt, and Hmgb2 participate in a regulatory feedback loop. Akt-mediated phosphorylation of Oct4 facilitates interaction with PcG recruiter Hmgb2. Consequently, Hmgb2 functions as a context dependent modulator of Akt and Oct4 function, promoting transcriptional poise at Oct4 bound loci. Sumoylation of Oct4 is then required to maintain Hmgb2 enrichment at repressed loci and to transmit the H3K27me3 mark in daughter progeny. The expression of Oct4 phosphorylation mutants however, leads to Akt inactivation and initiates the DNA Damage Checkpoint response. Our results suggest that this may subsequently facilitate chromatin reorganization and cell fate transitions. In summary, our results suggest that controlled modulation of Oct4, Akt, and Hmgb2 function is required to maintain pluripotency and for the faithful induction of transcriptional programs required for lineage specific differentiation.

Les proprotéines convertases (PCs) sont responsables de la maturation de plusieurs protéines précurseurs et sont impliquées dans divers processus biologiques importants. Durant les 30 dernières années, plusieurs études sur les PCs se sont traduites en succès cliniques, toutefois les fonctions spécifiques de PC7 demeurent obscures. Afin de comprendre PC7 et d’identifier de nouveaux substrats, nous avons généré une analyse protéomique des protéines sécrétées dans les cellules HuH7. Cette analyse nous a permis d’identifier deux protéines transmembranaires de fonctions inconnues: CASC4 et GPP130/GOLIM4. Au cours de cette thèse, nous nous sommes aussi intéressé au rôle de PC7 dans les troubles comportementaux, grâce à un substrat connu, BDNF. Dans le chapitre premier, je présenterai une revue de la littérature portant entre autres sur les PCs. Dans le chapitre II, l’étude de CASC4 nous a permis de démontrer que cette protéine est clivée au site KR66↓NS par PC7 et Furin dans des compartiments cellulaires acides. Comme CASC4 a été rapporté dans des études de cancer du sein, nous avons généré des cellules MDA-MB-231 exprimant CASC4 de type sauvage et avons démontré une diminution significative de la migration et de l’invasion cellulaire. Ce phénotype est causé notamment par une augmentation du nombre de complexes d’adhésion focale et peut être contrecarré par la surexpression d’une protéine CASC4 mutante ayant un site de clivage optimale par PC7/Furin ou encore en exprimant une protéine contenant uniquement le domaine clivé N-terminal. Finalement, des résultats provenant de base de données de patients atteint de cancer du sein ont démontrés que l’expression élevé des gènes CASC4 et PCSK7 corrélaient à un mauvais prognostique, tandis qu’une expression élevée de CASC4 mais faible de PCSK7 était associée un meilleur prognostique. Dans le chapitre III, nous avons démontré que GPP130 est aussi clivé par PC7 et Furin mais au niveau des motifs H67RSRLEK73↓SL et K274PTR277↓EV dans les endosomes/TGN ou à la membrane plasmique. Récemment, GPP130 a été rapporté comme étant impliqué dans la prolifération cellulaire de cancers de la tête et du cou. Nos analyses provenant de la banque de données cBioPortal ont montré que le gène GPP130/GOLIM4 était surexprimé dans 35% des cas de cancer du poumon. Nous avons aussi montré qu’une réduction de GPP130 dans les cellules de cancer de poumon A549 augmente légèrement la prolifération cellulaire. Nous étudions actuellement l’hypothèse que GPP130 transporterait des cargos qui pourraient influencer la prolifération cellulaire. Finalement, durant le chapitre IV de cette thèse, nous avons poursuivi les études comportementales chez les souris PC7 KO afin d’investiguer si ces souris seraient protégées d’un effet anxiogène causé par l’obésité induite par l’alimentation. Nous avons montré que les souris PC7 KO ont une tendance à être moins affectées par la diète riche en gras saturé. Nous avons aussi montré que les souris PC7 ont une réponse déficiente face au stress. En conclusion, nos travaux de recherche ont permis d’identifier de nouveaux substrats de PC7 afin de mieux comprendre son rôle biologique, / The proprotein convertases (PCs) are responsible for the maturation of precursor proteins and are involved in multiple biological processes. Over the past 30 years, the PCs have had great translational achievements, but the physiological roles of PC7, the seventh member of the family, are still obscure. Searching for new PC7 substrates, a quantitative proteomics screen for selective enrichment of N-glycosylated polypeptides secreted from hepatic HuH7 cells identified two type-II transmembrane-proteins of unknown function(s): Cancer Susceptibility Candidate 4 (CASC4) and Golgi Phosphoprotein of 130 kDa (GPP130/GOLIM4). The chapters II and III of this thesis will focus on the investigation of CASC4 and GPP130 shedding by PC7 and Furin, and their corresponding physiological functions. In chapter IV we pursued the PC7 KO mice behavior phenotyping. Concentrating on CASC4 in chapter II, its mutagenesis characterized the PC7/Furin-shedding site to occur at KR66↓NS, in HEK293 cells. We further defined PC7 and Furin activity and demonstrated that CASC4 shedding occurs in acidic endosomes and/or trans-Golgi Network. Since CASC4 has been reported in breast cancer studies, we generated MDA-MB-231 cells stably expressing CASC4 WT and we showed a significant reduction of migration and invasion, caused by an increased number of paxillin-positive focal adhesions. This phenotype was reversed in cells overexpressing an optimally PC7/Furin-cleaved CASC4 mutant, or upon overexpression of CASC4 N-terminal domain. In accord, breast cancer patients’ datasets show that high CASC4 and PCSK7 expression levels predict a significantly worse prognosis compared to high CASC4 but low PCSK7 levels. In chapter III, we demonstrated that GPP130 is also cleaved by PC7 and Furin at similar and distinct motifs (H67RSRLEK73↓SL and K274PTR277↓EV) within acidic endosomes or at the TGN. GPP130 is predicted to be trafficking cargos and is responsible for the binding and retrograde trafficking of the Shiga toxin. In addition, GPP130 was recently reported to be implicated in cell proliferation in head and neck cancer cells. Our analysis from cBioPortal for Cancer Genomics has shown that the GPP130/GOLIM4 gene is amplified in up to 35% of the patients with lung cancer. During this chapter we also showed that GPP130 knockdown in A549 cells slightly increases cell proliferation. We are currently investigating that GPP130 transports important cargos that would influence cell proliferation. Finally, during the chapter IV of this thesis we have pursued the characterization of the PC7 KO mice anxiolytic phenotype that was previously described, and we investigated a possible protection from diet-induced obesity anxiety-like behavior. Interestingly, we have shown that the PC7 KO mice have a tendency to be less affected by the saturated high-fat anxiogenic diet. Also, we showed that the PC7 KO mice have an impaired stress-coping response that will need further investigations. In conclusion, we identified new PC7 substrates to better understand its biology but we also investigated more deeply known substrates, such as BDNF in the PC7 KO mice to fully grasp the physiological functions of this enigmatic proprotein convertase.

La localisation de l'ARNm est un mécanisme post-transcriptionnel régulant l'expression des gènes qui donne un contrôle précis sur la production spatiale et temporelle des protéines. Des milliers de transcrits dans un large éventail d'organismes ou de types cellulaires se sont avérés localisés dans un compartiment sous-cellulaire spécifique. La levure bourgeonnante Saccharomyces cerevisiae est l'un des organismes modèle les plus étudiés pour comprendre le processus de localisation de l'ARNm. Plus de trente ARNm sont activement transportés et localisés à l'extrémité du bourgeon de la levure bourgeonnante. Dans cet organisme, la localisation des transcrits à l'extrémité du bourgeon, tels que l'ARNm ASH1, dépend de la protéine de liaison à l'ARN She2, qui interagit directement avec les éléments de localisation dans ces ARNm durant leur transcription. She2 est une protéine liant l’ARN non-canonique, qui s’assemble en tétramère pour pouvoir lier l’ARN. Lorsque le complexe ARNm-She2 est exporté vers le cytoplasme, celui-ci interagit avec la protéine She3 et la myosine Myo4, qui transportent le complexe vers le bourgeon. Une fois qu'un ARNm est correctement localisé, sa traduction est activée pour permettre la synthèse locale de sa protéine. Les mécanismes régulant la localisation des ARNm sont encore très peu connus. Cependant, plusieurs évidences suggèrent que la machinerie de localisation peut être régulée par des modifications post-traductionnelles. Dans notre étude, en utilisant une colonne de purification de phosphoprotéines, nous avons constaté que She2 est une phosphoprotéine. Nous avons utilisé une approche de phosphoprotéomique pour identifier les résidus phosphorylés dans She2 in vivo. Nous avons identifié plusieurs nouveaux phosphosites qui affectent la capacité de She2 à favoriser l'accumulation asymétrique de la protéine Ash1. Fait intéressant, plusieurs phosphosites sont présents aux interfaces de dimérisation et de tétramérisation de She2. En nous concentrant sur la position T109, nous montrons qu'un mutant phosphomimétique T109D inhibe l'interaction She2-She2 et diminue l'interaction de She2 avec ses cofacteurs Srp1, She3 et l’ARNm ASH1. Fait intéressant, la mutation T109D réduit considérablement l'expression de She2 et perturbe la localisation de l'ARNm ASH1. Nos résultats montrent que le contrôle de l'oligomérisation de She2 par phosphorylation représente un mécanisme qui régule la localisation de l'ARNm dans la levure bourgeonnante. Dans le but d’identifier la ou les kinases impliquées dans la phosphorylation de She2, nous avons recherché des motifs de reconnaissance de kinases connues parmi les phosphosites que nous avons identifiés. Nous avons trouvé que les résidus T109, S217 et S224 font partie de sites putatifs de la Caséine kinase II (CKII), suggérant que ces positions seraient susceptibles d'être phosphorylés par cette kinase. Un essai de phosphorylation in vitro a révélé que She2 est phosphorylée par CKII au niveau des résidus S217 et S224, mais pas au résidu T109. Nous avons montré que la phosphorylation de la forme monomérique de She2 par CKII in vitro est augmentée par rapport à la forme sauvage tétramérique. De plus, nous avons observé que le domaine C-terminal de She2, qui contient sa séquence de localisation nucléaire (NLS) est phosphorylé par CKII. Cependant, le rôle de la phosphorylation dans le NLS de She2 demeure inconnu. Dans l'ensemble, nos résultats montrent que les modifications post-traductionnelles sur She2 régulent la localisation de l'ARNm chez la levure. Cette étude permettra d'élucider les mécanismes de contrôle de la localisation de l'ARNm chez la levure et comment des modifications post-traductionnelles sur She2 régulent ce processus. / mRNA localization is a post-transcriptional mechanism regulating gene expression that gives precise control over the spatial and temporal production of proteins. Thousands of transcripts in a wide array of organisms or cell types were shown to localize to specific subcellular compartments. The budding yeast Saccharomyces cerevisiae serves as one of the best model organisms to study the mechanisms of mRNA localization. Over thirty transcripts are actively transported and localized at the bud tip of the budding yeast. In this organism, localization of transcripts to the bud tip, such as the ASH1 mRNA, depends on the RNA-binding protein She2, which is responsible for recognizing localization elements in these mRNAs during transcription. She2 is a non-canonical RNA-binding protein which assembles as a tetramer in order to bind RNA. When the mRNA-She2 complex is exported to the cytoplasm, the protein She3 and myosin Myo4 join the complex to transport it to the bud. Once an mRNA is properly localized, its translation is generally activated to allow the local synthesis of its protein. The mechanisms regulating the localization of mRNAs are still poorly known. Still, several pieces of evidence suggest that post-translational modifications may regulate the localization machinery. Using a phosphoprotein purification column, we found that She2 is a phosphoprotein. We used a phosphoproteomic analysis to identify the phosphorylated residues in She2 in vivo. We identified several new phosphosites that impact the capacity of She2 to promote the asymmetric accumulation of Ash1. Interestingly, several of these phosphosites are present at the dimerization and tetramerization interfaces of She2. Focusing on T109, we show that a phosphomimetic mutant T109D inhibits She2-She2 interaction and decreases the interaction of She2 with its co-interactors Srp1, She3 and ASH1 mRNA. Interestingly, the T109D mutation significantly reduces the expression of She2 and disrupts ASH1 mRNA localization. Altogether, our results show that the control of She2 oligomerization by phosphorylation represents a mechanism that regulates mRNA localization in budding yeast. In order to identify which kinase(s) are involved in She2 phosphorylation, we searched for known kinases recognition motifs among the identified phosphosites. We found that T109, S217 and S224 are putative Casein kinase II (CKII) sites, suggesting that this kinase may phosphorylate these residues. Indeed, an in vitro phosphorylation assay revealed that She2 is phosphorylated by CKII at S217 and S224 but not at T109. We found that the phosphorylation of a monomeric She2 mutant by CKII in vitro is increased compared to the wild-type tetrameric protein. Furthermore, we found that the C-terminal domain of She2, which contains its nuclear localization signal (NLS), is phosphorylated by CKII. However, the biological function of the phosphorylation in the NLS is still unknown. Altogether, our results show that post-translational modifications in She2 regulate mRNA localization in yeast. This study will help elucidate the mechanisms that control mRNA localization in yeast and how post-translational modifications in She2 regulate this process.

Les récepteurs couplés aux protéines G (RCPG) constituent la plus grande famille de récepteurs à domaines transmembranaires et sont impliqués dans divers processus biologiques, ce qui en fait une cible privilégiée pour le développement de médicaments. Parmi les protéines qui régulent la signalisation des RCPG, les β-arrestines sont impliquées dans plusieurs fonctions canoniques telles que la désensibilisation, l'internalisation et le trafic des récepteurs. En outre, la β-arrestine accomplit aussi des fonctions non-canoniques en agissant comme un échafaudage pour des complexes de signalisation notamment pour la voie MAPK et ainsi favorise certaines voies de signalisation intracellulaire. La présente thèse visait à explorer des fonctions non-canoniques et de nouveaux mécanismes possibles de régulation de la β-arrestine induite par l'activation des RCPG. Le premier projet visait à mettre en évidence le mécanisme de trafic des protéines G de la membrane plasmique vers les endosomes et le rôle que joue la β-arrestine dans ce processus. Nous avons montré que la sous-unité Gαs se dissocie de la membrane plasmique indépendamment de la β-arrestine après l'activation des récepteurs, alors que le dimère Gβγ nécessite la présence de la β-arrestine. Nous avons également mis en évidence la formation d'un complexe composé du récepteur V2 de la vasopressine, de la β-arrestine et de l'hétérodimère Gβγ et que ce complexe est crucial pour la translocation des protéines G vers les endosomes. Cette étude met en évidence le rôle de la β-arrestine dans le trafic endosomal des protéines G et établit les bases pour expliquer sa contribution dans la médiation de la signalisation soutenue des protéines G dans les endosomes. Le second projet avait pour objectif d'explorer le rôle de l'ubiquitination du récepteur du glucagon (GCGR) sur sa signalisation et les fonctions de la β-arrestine. Nous avons montré que l'état d'ubiquitination de ce récepteur cause un biais de signalisation, car le GCGR déubiquitiné présente une diminution du couplage et de l'activité des protéines G alors que la liaison à la β-arrestine est augmentée. Ceci contribue à l’activation de la voie de signalisation MAPK p38 de manière dépendante de la β-arrestine 1. Nous avons également montré que le biais en faveur de la β-arrestine ne réduit pas la sécrétion d'insuline médiée par le GCGR dans les cellules β pancréatiques. Cette étude suggère que la sécrétion d’insuline dépendante du GCGR implique à la fois une signalisation dépendante des protéines G, mais aussi de la β-arrestine. Le statut d'ubiquitination du GCGR oriente la signalisation du récepteur par différents effecteurs pour réguler la sécrétion d'insuline et l'homéostasie du glucose. Le troisième projet visait à identifier de nouveaux interacteurs des β-arrestines 1/2 et à caractériser le rôle de ces interactions dans le contexte de la signalisation des RCPG. Nous avons identifié plus de 100 nouveaux interacteurs potentiels des β-arrestines 1/2 en utilisant l'approche protéomique BioID. Nous avons confirmé l'interaction de l'enzyme atypique de conjugaison de l'ubiquitine UBE2O avec les β-arrestines. Nous avons également montré que UBE2O module le trafic des β-arrestines entre la membrane plasmique et les endosomes. Cette étude ouvre de nouvelles voies pour explorer des fonctions potentielles des β-arrestines médiées par leurs liaisons à des interacteurs jusqu'alors non identifiés. Les résultats compilés dans cette thèse permettent de dresser un tableau plus étendu des mécanismes régulant les fonctions de la β-arrestine ainsi que de nouveaux rôles potentiels que cette protéine joue dans la signalisation des RCPG. La caractérisation des fonctions non-canoniques et des mécanismes de régulation de la β-arrestine est une avenue prometteuse qui pourrait mener au développement de thérapies ciblant les RCPG. / G protein-coupled receptors (GPCRs) are the largest family of transmembrane receptors and are involved in various biological processes, making them an interesting target for drug discovery. GPCR signaling is regulated by various proteins, including the β-arrestin family that mediate various canonical functions such as receptor desensitization, internalization, and trafficking. β-arrestin also fulfills certain non-canonical roles and has been shown to trigger intracellular signaling by acting as a scaffold for signaling complexes such as for the MAPK pathway. The present thesis aimed to explore non-canonical functions and possible novel mechanism of regulation of β-arrestin following GPCR activation. The objective of the first project was to uncover G protein trafficking mechanism from the plasma membrane to the endosomes and the role that β-arrestin plays in this process. We showed that the Gαs subunit dissociates from the plasma membrane independently of β-arrestin after receptor activation while the Gβγ dimer requires β-arrestin for its trafficking. We also revealed the formation of a complex composed of the vasopressin V2 receptor, β-arrestin, and the Gβγ heterodimer and that this complex is critical for G protein translocation to the endosomes. This study highlights the role of β-arrestin in Gβγ trafficking and lays the basis for explaining the role of β-arrestin in mediating sustained endosomal G protein signaling. The aim of the second project was to explore the role of the glucagon receptor (GCGR) ubiquitination on signaling and β-arrestin functions. We showed that the ubiquitination state of the receptor controls signaling bias as a deubiquitinated GCGR exhibits decreased G protein coupling and activity while β-arrestin binding is enhanced. Deubiquitinated GCGR signaling is also redirected to a β-arrestin 1-dependent p38 MAPK pathway. We also revealed that this β-arrestin bias does not reduce GCGR-mediated insulin secretion in pancreatic β-cells. This study suggests that GCGR-dependent insulin secretion involves both G-protein and β-arrestin-dependent signaling. The ubiquitination status of GCGR directs signaling through different effectors to regulate insulin secretion and glucose homeostasis. The third project aimed to identify novel interactors of β-arrestin 1/2 and characterize the role of these interactions in the context of GPCR signaling. We identified over 100 new β-arrestin 1/2 potential interactions using the BioID proteomic approach. We confirmed the interaction of the atypical ubiquitin conjugating enzyme UBE2O with β-arrestin by co-immunoprecipitation and by BRET. We also showed that UBE2O modulates β-arrestin trafficking between the plasma membrane and early endosomes. The results of this study open new avenues to explore novel functions and regulation mechanisms of β-arrestin mediated by their interactions with previously unidentified interactors. The findings compiled in this thesis shed light on a broader picture of the mechanisms regulating β-arrestin functions, as well as the potential novel roles this protein plays in GPCR signaling. The characterization of non-canonical functions and regulatory mechanisms of β-arrestin is an exciting avenue that could be important in the development of future therapies targeting GPCRs.

Le cancer du poumon est la principale cause de mortalité par cancer au Canada et entraîne un taux de mortalité important chez les patients. En effet, l’Organisation Mondiale de la Santé (OMS) indique que le cancer du poumon est la principale cause de décès liés au cancer dans le monde, avec 2.21 millions de diagnostics par année qui conduisent en moyenne à 1.8 millions de décès par an. Initialement asymptomatique, ce cancer évolue rapidement, devenant très invasif et métastatique, et est alors responsable de plus de morts par an que ces quatre cancers meurtriers combinés : côlon, sein, prostate et pancréas. Les Proprotéines Convertases (PCs) sont une famille de 9 sérines protéases qui jouent un rôle dans la maturation des précurseurs de protéines. Les PCs activent/désactivent ces précurseurs en les clivant à un unique ou une paire de résidus d’acides aminés et sont ainsi essentiels pour divers processus biologiques, tels que l’activation de facteurs de croissance qui jouent un rôle vital dans la transformation cellulaire et les risques de formation de tumeurs. Parmi les neufs membres des sérines protéases identifiées, les rôles physiologiques du septième membre de la famille, PC7, restent encore largement méconnus à ce jour. Afin d'identifier davantage de substrats de PC7, un criblage protéomique quantitatif a été réalisé pour l'enrichissement sélectif de polypeptides Nglycosylés, sécrétés par les cellules hépatiques HuH7. Deux protéines transmembranaires de type II clivées par PC7/Furine, et sécrétées sous forme soluble, ont alors été identifiées : CAncer Susceptibility Candidate 4 (CASC4) and Golgi PhosphoProtein de 130 kDa (GPP130). Des études ultérieures menées sur CASC4 par iii notre laboratoire ont mis en évidence son rôle protecteur contre la migration et l'invasion du Cancer du Sein Triple Négatif. GPP130 est une protéine transmembranaire de type II avec un domaine luminal contenant des déterminants endosomaux et de récupération du Golgi, lui offrant une voie de trafic cellulaire unique. Jusqu'à présent, le rôle de GPP130 a principalement été étudié dans la liaison et le trafic rétrograde des Shiga-toxines. Un récent rapport a cependant aussi montré son implication dans la progression du cycle cellulaire et dans la prolifération des cellules du cancer de la tête et du cou. Ainsi, notre analyse du cBioPortal pour Cancer Genomics a révélé que GPP130 est amplifié jusqu'à 35% chez les patients atteints de cancer du poumon. Le travail présenté ici montre les implications du clivage de GPP130 par PC7 et Furine dans la progression du cancer du poumon, en identifiant la région de GPP130 responsable de la croissance cellulaire. Ce projet dévoile ainsi des stratégies thérapeutiques potentielles ciblant la prolifération cellulaire induite par GPP130. / Lung Cancer is the leading cause of cancer death in Canada and causes significant morbidity in patients. Globally, World Health Organization (WHO) reports lung cancer as the leading cause of cancer-related deaths, with 2.21 million diagnoses/year, resulting in approximately 1.8 million deaths/year. Initially asymptomatic, it progresses to a highly invasive and quickly metastasizing cancer. It is responsible for more deaths per year than the combined death of the four deadly cancers: colon, breast, prostate, and pancreas. Proprotein Convertases (PCs) are a family of nine serine proteases that play a role in the maturation of secretory precursor proteins. Basic amino acid-specific PCs activate/inactivate precursor proteins by cleaving them at single or paired basic aminoacid residues. They are crucial for various biological processes, including the activation of growth factors that play a vital role in cellular transformation and the likelihood of tumor formation. Of the nine serine proteases identified, the physiological functions of the seventh member of the family, PC7, currently remain mostly unidentified. To further identify novel PC7 substrates, a quantitative proteomics screen for selective enrichment of N-glycosylated polypeptides, secreted from hepatic HuH7 cells, was performed. This identified two type-II transmembrane proteins, which were shed into soluble secreted forms by PC7/Furin: CAncer Susceptibility Candidate 4 (CASC4) and Golgi PhosphoProtein of 130 kDa (GPP130). Subsequent studies on CASC4 by our laboratory reported the protective role that CASC4 plays against migration and invasion in Triple Negative Breast Cancer. v GPP130 is a type-II transmembrane protein with a luminal domain containing endosomal and Golgi-retrieval determinants enabling a unique subcellular trafficking route. So far, the role of GPP130 has only been extensively studied in the binding and retrograde trafficking of Shiga toxin. However, recent reports have shown its implication in cell-cycle progression and cellular proliferation of head and neck cancer cells. Our analysis from cBioPortal for Cancer Genomics revealed that GPP130 is amplified in up to 35% of patients with lung cancer. The work presented here shows the implications of shedding GPP130 by PC7 and Furin in lung cancer progression by identifying the region of GPP130 responsible for cellular growth and unravelling potential therapeutic strategies for GPP130-induced cellular proliferation.

Die myeloische Entwicklung wird durch die Familie der Transkriptionsfaktoren CCAAT/Enhancer-Binding-Protein (C/EBP) reguliert. Eine aberrante Expression oder Funktion von C/EBPs stört die normale myeloische Differenzierung und wird bei vielen Arten hämatopoetischer Malignome beobachtet. Mutationen von CEBPA führen zu einem veränderten Expressionsanteil der verkürzten Isoform C/EBPa p30 und werden bei etwa 15% der AML-Patienten (akute myeloische Leukämie) nachgewiesen. Obwohl die verkürzte Isoform C/EBPα p30 als Onkogen identifiziert wurde da sie die Proliferation myeloischer Vorläufer fördert, behält sie dennoch eine Differenzierungsfunktion. Unser Interesse gilt der Frage, wie diese beiden Funktionen von C/EBPα p30 reguliert werden. Die C/EBP-Familie gehört der Gruppe intrinsisch ungeordneter Proteine an, die zudem viele posttranslationale Modifikationen (PTMs) aufweisen. PTMs auf C/EBPα verändern seine biologische Funktionsweise stark. Frühere Forschungsarbeiten haben drei Argininreste am N-Terminus von C/EBPα p30 identifiziert, die aufgrund des Methylierungsstatus differentiell mit anderen Proteinen interagieren. In dieser Arbeit untersuchen wir den Einfluss der C/EBPα p30 Arginin-Methylierung auf seine pro-leukämische Aktivität sowie dessen Fähigkeit zur Neuausrichtung der hämatopoietischen Differenzierungslinie. Mit Hilfe von Aminosäuresubstitutionen fanden wir heraus, dass C/EBPα p30 Mutanten der Methylierungsmimesis oder Ladungsabschaffung die myeloische Differenzierung verstärkt, während Ladungserhalt-Mutanten die Erneuerung und Proliferation hämatopoetischer Stamm-/Vorläuferzellen unterstützt. Transkriptionelles Profiling von Zellen, die mutierte C/EBPα -p30-Varianten exprimieren, deutet auf potenzielle Ziele der methyliertem bzw. unmethyliertem C/EBPα p30 hin. Die Ergebnisse legen nahe, dass der Arginin-Methylierungsstatus das Leukämie- und Differenzierungs-Potenzial von C/EBPα p30 verändert und somit ein neues Ziel der Leukämietherapie darstellen könnten. / Myeloid development is regulated by the family of transcription factors CCAAT/enhancer-binding-protein (C/EBP). Aberrant expression or functioning of C/EBPs disturbs normal myeloid differentiation and is found in many types of hematopoietic malignancies. Mutations of CEBPA lead to imbalanced expression of the truncated isoform C/EBPα p30 and are found in approximately 15% of AML (acute myeloid leukemia) patients. Yet, how C/EBPα participates in leukemic progression remains to be discovered. More specifically, the truncated isoform C/EBPα p30, although being identified as an oncogenic isoform that promotes proliferation of myeloid progenitors, still retains differentiation function. The question of how both functions of C/EBPα p30 are regulated, is of our interest. C/EBP family also represents a group of intrinsically disordered proteins, which contain many post-translational modifications (PTMs). PTMs on C/EBPα greatly alter its functioning. Previous works have identified three arginine residues at the N-terminus of C/EBPα p30 that interact differently with others protein dependent on their methylation status. We hypothesize, that methylation of these arginine residues plays important roles in the biology of C/EBPα p30. In this study, we used a lymphoid-to-myeloid transdifferentiation (LMT) system to investigate the influence of arginine-methylation on C/EBPα-induced lineage switch and its pro-leukemic activity. Using amino acid substitution, we found that C/EBPα p30 mutants that resemble arginine-methylated p30 enhanced myeloid differentiation, while the charge-retention mutant, resembling arginine-unmethylated p30, supported renewability and proliferation of hematopoietic progenitors. Transcriptional profiling of cells expressing C/EBPα p30 variants suggested potential targets of either methylated or unmethylated p30. The results implied that arginine methylations alter C/EBPα p30’s leukemic potential and might comprise novel targets of leukemia therapy.

L’ubiquitination, une modification post-traductionnelle importante pour le contrôle de nombreux processus cellulaires, est une réaction réversible. La réaction inverse, nommée déubiquitination est catalysée par les déubiquitinases (DUB). Nous nous sommes intéressés dans nos travaux à étudier l’ubiquitination de l’histone H2A (H2Aub), au niveau des résidus lysines 118 et 119 (K118/K119), une marque épigénétique impliquée dans la régulation de la prolifération cellulaire et la réparation de l’ADN. Le régulateur transcriptionnel BAP1, une déubiquitinase nucléaire, a été initialement identifié pour sa capacité à promouvoir la fonction suppressive de tumeurs de BRCA1. BAP1 forme un complexe multi-protéique avec plusieurs facteurs transcriptionnels et sa fonction principale est la déubiquitination de H2Aub. Plusieurs études ont démontré que BAP1 est un gène suppresseur de tumeurs majeur et qu’il est largement muté et inactivé dans une multitude de cancers. En effet, BAP1 émerge comme étant la DUB la plus mutée au niveau des cancers. Cependant, le ou les mécanismes d’action et de régulation du complexe BAP1 restent très peu connus. Dans cette étude nous nous sommes intéressés à la caractérisation moléculaire et fonctionnelle des partenaires protéiques de BAP1. De manière significative nous avons caractérisé un mécanisme unique de régulation entre deux composants majeurs du complexe BAP1 à savoir, HCF-1 et OGT. En effet, nous avons démontré que HCF-1 est requis pour maintenir le niveau protéique de OGT et que cette dernière est indispensable pour la maturation protéolytique de HCF-1 en promouvant son clivage par O-GlcNAcylation, une signalisation cellulaire nécessaire au bon fonctionnement de HCF-1. Également, nous avons découvert un nouveau mécanisme de régulation de BAP1 par l’ubiquitine ligase atypique UBE2O. En effet, UBE2O agit comme un régulateur négatif de BAP1 puisque l’ubiquitination de ce dernier induit sa séquestration dans le cytoplasme et l’inhibition de sa fonction suppressive de tumeurs. D’autre part nous nous sommes penchés sur la caractérisation de l’association de BAP1 avec deux facteurs de la famille des protéines Polycombes nommés ASXL1 et ASXL2 (ASXL1/2). Nous avons investigué le rôle de BAP1/ASXL1/2, particulièrement dans les mécanismes de déubiquitination et suppression de tumeurs. Nous avons démontré que BAP1 interagit directement iii via son domaine C-terminale avec le même domaine ASXM de ASXL1/2 formant ainsi deux complexes mutuellement exclusifs indispensables pour induire l’activité déubiquitinase de BAP1. De manière significative, ASXM s’associe avec BAP1 pour créer un nouveau domaine composite de liaison à l’ubiquitine. Ces interactions BAP1/ASXL1/2 régulent la progression harmonieuse du cycle cellulaire. De plus, la surexpression de BAP1 et de ASXL2 au niveau des fibroblastes induit la sénescence de manière dépendante de leurs interactions. D’autre part, nous avons identifié des mutations de cancers au niveau de BAP1 le rendant incapable de lier ASXL1/2, d’exercer sa fonction d’autodéubiquitination et de ce fait d’agir comme suppresseur de tumeurs. Ainsi nous avons révélé un lien étroit entre le gène suppresseur de tumeurs BAP1, son activité déubiquitinase et le contrôle de la prolifération cellulaire. / The reverse reaction of ubiquitination, a crucial post-translational modification, is catalyzed by deubiquitinases (DUBs). BAP1 is an ubiquitously expressed nuclear DUB that recently emerged as an important tumor suppressor highly mutated and inactivated in an increasing number of cancers of diverse origins. Both somatic and germline mutations with loss of heterozygosity were observed in tumors, making BAP1 the most mutated DUB in human malignancies. We previously reported that BAP1 is a component of a large multi-protein complex that includes several transcription regulators. The Drosophila homologue of BAP1, Calypso, forms the Polycomb-repressive DUB (PR-DUB) complex with Additional Sex Comb, ASX. This complex catalyzes the deubiquitination of histone H2A, an essential chromatin modification that regulates gene expression. Despite the ever increasing number of findings describing the occurrence of BAP1 mutations in cancers, few studies investigated the mechanisms of action of this DUB as a tumor suppressor. Therefore, the biological function and the mechanism of action and regulation of BAP1 remains largely uncharacterized. In the work described in this thesis, we investigated the roles of BAP1 partners in modulating its catalytic activity and tumor suppressor function. More specifically we discovered a unique mechanism of regulation between two major components of BAP1 complexes, namely HCF-1 and OGT. Indeed, HCF-1 is important for the maintenance of the cellular levels of OGT. OGT, in turn, is required for the proper proteolytic maturation of HCF-1 by promoting its O-GlcNAcylation. This signaling event is required for HCF-1 function as a cell cycle regulator. On the other hand, we deciphered an intricate mechanism of regulation of BAP1 by the atypical E2/E3 ligase, UBE2O. UBE2O, promote the multi-monoubiquitination of BAP1 on its NLS mediating its cytoplasmic sequestration and thus inhibition of its tumor suppressor function. Another aspect of modulation of BAP1 H2Aub catalysis is provided by the association of BAP1 with ASXL1 and ASXL2 (ASXL1/ASXL2), two orthologs of ASX. We investigated the role of BAP1/ASXL1/2, particularly in the mechanisms of deubiquitination and tumor suppression. We have demonstrated that BAP1 interacts directly via its C-terminal domain with the ASXM domain of ASXL1/2, thus forming two mutually exclusive complexes. Significantly, ASXM promote, through assembly with BAP1, the generation of a composite ubiquitin binding domain (CUBI), indispensable for inducing the deubiquitinase activity of BAP1 towards H2Aub. The interactions between BAP1 and ASXL1/2 regulate cell cycle progression. In addition, overexpression of BAP1 or ASXL2 in fibroblasts induces senescence in CTD- and ASXM-dependent manner. We also identified cancer-derived mutation of BAP1 that selectively abolish its interaction with ASXL1 and ASXL2 as well as its H2A deubiquitinase activity. Significantly, this mutant suppressed senescence induced by BAP1 overexpression. Thus we provided a link between the tumor suppressor BAP1, its deubiquitinase activity and the control of cell proliferation.