In the growing field of proteomics identification of proteins by tandem mass spectrometry (MS/MS) is performed by matching experimental mass spectra against calculated spectra of all possible peptides in a protein database. One problem with this approach is the false-positive identifications. MS-based proteomics experiments are further affected by a rather poor efficiency typical in the range of 10-15%, implicating that only a low percentage of acquired mass spectrometric data is significantly identified and assigned a peptide sequence. In this thesis improvement in spectrum specificity is accomplished by using a combination of high-accuracy mass spectrometry and techniques that will yield complementary sequence information. Performing collision-activated dissociation (CAD) and electron capture dissociation (ECD) upon the same peptide ion will yield such complementary sequence information. Implementing this into a proteomics approach and showing the advantages of using complementary fragmentation techniques for improving peptide identification is shown. Furthermore, a novel database-independent score is introduced (S-score) based upon the maximum length of the peptide sequence tag derived from complementary use of CAD and ECD. The S-score can be used to separate poor quality spectra from good quality spectra. An-other aspect of the S-score is the development of the ‘reliable sequence tag’ which can be used to recover below threshold identifications and for a reliable backbone for de novo sequencing of peptides. A novel proteomics-grade de novo sequencing algorithm has also been developed based upon the RST, which can retrieve peptide identification with the highest reliability (>95%). Furthermore, a novel software tool for unbiased identifications of any post-translational modifications present in a peptide sample is introduced (ModifiComb). Combining all the tools described in this thesis increases the identification specificity (>30 times), recovers false-negative identifications and increases the overall efficiency of proteomics experiements to above 40%. Currently one of the highest achieved in large-scale proteomics.

Le principal intérêt de nos études présentées dans ce manuscrit, correspond à la compréhension des évènements, reliés aux acylations d’histones au niveau des lysines (Ks) dans les cellules germinales post méiotiques, qui régulent spécifiquement l’expression des gènes à l’échelle du génome entier.Dans la première partie de mon travail, nous avons élaboré une stratégie afin d’analyser le rôle des « histones acetyl transférases » (HATs), Cbp et p300, dans les cellules germinales post méiotiques. Pour ce faire, nous avons généré une lignée de souris conditionnellement et partiellement invalidée pour les gènes Cbp et p300 dans les cellules post méiotiques. Bien que les souris mâles sont fertiles et que la spermatogénèse semble se dérouler normalement, une analyse transcriptomique des cellules germinales haploïdes post méiotiques précoces et tardives nous a permis d’identifier une série de gènes dont l’expression est augmentée dans les cellules spermatogéniques tardives et qui sont sensibles à la diminution des niveaux de Cbp et p300. Ces résultats ont permis de révéler un programme spécifique d’expression de gènes dans les cellules germinales post méiotiques dépendant des HATs correspondantes.Prenant en compte qu’il existe une variété d’acylations des histones au niveau des lysines, nous avons étendu nos études à une modification à « quatre-carbone », la butyrylation. Nous avons alors initié une analyse comparative de l’acétylation et de la butyrylation de l’histone H₄ en positions K5 et K8 dans les cellules germinales mâles en différentiation. Nous avons cartographié à l’échelle du génome les marques H4K5ac, H4K5bu, H4K8ac, et H4K8bu au niveau de deux étapes développementales critiques avec les cellules méiotiques et les cellules post méiotiques haploïdes. Cette cartographie montre que la majorité des gènes exprimés fortement, à la fois dans les cellules méiotiques et les spermatides précoces rondes haploïdes, qu’au niveau des sites d’initiation de la transcription (TSSs) l’acétylation et la butyrylation sont interchangeables. De façon intéressante, beaucoup de ces promoteurs correspondants sont aussi reconnus par un régulateur essentiel de l’expression des gènes lors de la spermatogénèse, le factor à bromodomaine, Brdt. Une étude détaillée, des capacités de liaison du facteur Brdt sur les parties N-terminales de l’histone H4 portant des combinaisons variées d’acétylation et/ou de butyrylation en position K5 et K8, montre que la marque H4K5bu inhibe fortement la liaison du facteur Brdt. Nos résultats suggèrent qu’en addition à la fonction activatrice de Brdt vis-à-vis du programme d’expression de gènes méiotiques et post méiotiques, l’échange (« turnover ») induit par la butyrylation d’H4K5 est également important. Ce travail montre comment une interconnexion entre deux différentes acylations d’une même lysine peut jouer un rôle régulateur essentiel en augmentant la dynamique de liaison de la chromatine par un lecteur de lysine acétylé, Brdt.Enfin, au cours d’un travail collaboratif portant sur des approches structurales, nous avons montré, malgré le fait que p300 soit répertoriée comme une acétylase robuste, que son activité est réduite lorsque la longueur des chaines acyl augmente. Ces résultats suggèrent qu’in vivo, p300 puisse utiliser un co-facteur spécifique pour assurer des acylations d’histones autre qu’une acétylation.Ces investigations mettent en lumière comment la programmation du génome mâle est guidée par diverses acylations d’histone et révèlent pour la première fois l’existence d’un réseau moléculaire qui régule ces acylations et transmet un impact fonctionnel. / The main focus of the investigations reported in this manuscript is the understanding of the regulatory events that are based on histone lysine modifications in post-meiotic male germ cells, where specific and chromosome-wide regulations of gene expression occur. In the first part of my work we designed a strategy to specifically investigate the role of the histone acetyl-transferases (HATs), Cbp and p300, in post-meiotic male germ cells.Accordingly, we generated double Cbp and p300 conditional knock-out mice resulting in a partial depletion of Cbp and p300 in post-meiotic cells. Although the mice were fertile and spermatogenesis seemed to take place normally, a transcriptomic analysis of early and late post-meiotic germ cells led to the identification of a specific subset of genes with an increased expression in late spermatogenic cells that is highly sensitive to the decreased amounts of Cbp and p300. In conclusion, these results have revealed an interesting new gene expression program specific to post-meiotic male germ cells that are specifically regulated by the considered HATs.Taking into account the occurrence of a variety of histone lysine acylations, we extended these investigations to a four-carbon histone lysine modification, butyrylation. Accordingly, we have undertaken a comprehensive comparative analysis of histone H4 acetylation and butyrylation on its K5 and K8 positions in differentiating male germ cells. Genome-wide mapping of H4K5ac, H4K5bu, H4K8ac and H4K8bu at two critical developmental stages, meiotic and post-meiotic haploid cells, shows an interchangeable use of acetylation and butyrylation in the Transcriptional Start Sites (TSSs) of the most highly expressed genes in both meiotic and haploid round spermatids. Interestingly, many of these promoters are also bound by the essential regulator of spermatogenic gene expression, the BET bromodomain-containing factor, Brdt. A detailed analysis of Brdt binding capacity of H4 tails bearing various combinations of K5 and K8 acetylation and butyrylation showed that H4K5 butyrylation severely interferes with Brdt-binding. Our results therefore indicate that not only Brdt is required for the activation of a meiotic and post-meiotic gene expression program, but also its turnover induced by H4K5 butyrylation is equally important. This work hence highlights how an interplay between two different acylations occurring on the same lysines can play an essential regulatory role by increasing the chromatin binding dynamics of a critical lysine acetyl-reader, Brdt.Finally, in a collaborative work with structural biologists we showed that while p300 is a robust acetylase, its activity gets weaker with increasing acyl chain length. These results suggest that in vivo, p300 would use a specific co-factor to ensure non-acetyl histone acylations.Overall, these investigations shed an important light on how the male genome programming is guided by histone acylations and revealed for the first time a molecular network that regulates histone acylations and mediates its functional impact.

Dans ce travail de thèse, nous avons développé et optimisé une stratégie originale pour la caractérisation des extrémités N-terminales des protéines et des sites de clivages protéolytiques. Elle s’appuie sur la dérivation chimique spécifique des amines N-terminales et nous l’avons adapté à différents types d’échantillons biologiques. L’application de cette stratégie dans des études en biologie nous a permis d’apporter plusieurs éléments de réponse à différentes problématiques. Nous avons ainsi caractérisé les peptides de transit des protéines mitochondriales humaines et ainsi validé/corrigé expérimentalement leurs prédictions dans les banques de données. Nous avons aussi appliqué cette stratégie à l’étude du protéome du parasite P. falciparum. La mise au point de la dérivation N-terminale de protéines immobilisées dans un gel SDS PAGE nous a permis d’étudier le mécanisme d’export des protéines de ce parasite vers sa cellule hôte et de déterminer le rôle des acides aminés impliqués dans cet export. Un réactif de dérivation marqué aux isotopes stables permet d’effectuer des études différentielles des processus protéolytiques que subissent les protéines. Cette stratégie quantitative a été appliquée à l’étude du protéome hépatique du rat soumis au jeûne expérimental. D’autres applications de l’analyse protéomique en biologie sont aussi présentées dans ce manuscrit. / In this manuscript, we describe the development and the optimization of an original strategy for the characterization of protein N-termini and protease cleavage sites. The strategy is based on specific chemical derivation of alpha-amines. We applied this method to the characterization of mitochondrial proteins’ transit peptides which allowed us to experimentally validate/correct their prediction in protein databases. In another study, the strategy was applied to the analysis of the proteome of the malaria parasite Plasmodium falciparum. The optimization of ingel N-terminal derivation and its application to the study of parasite exported proteins allowed us to determine the role of implicated amino acid residues in the signaling and export mechanism of these proteins to the host cell. To enable differential studies of proteolysis, we introduced an isotope labeled derivation reagent. This quantitative method was applied in the context of a study of the rat liver proteome after experimental long-term fasting. Other applications of proteomics in biology are also presented in this manuscript.

En influençant le degré de compaction de la chromatine ainsi que ses interactions avec différents partenaires protéiques, les modifications post-traductionnelles des histones sont impliquées dans la régulation de l’expression des gènes. Avec les différents variants d’histones incorporés dans la chromatine, ces modifications dynamiques et sensibles à l’environnement sont constitutives du code histone. Ce travail présente une approche globale de criblage baptisée approche histonomique, visant à révéler une perturbation épigénétique à l’échelle des histones. Cette approche originale offre une comparaison rapide et fiable des abondances relatives des variants d’histones et de leurs modifications post-traductionnelles dans des cellules humaines en une seule analyse LC-MS. Comme preuve de concept, des cellules BeWo issues de choriocarcinome humain ont été exposées au butyrate de sodium, un inhibiteur non spécifique d’histones désacétylases. Les histones extraites des échantillons témoins ou traités au butyrate de sodium à 1 ou 2,5 mM ont été analysées par chromatographie liquide ultra performante couplée à un spectromètre de masse de type Q-TOF. Les analyses statistiques multivariées ont permis de discriminer les échantillons témoins des échantillons traités sur la base des différences de degrés d’acétylation observés sur plusieurs formes d’histones. La même approche a ensuite été appliquée à des cellules exposées au B[a]P à 1 μM et a révélé deux principaux marqueurs caractéristiques d’un remodelage de la chromatine induit par les effets génotoxiques duB[a]P. En résumé, cette approche histonomique globale pourrait se révéler être un outil complémentaire très utile pour explorer une potentielle perturbation du code histone lors d’exposition à des xénobiotiques environnementaux. / While acting upon chromatin compaction, histone post-translational modifications (PTMs) are involved in modulating gene expression through histone–DNA affinity and protein–protein interactions. These dynamic and environment-sensitive modifications are constitutive of the histone code that reflects the transient transcriptional state of the chromatin. Here we describe a global screening approach for revealing epigenetic disruption at the histone level. This original approach enables fast and reliable relative abundance comparison of histone PTMs and variants in human cells within a single LC-MS experiment. As a proof of concept, we exposed BeWo human choriocarcinoma cells to sodium butyrate (SB), a universal histone deacetylase (HDAC) inhibitor. Histone acide xtracts equally representing 3 distinct classes, Control, 1 mM and 2.5 mM SB, we reanalyzed using ultra-performance liquid chromatography coupled with a hybrid quadrupoletime-of-flight mass spectrometer (UPLC-QTOF-MS). Multivariate statistics allowed us to discriminate control from treated samples based on differences in the acetylation level of several histone forms. We then applied the same procedure to cells treated with 1 μMB[a]P and suceeded in revealing two markers of chromatin remodeling in relation withgenotoxic properties of B[a]P. Indeed, this untargeted histonomic approach could be auseful exploratory tool in many cases of environmental xenobiotic exposure when histone code disruption is suspected.

The 2OG oxygenases comprise a superfamily of ferrous iron dependent dioxygenases with multiple biological roles, including in hypoxia sensing, transcriptional control, and splicing control. It was recently proposed that 2OG oxygenases catalyse the hydroxylation of ribosomal proteins in prokaryotes (ycfD) and in humans (NO66 and MINA53), raising the possibility that 2OG oxygenases also control translation. The work described in this thesis concerned investigations on the biochemical and functional aspects of prokaryotic and mammalian ribosomal protein hydroxylases (ROX) in vitro and in cells. An efficient chromatographic system linked to mass spectrometric analysis (LC-MS) was developed for studying the masses of individual ribosomal proteins (>90% coverage of ribosomal proteome) to ±1 Da accuracy. It was demonstrated that ycfD catalyses the hydroxylation of R81 on L16 in E. coli, in a manner dependent on atmospheric oxygen levels. YcfD deletion results in growth phenotype at low temperatures and in minimal medium, and in decreased global translation rates in minimal medium; ycfD deletion does not affect translational accuracy and ribosome assembly. Furthermore, ycfD-deletion results in increased sensitivity to the antibiotics chloramphenicol and lincomycin. Consistent with a 2OG-oxygenase mediated mechanism of antibiotic resistance, chloramphenicol sensitivity of the E. coli wild-type strain could be increased by inhibiting the activity of ycfD by removing co-factors required for catalytic activity (Fe(II) and O2), and, at least in part, by using a ycfD inhibitor, IOX1, which inhibits ycfD with IC₅₀ of 38 μM in vitro. The therapeutic potential of a post-translational modification mediating antibiotic resistance provides an opportunity for medicinal targeting of ribosome-modifying enzymes, for example ycfD, which may be more ‘druggable’ than the ribosome itself. In co-treatment with an existing antibiotic, such as chloramphenicol, a small molecule inhibitor would achieve a potentiated antibiotic effect. Structural aspects of ROX hydroxylation were pursued by characterising a thermophilic ROX-substrate complex; a ycfD homologue was identified in the thermophilic bacterium Rhodothermus marinus and shown to be a thermophilic 2OG oxygenase ycfD_RM, acting on R82 of ribosomal protein L16_RM. The activity of ycfD_RM in cells was limited at high growth temperature and oxygen solubility was demonstrated as a likely limiting factor of ycfD_RM activity, thus identifiying a potential 2OG oxygenase oxygen sensor in prokaryotes. A crystal structure of ycfD_RM in complex with L16RM substrate fragment was determined to 3.0 Å resolution. Structural analyses suggested that ycfD_RM contains 30% more hydrophobic interactions and 100% more salt-bridge interactions than ycfD_EC, suggesting that these interactions are important for thermal stabilisation of ycfD_RM. The structures reveal key interactions required for binding of ribosomal proteins. Substantial structural changes were observed in the presence of the substrate fragment, which implies induced-fit binding of the L16_RM substrate. The work has informed further structural studies on the evolutionarily related human ROX, NO66 and MINA53, for which substrate structures have been obtained since the completion of the work. The LC-MS analysis of ribosomal proteins was extended to mouse and human cells to demonstrate that the human ROX homologue of ycfD, MINA53, hydroxylates the 60S ribosomal protein rpL27a in cells. It was demonstrated that rpL27a hydroxylation is widespread and found in all mouse organs analysed, as well as in cancer cell lines and in clinical cancer tissues. A partial or complete reduction of rpL27a hydroxylation was observed in a number of clinically identified MINA53 mutations from the COSMIC database of cancer mutations. Structural analysis suggested that mutations occur more frequently at structurally important regions of MINA53, including the βIV-βV insert in the core fold of MINA53. The identification of inhibiting clinical mutations suggests that rpL27a hydroxylation level could be used as a cancer mark, and in the future for selective inhibition by ribosomal antibiotics. The work presented in this thesis demonstrates that it is possible to selectively inhibit modified ribosomes; an inhibitor of unhydroxylated rpL27a could therefore, at least in principle, be active against the sub-set of tumours with inactivating mutation(s) of MINA53, but not normal tissue. Future work should therefore focus on identifying a selective inhibitor of unhydroxylated eukaryotic ribosomes which could be applied for treatment of cancers harbouring deactivating MINA53 mutations. The same approach could be applied to other ribosome modifications (to rRNA, ribosomal proteins, and ribosome-associate factors) that are different in cancer compared to normal cells.

Our understanding of protein lysine methyltransferases and their substrates remains limited despite their importance as regulators of the proteome. The SMYD (SET and MYND domain) methyltransferase family plays pivotal roles in various cellular processes, including transcriptional regulation and embryonic development. Among them, SMYD2 is associated with oesophageal squamous cell carcinoma, bladder cancer and leukemia as well as with embryonic development. Initially identified as a histone methyltransferase, SMYD2 was later reported to methylate p53, the retinoblastoma protein pRb and the estrogen receptor ERalpha and to regulate their activity. Our proteomic and biochemical analyses demonstrated that SMYD2 also methylates the molecular chaperone HSP90 on K209 and K615. We also showed that HSP90 methylation is regulated by HSP90 co-chaperones, pH, and the demethylase LSD1. Further methyltransferase assays demonstrated that SMYD2 methylates lysine K* in proteins which include the sequence [LFM]-₁-K*-[AFYMSHRK]+₁-[LYK]+₂. This motif allowed us to show that SMYD2 methylates the transcriptional co-repressor SIN3B, the RNA helicase DHX15 and the myogenic transcription factors SIX1 and SIX2. Finally, muscle cell models suggest that SMYD2 methyltransferase activity plays a role in preventing premature myogenic differentiation of proliferating myoblasts by repressing muscle-specific genes. Our work thus shows that SMYD2 methyltransferase activity targets a broad array of substrates in vitro and in situ and is regulated by intricate mechanisms.

Les gènes Hox codent des facteurs de transcription à homéodomain (HD). Bien que ce dernier reconnaisse des séquences similaires in vitro, les protéines Hox achèvent des fonctions hautement spécifiques in vivo. Des séquences protéiques en dehors de l’HD influencent la spécificité d’action des protéines Hox par le recrutement de cofacteurs, dont le mieux caractérisé est Extradenticle (Exd) chez la drosophile. Des travaux récents au sein de notre équipe ont démontré la contribution fonctionnelle de trois motifs de AbdA, aussi bien dans des fonctions Exd-dépendantes qu’à des fonctions Exd-indépendantes. Mon travail de thèse a porté sur la caractérisation de la contribution des motifs protéiques de AbdA dans la sélection puis dans la régulation des gènes cibles en utilisant une approche combinée ChIPseq/RNAseq, dans un contexte Exd-indépendant. Le code ADN identifié nous a renseigné sur la présence d’inputs transcriptionnels additionnels. Ces derniers correspondant à des facteurs de transcription déjà connus, leur présence dans un complexe protéique avec AbdA a été démontrée par des analyses de spectrométrie de masse. Un second volet de mon travail de thèse a été l’identification de modifications post-traductionnelles pouvant rendre compte d’un mécanisme de régulation de l’activité des protéines Hox. Des analyses prédictives in silico, confirmées par des approches biochimiques et des analyses in vivo ont démontré la SUMOylation de AbdA. Ces résultats préliminaires posent les bases pour des travaux futures qui auront pour objectif d’identifier les résidus d’AbdA SUMOylés et d’élucider le rôle de cette modification dans la régulation de l’activité de la protéine AbdA. / Hox genes encode homeodomain-containing transcription factors (HD). Although the HD binds to similar DNA sequences in vitro, Hox proteins display a high functional specificity in vivo. Protein motifs outside of the HD influence Hox specificity through recruiting additional cofactors, with the best characterized being Extradenticle (Exd in Drosophila). Recent evidence from our group has uncovered the functional contribution of AbdA intrinsic motifs to AbdA Exd-dependent functions as well as AbdA Exd-independent functions. My PhD work has aimed to characterize the contribution of AbdA motifs to target gene selection and regulation using a combined approach of ChIPseq/RNAseq in an Exd-independent context. The DNA code identified provides us with new insights about additional transcriptional inputs from additional DNA-binding proteins lying in the vicinity of AbdA recognition sites. Mass spectrometry analysis establishes the occurrence of these additional DNA binding proteins in a multi-protein complex with AbdA. Deciphering the involvement of post-translational modifications in the regulation of Hox protein activity was another aspect of my PhD work. In silico predictive analysis, followed by biochemical approaches and in vivo assays reveal the potential for SUMOylation of AbdA as a potentially important regulatory component of AbdA activity. These preliminary results set the bases for further work aimed at identifying SUMOylated residues on AbdA and the functional relevance of such post-translational modification on AbdA activity regulation.

El óxido nítrico (NO) es una molécula gaseosa altamente reactiva que regula el crecimiento y el desarrollo de las plantas así como sus respuestas de defensa. El NO se produce principalmente a partir de nitrito por las nitrato reductasas (NRs) en balance con las nitrito reductasas (NiRs), y es percibido a través de un mecanismo en el que está involucrada la proteólisis dirigida por la secuencia aminoterminal del grupo VII de los factores de transcripción ERF (ERFVIIs). El NO ejerce especialmente su función señalizadora al causar modificaciones postraduccionales en las proteínas y alterar su función, estructura y/o estabilidad. Por estos medios y en colaboración con distintas rutas de señalización fitohormonales, el NO es capaz de regular un amplio abanico de procesos celulares en plantas, incluyendo aquellos relacionados con la adquisición de tolerancia a la congelación. Utilizando Arabidopsis thaliana como planta modelo, en este trabajo se descubrió que el NO puede regular su propia biosíntesis, puesto que las enzimas NRs y NiRs fueron reguladas por tres factores principales: señalización inducida por nitrato y controlada por la función del factor de transcripción NIN-like protein 7 (NLP7), la proteólisis dirigida por la secuencia aminoterminal, y la degradación mediada por el proteasoma, probablemente ocasionada por modificaciones postraduccionales relacionadas con el NO. Adicionalmente, se descubrió que el factor de transcripción ERFVII RAP2.3 regula negativamente tanto la biosíntesis de NO como las respuestas que desencadena a través de un mecanismo similar a un reóstato en el que están involucradas ramas específicas relacionadas con el NO de las rutas de señalización de jasmonato y ácido abscísico. Por otro lado, una caracterización metabolómica y transcriptómica combinada de plantas mutantes nia1,2noa1-2 deficientes en NO y plantas fumigadas con NO permitió desentrañar una serie de mecanismos que están controlados por NO. En primer lugar, la percepción de NO en los hipocotilos requeriría varias hormonas para ser completada, como fue confirmado por los rastreos de acortamiento de hipocotilo por NO con mutantes relacionados con hormonas y la colección TRANSPLANTA de líneas transgénicas que expresan condicionalmente factores de transcripción de Arabidopsis. En segundo lugar, dosis elevadas de NO causan una reprogramación masiva aunque transitoria de los metabolismos primario y secundario, incluyendo la alteración del estado redox celular, la alteración de la permeabilidad de estructuras lipídicas y el recambio de proteínas y ácidos nucleicos. Por último, se descubrió que el NO previene el desarrollo de la tolerancia a congelación bajo condiciones no estresantes de temperatura, mientras que resulta esencial para la aclimatación a frío desencadenada por bajas temperaturas que conduce a una tolerancia mejorada a congelación. El NO conseguiría esta modulación afinada de la activación de respuestas relacionadas con frío al coordinar la acumulación de diferentes metabolitos y hormonas. En conjunto, este trabajo arroja luz sobre los mecanismos mediante los cuales, al interactuar con varias rutas señalizadoras y metabólicas, el NO puede regular distintos procesos clave de la fisiología vegetal. / L'òxid nítric (NO) és una molècula gasosa altament reactiva que regula el creixement i desenvolupament de les plantes així com les seves respostes de defensa. El NO es produeix principalment a partir de nitrit per les nitrat reductases (NRs) en balanç amb les nitrit reductases (NiRs), i és percebut a traves d'un mecanisme que inclou la proteòlisi dirigida per la seqüència aminoterminal del grup VII dels factors de transcripció ERF (ERFVII). El NO exerceix la seva funció senyalitzadora majoritàriament al provocar modificacions postraduccionals en les proteïnes i alterar la seva funció, estructura i/o estabilitat. Mitjançant aquestes modificacions i en col·laboració amb distintes rutes de senyalització fitohormonals, el NO es capaç de regular un ampli espectre de processos cel·lulars en plantes, inclosos aquells relacionats amb l'adquisició de tolerància a la congelació. Emprant Arabidopsis thaliana com a planta model, en aquest treball es va descobrir que el NO regula la seva pròpia biosíntesi, donat que els enzims NRs i NiRs foren regulades per tres factors principals: senyalització induïda per nitrat i controlada per la funció del factor de transcripció NIN-like protein 7 (NLP7), la proteòlisi dirigida per la seqüència aminoterminal, i la degradació mitjançant el proteasoma, probablement a causa de modificacions postraduccionals relacionades amb el NO. A més, es va descobrir que el factor de transcripció ERFVII RAP2.3 regula negativament tant la biosíntesi de NO com les respostes que desencadena aquest a través d'un mecanisme similar a un reòstat en el que estan involucrades branques específiques de les rutes de senyalització de jasmonat i àcid abscísic relacionades amb el NO. Per altre costat, una caracterització metabolòmica i transcriptòmica combinada de plantes mutants nia1,2noa1-2 deficients en NO i plantes fumigades amb NO va permetre desentranyar una sèrie de mecanismes que estan controlats per NO. En primer lloc, la percepció de NO en els hipocòtils requeriria de varies hormones, com fou confirmat pels rastrejos d'acurtament d'hipocòtil per NO amb mutants relacionats amb hormones i la col·lecció TRANSPLANTA de línies transgèniques d'expressió condicional de factors de transcripció d'Arabidopsis. En segon lloc, dosis elevades de NO causen una reprogramació massiva, encara que transitòria, dels metabolismes primari i secundari, incloent l'alteració de l'estat redox cel·lular, canvis en la permeabilitat de estructures lipídiques i el recanvi de proteïnes i àcids nucleics. Per últim, es va descobrir que el NO prevé el desenvolupament de la tolerància a congelació en condicions no estressants de temperatura, mentre que resulta essencial per a l'aclimatació a fred induïda per baixes temperatures que condueix a una tolerància millorada a congelació. El NO aconseguiria aquesta modulació minuciosa de l'activació de les respostes relacionades amb fred al coordinar l'acumulació de diferents metabòlits i hormones. En conjunt, aquest treball clarifica els mecanismes pels quals el NO pot regular distints processos clau de la fisiologia vegetal al interactuar amb varies rutes senyalitzadores i metabòliques. / Nitric oxide (NO) is a highly reactive gaseous molecule that regulates plant growth and development as well as defense responses. NO is mainly produced from nitrite by nitrate reductases (NRs) in balance with nitrite reductases (NiRs), and is sensed through a mechanism involving the N-end rule pathway-mediated proteolysis of the group VII of ERF transcription factors (ERFVIIs). NO especially exerts its signaling function by triggering post-translational modifications in proteins and altering their function, structure and/or stability. By these means and in collaboration with different phytohormone signaling pathways, NO is capable of regulating a wide array of cell processes in plants, including those related to the acquirement of freezing tolerance. By using Arabidopsis thaliana as model plant, during the development of this work it was found that NO can regulate its own biosynthesis, as NRs and NiR enzymes were regulated by three main factors: nitrate-induced signaling controlled by the function of the NIN-like protein 7 (NLP7) transcription factor, N-end rule proteolytic pathway, and proteasome-mediated degradation, likely triggered by NO-related post-translational modifications. In addition, the ERFVII transcription factor RAP2.3 was found to negatively regulate both the NO biosynthesis and their triggered responses through a rheostat-like mechanism that involves specific NO-related branches of jasmonate and abscisic acid signaling pathways. On the other hand, a combined metabolomic and transcriptomic characterization of NO-deficient nia1,2noa1-2 mutant plants and NO-fumigated plants allowed to unravel a number of mechanisms that are controlled by NO. First, NO perception in hypocotyls would require various hormones to be fulfilled as it was confirmed by NO-triggered hypocotyl shortening screenings with hormone-related mutants and the TRANSPLANTA collection of transgenic lines conditionally expressing Arabidopsis transcription factors. Second, high NO doses caused a massive but transient reprogramming of primary and secondary metabolism, including alteration of the cellular redox status, alteration of the permeability of lipidic structures or turnover of proteins and nucleic acids. Lastly, NO was found to prevent the development of freezing tolerance under non-stress temperature conditions, while being essential for the low temperature stress-triggered cold acclimation that leads to enhanced freezing tolerance. NO would achieve this fine-tuned modulation of the activation of the cold-related responses by coordinating the accumulation of different metabolites and hormones. Altogether, this work sheds light on the mechanisms by which, by interacting with various signaling and metabolic pathways, NO can regulate several key processes of plant physiology. / Costa Broseta, Á. (2018). Regulation of the nitric oxide synthesis and signaling by posttranslational modifications and N-end rule pathway-mediated proteolysis in Arabidopsis thaliana [Tesis doctoral no publicada]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/114825 / TESIS

Le médulloblastome (MB) représente la tumeur maligne la plus fréquente du système nerveux chez l'enfant. Dans le laboratoire nous nous intéressons au sous-groupe avec une activation de la voie Sonic Hedgehog (SHH). Dans ce sous-groupe, l’induction de la dégradation du facteur de transcription Atoh1 par le protéasome empêche la prolifération des cellules de médulloblastome in vivo, ce qui fait d’Atoh1 une cible thérapeutique potentielle dans le cadre du MB SHH. Dans ce contexte, en utilisant une approche de purification d’Atoh1 suivie d’analyse des complexes protéiques par MudPit (Multidimensional Protein identification technology), nous avons découvert un nouveau partenaire d’Atoh1, une enzyme faisant partie du système ubiquitine-protéasome (UPS). Il s’agit d’une déubiquitinylase capable de cliver les chaines d’ubiquitine attachées sur ses substrats et ainsi d’inhiber la dégradation induite via le protéasome. Au cours de ma thèse j’ai tout d’abord confirmé l’interaction physique et fonctionnelle entre Atoh1 et l’enzyme identifié par MudPit. De plus, dans le but d’approfondir le rôle de cet enzyme dans la maintenance tumorale, nous avons validé que son inactivation in vivo permet (i) d’induire la dégradation d’Atoh1 et (ii) de bloquer la croissance des tumeurs. Parallèlement, nos résultats montrent que son inhibition pharmacologique déclenche la dégradation d’Atoh1, suivie d’un arrêt de la prolifération des cellules cancéreuses in vitro, et la regression tumorale in vivo.En conclusion, l’ensemble de ce travail a permis d’identifier un nouveau mécanisme moléculaire qui pourrait permettre de manipuler l’expression d’Atoh1 dans un but thérapeutique dans le cadre du MB SHH. / Medulloblastoma (MB) is the most common malignant tumor of the nervous system in children. Among the four molecular subgroups of MB, we focus on the one characterized by the activation of the Sonic Hedgehog pathway (SHH). In this subgroup, the degradation of the transcription factor Atoh1 through the proteasome prevents proliferation of medulloblastoma cells in vivo, which makes Atoh1 a potential therapeutic target in the SHH MB subgroup. In this context, using an Atoh1 purification approach followed by Mudpit (Multidimensional Protein Identification Technology) analysis, we discovered a new Atoh1 partner belonging to the ubiquitin-proteasome system (UPS). This protein is a deubiquitinating enzyme (DUB) that cleaves the polyubiquitin chains from its substrates and thus inhibits their degradation via the proteasome.During my PhD, I first confirmed the physical and functional interaction between Atoh1 and the DUB enzyme. In addition, in order to investigate its role in SHH MB, we validated that its knockdown induces Atoh1 degradation and tumor growth arrest in vivo. In parallel, our results show that its pharmacological inhibition triggers Atoh1 degradation in vitro, followed by an inhibition of MB proliferation, and regulates negatively tumor progression in vivo.Altogether, this present work allowed the identification of a new molecular mechanism that defines the transcription factor Atoh1 as new therapeutic strategy to treat SHH MB patients.

La réponse et l’adaptation des plantes à un stress métallique mettent en jeu de nombreux mécanismes afin de limiter les effets néfastes des éléments toxiques. Bien que certains de ces mécanismes soient bien caractérisés, de nombreux acteurs cellulaires et moléculaires restent à identifier pour mieux comprendre la diversité des stratégies mises en œuvre dans ces processus complexes et vitaux pour les plantes.Dans un premier temps, nous nous sommes intéressés au rôle de deux modifications post-traductionnelles, la phosphorylation et la méthylation des protéines non-histone dans la réponse à un stress induit par deux éléments non essentiels et toxiques, le cadmium (Cd) et l’uranium (U). Nous avons analysé la dynamique de ces modifications chez trois espèces du genre Arabidopsis : A. thaliana et A. lyrata, deux espèces sensibles au Cd, et A. halleri, espèce naturellement capable de tolérer et d’hyper-accumuler ce métal toxique dans ses feuilles. En utilisant une combinaison d’analyses par Western blot et par spectrométrie de masse nous avons montré que les patterns de méthylation des protéines changent au cours de stress métalliques. Puis, nous avons analysé l’expression des gènes codant les enzymes impliquées dans les réactions de phosphorylation et méthylation des protéines dans différentes conditions de stress. Ces analyses ont montré qu’un grand nombre de protéines kinases sont régulés au niveau transcriptionnel par un stress métallique tandis que seules quelques une en ce qui concerne la méthylation. Pour finir, nous avons mis en place un criblage génétique de mutants d’A. thaliana et identifié deux gènes codant des protéines lysine méthyltransférases impliqués dans la tolérance au Cd.Dans un deuxième temps, nous avons étudié les mécanismes cellulaires de la réponse du système racinaire d’A. thaliana lors d’une exposition à l’U. L’utilisation de différents systèmes rapporteurs et la mesure de différents paramètres physiologiques nous ont permis de mettre en évidence que l’architecture racinaire est fortement modulée en réponse à l’U et ceci de façon dose dépendante. Cet effet est lié à l’inhibition du cycle cellulaire et à la synthèse d’espèces réactives de l’oxygène et d’oxyde nitrique dont l’accumulation provoque la mort cellulaire. Ces changements sont associés à une perturbation du transport et de la distribution de l’auxine dans les racines. Ces événements sont temporellement corrélés avec l’accumulation de polymères de défense (callose et lignine) impliqués dans l’imperméabilisation des cellules et des parois. Cette étude confirme enfin que le stress induit par l’U est intimement lié à une perturbation de l’homéostasie de certains macronutriments (phosphate et fer) et partage les cascades de signalisation d’une carence en phosphate.Ce travail met en évidence des mécanismes de réponse et d’adaptation aux métaux toxiques à travers la régulation fine des phénomènes de méthylation des protéines non-histone et l’identification de processus cellulaires impliqués dans la réponse à la toxicité de l’U dans le système racinaire. / Plant response and adaptation to metallic stress are involving numerous mechanisms limiting the toxic effect of metals. Although a large number of these mechanisms are well characterized, many processes are in need to be identified in order to have a better understanding of strategies involved in plant response to toxic elements.In first instance, we investigated the role of two post-translational modifications, phosphorylation and methylation of non-histone proteins in response to stress induced by two toxic metals, cadmium and uranium. We analyzed the dynamic of these modifications in three species of Arabidopsis: A. thaliana, A. lyrata two species sensitive to cadmium and A. halleri, a species which naturally tolerate and hyperaccumulate toxic metals in her leaves. By using Western blots and mass spectrometry in parallel, we showed that lysine methylation pattern were changing during metallic stresses. Next, we analyzed the gene expression of enzymes involved in phosphorylation and lysine methylation processes in plants exposed to different adverse conditions. These analyses showed that numerous kinases expressions were differentially regulated in response to metallic stress. Concerning protein lysine methyltransferases, only a few enzymes were differentially regulated. Finally, through a mutant genetic screening we identified two genes coding for protein lysine methyltransferases involved in tolerance to a stress induced by cadmium.Secondly, we studied the physiological and cellular processes involved in the response of A. thaliana root system to uranium. Through the utilization of several reporters and the measure of physiological parameters, we demonstrated that the root architecture was strongly modulated in response to a stress induced by uranium and that in a dose dependent manner. These effects are linked to a cell cycle inhibition and the synthesis and accumulation of reactive oxygen species and nitric oxyde wich participated in the root apex cell death. These changes were associated with perturbation in auxin transport and distribution at the root apex and were temporally correlated to the deposition of defense polymers (callose and lignin) involved in cell proofing and cell wall stiffness. This study is confirming the fact that uranium induced stress is intimately linked to a disruption of phosphate and iron homeostasis. Furthermore, uranium-signaling cascade are sharing a part of the phosphate starvation-signaling cascade.Together, these two studies are revealing mechanisms involved in plant response and adaptation to metallic trace elements through the thin tuning of non-histone methylation and the identification of cellular process involved in the toxicity of uranium in roots.