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Thesis (Ph.D.)--University of South Florida, 2005. / Includes vita. Includes bibliographical references (leaves 128-144). Also available online.

Thesis (Ph. D.)--University of Nevada, Reno, 2002. / Includes bibliographical references. Online version available on the World Wide Web.

Voltage-gated K+ channels associate with multiple regulatory proteins to form complexes with diverse gating properties and pharmacological sensitivities. Small molecules which activate or inhibit channel function are valuable tools for dissecting the assembly and function of these macromolecular complexes. My thesis focuses on the discovery and use of small molecules to probe the structure and function of the KCNQ family of voltage-gated K+ channels. One protein that obligatorily assembles with KCNQ channels to mediate proper assembly, trafficking, and gating is the calcium sensor, calmodulin. Although resolution of the crystal structures of calmodulin associated with isolated peptide fragments from other ion channels has provided some insight into how calmodulin interacts with and modulates KCNQ channels, structural information for calmodulin bound to a fully folded ion channel in the membrane is unknown. In Chapter II, I developed an intracellular tethered blocker approach to determine the location of calmodulin binding with respect to the KCNQ ion-conducting pathway. Using distance restraints from a panel of these intracellular tethered blockers we then generated models of the KCNQ-calmodulin complex. Our model places calmodulin close to the gate of KCNQ channels, providing structural insight into how CaM is able to communicate changes in intracellular calcium levels to KCNQ channel complexes. In addition to pore blockers, chemical modification of ion channels has been used to probe ion channel function. During my initial attempt to chemically activate KCNQ channels, I discovered that some boronates modulate KCNQ complexes. In Chapter III, the activating derivative, phenylboronic acid, is characterized. Characterization of activation by phenylboronic acid showed that it targeted the ion conduction pathway of KCNQ channels with some specificity over other voltage-gated K+ channels. The commercial availability of thousands of boronic acid derivatives provides a large class of compounds with which to systematically dissect the mechanisms of KCNQ gating and may lead to the discovery of a potent activator of KCNQ complexes for the treatment of channelopathies. All of the electrophysiological studies presented in this thesis were conducted in Xenopus oocytes. Unexpectedly, during the studies described above, the quality of our Xenopus oocytes declined. The afflicted oocytes developed black foci on their membranes, had negligible electric resting potentials, and poor viability. Culturing the compromised oocytes determined that they were infected with multi-drug resistant Stenotrophomonas maltophilia, Pseudomonas fluorescens and Pseudomonas putida. Antibiotic testing showed that all three species of bacteria were susceptible to amikacin and ciprofloxacin, which when included in the oocyte storage media prevented the appearance of black foci and resulted in oocytes that were usable for electrophysiological recordings. This study provides a solution to a common issue that plagues many electrophysiologists who use Xenopus oocytes. Taken together, these findings provide new insights into activation of KCNQ channel complexes and provide new tools to study the structure-function relationship of voltage-gated K+ channels.

Submitted by Clebson Anjos (clebson.leandro54@gmail.com) on 2016-03-30T18:39:51Z No. of bitstreams: 1 arquivototal.pdf: 1445770 bytes, checksum: 93635c33711265255604ec58e14b9042 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-03-30T18:39:51Z (GMT). No. of bitstreams: 1 arquivototal.pdf: 1445770 bytes, checksum: 93635c33711265255604ec58e14b9042 (MD5) Previous issue date: 2015-08-27 / Conselho Nacional de Pesquisa e Desenvolvimento Científico e Tecnológico - CNPq / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES / The process of discovering new drugs that act on the smooth muscle layer causing vascular relaxation is of fundamental importance in the treatment of cardiovascular diseases. In this context highlights the isatin, a versatile substance found in various tissues of mammals and plants which can easily undergo structural changes to yield new substances. The pharmacological effects of four novel drugs derived from isatin (IS-AK1, IS-BK1, B-001 and D-001) on the cardiovascular system using techniques in vivo and in vitro. In in vitro studies, cranial mesenteric rings from rat were kept in vats containing Tyrode at 37 ° C gassed with carbogen then they were fixed to a force transducer (PowerLab™, ADInstruments, MA, EUA) and coupled to a data acquisition system (WinDaq/XL, DI 148-U, Insight, Brasil) under tension 0.75 g, for 1 hour. After this period, the preparations were pre-contracted with phenylephrine (PHE, 10 μM) and KCl (60 mM) and then increasing concentrations of isatin derivatives were added cumulatively. All tested compounds showed vasorelaxant effect and IS-AK1 the most promising compound for presenting higher power when both in presence and in absence of endothelium compared to others (pD2 = 7.99 ± 0.11 and 7.95 ± 0.15, respectively), but these vasorelaxant responses were not different (Emax = 85.69 ± 5.18% vs. 74.62 ± 5.33%) in presence or in absence of endothelium. Therefore, IS-AK1 was then was selected for further studies in order to investigate its mechanism of action of the compound by concentration-response curves in the presence of blockers ODQ (10 μM), cyclase blocker soluble guanylyl; TEA 3 (mM) nonspecific blocker of K+ channels; TEA (1 mM) BKCa blocker; GLIB (1 μM), KATP blocker; 4-AP (1 mM) KV blocker and BaCl2 (30 μM), KIR blocker. In the presence of ODQ vasorelaxation was significantly attenuated (Emax = 39.68 ± 6.56%; pD2 = 5.07 ± 0.2, n = 6). In addition, in the presence of TEA 3 mM (Emax = 43.53 ± 8.16%, 6.72 pD2 ± 0.2, n = 6) and presence of TEA 1 mM (Emax = 39 72 ± 7.86%; pD2 = 5.63 ± 0.2, n = 6) vasorelaxant response were reduced. There was reduction in the power of the IS-AK1 when blocked by GLIB (pD2 = 7.23 ± 0.17, n = 5), 4-AP (pD2 = 7.1 ± 0.17, n = 5) and BaCl2 (pD2 = 6.23 ± 0.16, n = 5), suggesting the participation of different types of K+ channels in this response. For in vivo studies, changes in blood pressure and heart rate were investigated in non-anesthetized rats treated acutely with the IS-AK1. The IS-AK1 administration (10 mg/kg) produced blood pressure and bradycardia both in normotensive (-50 ± 12 mmHg -258 ± 40 bpm, n = 7) and hypertensive rats (-99 ± 7 mmHg, -278 ± 40 bpm, n = 6) with effects more pronounced in hypotensor effect in hypertensive rats. Thus, the vasorelaxant response promoted by IS-AK1 possibly involves the participation of sGC enzyme, thereby leading to the activation of PKG causes activation of K+ channels, KATP, KV, KIR and especially BKCa types. This mechanism of action may be contributing to hypotension and bradycardia observed in non-anesthetized rats. / O processo de descoberta de novas drogas que atuam na camada muscular lisa causando relaxamento vascular tem importância fundamental no tratamento de doenças cardiovasculares. Neste contexto, destaca-se a isatina, uma substância bastante versátil encontrada em diversos tecidos de mamíferos e de plantas que pode facilmente sofrer modificações estruturais para dar origem a novas substâncias. Neste contexto foram estudados os efeitos farmacológicos de quatro novas drogas derivadas da isatina (IS-AK1, IS-BK1, B-001 e D-001) sobre o sistema cardiovascular, utilizando-se técnicas in vivo e in vitro. Nos estudos in vitro, anéis de mesentérica cranial isolada de rato foram mantidos em cubas contendo Tyrode a 37 ºC gaseificado com carbogênio, em seguida foram fixados a um transdutor de força (PowerLab™, ADInstruments, MA, EUA) e acoplado a um sistema de aquisição de dados (WinDaq/XL, DI 148-U, Insight, Brasil) sob tensão de 0,75 g, durante 1 hora. Após este período, as preparações foram pré-contraídas com fenilefrina (FEN, 10 μM) ou KCl (60 mM) e em seguida, concentrações crescentes dos derivados da isatina foram adicionadas cumulativamente. Todos os compostos testados apresentaram efeito vasorrelaxante, sendo o IS-AK1 o composto mais promissor por apresentar maior potência tanto na presença como na ausência do endotélio (pD2 = 7,99 ± 0,11 e 7,95 ± 0,15, respectivamente). Entretanto, as respostas vasorrelaxantes máximas não foram diferentes (Emax = 85,69 ± 5,18 % vs. 74,62 ± 5,33 %) na presença e na ausência de endotélio. Portanto, o IS-AK1 foi selecionado para estudos subsequentes afim de investigar seu mecanismo de ação por meio de curvas concentração-resposta ao composto na presença dos bloqueadores ODQ (10 μM), bloqueador da ciclase de guanilil solúvel; TEA (3 mM), bloqueador inespecífico de canais para K+; TEA (1 mM), bloqueador de BKCa; GLIB (1 μM), bloqueador de KATP; 4-AP (1 mM), bloqueador de Kv e BaCl2 (30 μM), bloqueador de KIR. Na presença do ODQ, o vasorrelaxamento foi significativamente atenuado (Emax = 39,68 ± 6,56 %; pD2 = 5,07 ± 0,2, n = 6). Além disso, a resposta vasorrelaxante foi reduzida na presença de TEA (3 mM), (Emax = 43,53 ± 8,16 %; pD2 6,72 ± 0,2, n = 6) e na presença de TEA (1 mM) (Emax = 39,72 ± 7,86 %; pD2 = 5,63 ± 0,2, n = 6). Ocorreu redução na potência do IS-AK1 quando bloqueado por GLIB (pD2 = 7,23 ± 0,17, n = 5), 4-AP (pD2 = 7,1 ± 0,17, n = 5) e BaCl2 (pD2 = 6,23 ± 0,16, n = 5), sugerindo a participação de diferentes canais para K+ nesta resposta. Para os estudos in vivo, foram investigadas as alterações na pressão arterial e frequência cardíaca em ratos não-anestesiados tratados agudamente com o IS-AK1. A administração de IS-AK1 (10 mg/kg) produziu hipotensão e bradicardia tanto em ratos normotensos (-50 ± 12 mmHg, -258 ± 40 bpm, n = 7) quanto em ratos hipertensos (-99 ± 7 mmHg, -278 ± 40 bpm, n = 6) com efeito mais pronunciado no efeito hipotensor em ratos hipertensos. Deste modo, a resposta vasorrelaxante promovida pelo IS-AK1 parece envolver a participação da enzima sGC, consequentemente levando a ativação da PKG, ocasionando a ativação de canais para K+ do tipo KATP, KV, KIR e, principalmente, BKCa. Este mecanismo de ação pode estar contribuindo para a hipotensão e bradicardia observadas em ratos não-anestesiados.

Made available in DSpace on 2015-05-14T12:59:56Z (GMT). No. of bitstreams: 1 arquivototal.pdf: 2116236 bytes, checksum: d980c77ceebcbdbba85d747746d497be (MD5) Previous issue date: 2012-02-16 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES / The flavonoid 3,6-dimethyl ether galetin (FGAL) was isolated from aerial parts of Piptadenia stipulacea (Benth.) Ducke. In previous studies, Macêdo et al. (2011a) demonstrated that FGAL inhibited in a significant and concentration-dependent manner the phasic contractions induced by carbachol and oxytocin on rat uterus, in a higher potency to oxytocin. The aim of this study was to investigate the mechanism of tocolytic action of FGAL on rat uterus. Segments of rat uterus were suspended in organ bath and the isometric contractions were monitored. FGAL inhibited (pD 2 = 5.68 ± 0.06) oxytocin cumulative curves and these were shifted to the right, in a non parallel manner (slope = 3.59 ± 0.04), with Emax the reduction, suggesting a non-competitive antagonism. In relation to the tonic contractions, FGAL relaxed in a concentration-dependent and significant manner but not equipotent rat uterus pre-contracted both oxytocin (pD2 = 6.9 ± 0.1) and KCl (pD2 = 5.6 ± 0.06). How the opening channels for calcium-dependent voltage (CaV) is one of the common step to the signaling pathways of oxytocin and KCl to maintain the tonic phase of contraction, raised the hypothesis that FGAL could be acting by blocking the influx of Ca2+ through the CaV. Therefore, cumulative contractions were induced with CaCl2 in depolarizing medium nominally without Ca2+ in the presence and absence of several concentrations of FGAL. The flavonoid antagonized the contractions induced by CaCl2 evidenced by shift to the right of the control curve in a non parallel manner with reduction of Emax, suggesting that FGAL is blocking indirectly the CaV to promote tocolytic effect on rat uterus. The K+ channels play a key role in membrane potential regulation and CaV modulation. According to this premise, we decided to investigate the involvement of these channels in the tocolytic action of FGAL. The relaxing potency of FGAL (pD2 = 6.9 ± 0.1) were reduced approximately 20 folds in the presence of CsCl (pD2 = 5.6 ± 0.01), a non-selective K+ channels blocker, confirming K+ channels the participation to the relaxant effect of the flavonoid. To determinated which K+ channel(s) subtype(s) were involved, selective blockers of these channels were used. The relaxation curve induced by FGAL was shifted to right in the presence of 4-aminopyridine (pD2 = 5.4 ± 0.01), a selective blocker of voltage gated K+ channels (KV); of glibenclamide (pD2 = 5.3 ± 0.01), a selective blocker of ATP sensitive K+ channels (KATP); of apamin (6.3 ± 0.02), a selective blocker of small conductance calcium-activated K+ channels (SKCa) and tetraethylamonium (TEA+) 1 mM (pD2 = 5.0 ± 0.08), a big conductance calcium-activated K+ channels (BKCa), suggesting the involvement of these channels on tocolytic action mechanism of FGAL on rat uterus. The aminophylline, a non selective inhibitor of phosphodiesterases (PDE), did not potentialized (pD2 = 6.7 ± 0.03) the relaxation produced by FGAL on rat uterus, suggesting that the cyclic nucleotides pathway is not involved on relaxing effect induced by FGAL. Thus, we concluded that the relaxing action mechanism of FGAL in rat uterus involves positive regulation of K+ channels, that indirectly modulated the CaV, leading to a consequent reduction of [Ca2+]c and uterine smooth muscle relaxation. / O flavonoide 3,6-dimetil éter galetina (FGAL) foi isolado das partes aéreas de Piptadenia stipulacea (Benth.) Ducke. Em estudos anteriores, Macêdo et al. (2011a) demonstraram que FGAL inibiu de maneira dependente de concentração as contrações fásicas induzidas por carbacol e ocitocina em útero isolado de rata, sendo mais potente para ocitocina. Desta forma, o objetivo desse estudo foi investigar o mecanismo de ação tocolítica de FGAL em útero de rata. Para tanto segmentos de útero de rata foram suspensos em cuba para órgãos isolados e as contrações isométricas foram monitoradas. FGAL inibiu (pD´2 = 5, 68 ± 0,06) as curvas cumulativas à ocitocina e estas foram desviadas para direita, de forma não paralela ( slope = 3,59 ± 0,04), com redução do Emax, sugerindo um antagonismo não competitivo. Em relação às contrações tônicas, FGAL relaxou de maneira significante, dependente de concentração e não equipotente o útero pré-contraído tanto por ocitocina (pD2 = 6,9 ± 0,1) como por KCl (pD2 = 5,6 ± 0,06). Como a abertura dos canais para cálcio dependentes de voltagem (CaV) é um dos passos comum às vias de sinalização da ocitocina e do KCl para manutenção da fase tônica da contração, levantou-se a hipótese de que FGAL poderia estar agindo por bloqueio do influxo de Ca2+ através dos CaV. Assim, foram induzidas contrações cumulativas com CaCl2 em meio despolarizante e nominalmente sem Ca2+ na presença e na ausência de várias concentrações de FGAL. O flavonoide antagonizou as contrações induzidas pelo CaCl2 evidenciado pelo desvio da curva controle para a direita de maneira não paralela e com diminuição do efeito máximo. Sugerindo assim que FGAL bloqueia de maneira indireta os CaV para promover efeito tocolítico em útero de rata. Os canais para K+ desempenham um papel chave na regulação do potencial de membrana e modulação dos CaV. Diante dessa premissa, decidiu-se investigar a participação desses canais na ação tocolítica de FGAL. A potência relaxante de FGAL (pD2 = 6,9 ± 0,1) foi reduzida em aproximadamente 20 vezes na presença de CsCl (pD2 = 5,6 ± 0,01), bloqueador não seletivo dos canais para K+, confirmando a participação de canais para K+ no efeito relaxante do flavonoide. Para determinar qual(is) canal(is) para K+ estariam envolvidos usou-se bloqueadores seletivos desses canais. A curva de relaxamento induzida por FGAL foi desviada para direita na presença de 4 -aminopiridina (pD2 = 5,4 ± 0,01), um bloqueador seletivo dos canais para K+ ativados por voltagem (KV); de glibenclamida (pD2 = 5,3 ± 0,01), um bloqueador seletivo dos canais para K+ ativados por ATP (KATP); de apamina (6,3 ± 0,02), um bloqueador seletivo dos canais para K+ de pequena condutância ativados por cálcio (SKCa) e tetraetilamônio 1 mM (pD2 = 5,0 ± 0,08), que nesta concentração é um bloqueador seletivo dos canais para K+ de grande condutância ativados por cálcio (BKCa), sugerindo o envolvimento destes canais no mecanismo de ação tocolítica de FGAL em útero isolado de rata. A aminofilina um inibidor não seletivo de fosfodiesterases (PDE) não potencializou (pD2 = 6,7 ± 0,03) o relaxamento produzido por FGAL em útero de rata, sugerindo que não há participação da via dos nucleotídios cíclicos no efeito relaxante induzido por FGAL. Conclui-se que o mecanismo de ação tocolítica de FGAL em útero de rata envolve a modulação positiva de canais para K+, majoritariamente dos BKCa, que modulam indiretamente os CaV, levando ao relaxamento da musculatura lisa uterina.

O diabete melito é um grupo de doenças metabólicas caracterizadas por hiperglicemia, resultado de deficiências na secreção de insulina, em sua acção ou ambos. A pioglitazona é um hipoglicemiante oral, da classe da tiazolidinedionas, que atuam pela ligação aos receptores nucleares PPARY melhorando o estado de resistência a insulina. Acredita-se que a pioglitazona também restauram a capacidade da célula beta pancreática de secretar insulina, cuja atividade é regulada pelos canais de potássio dependente de ATP (KATP) e suas subunidades SUR1 e KIR6.2. Este estudo teve como objetivo iniciar um estudo farmacogenômico da pioglitazona em indivíduos diabéticos tipo 2 e na expressão dos genes PPARY PPARY2, SUR1 e KIR6.2 no sangue periférico e no tecido adiposo e associá-los com os polimorfismo Pro12Ala e C161T do gene PPARY. Foram selecionados 36 pacientes diabéticos do tipo 2 e 16 pacientes normoglicêmicos, no Instituto Dante Pazzanese de Cardiologia. Os indivíduos diabéticos foram tratados com pioglitazona (15, 30 e 45 mg/ dia/ via oral) por 16 semanas. Foram colhidas amostras de tecido adiposo por biopsia e de sangue, antes e após o tratamento para determinação de exames laboratoriais, extração de DNA genômico e de RNA total. Os polimorfismos foram detectados pela técnica de PCR-RFLP e a expressão de mRNA foi quantificada e avaliada por RT-PCR em tempo real. Após tratamento com pioglitazona, observou-se no sangue periférico aumento de expressão de mRNA do PPARY, PPARY2 e KIR6.2, e diminuição da expressão de SUR1. Dados de analises no sangue periférico, demostraram que variação da expressão de mRNA do PPARY foi inversamente correlacionada com as variações de insulina, Homa-IR, Homa-Beta e positivamente com Colesterol Total. Em relação ao gene PPARY2, foi inversamente correlacionada com colesterol total. Variação da expressão de SUR1 foi inversamente correlacionada com Hb1Ac, Homa-IR, Homa-Beta e positivamente com insulina. Não foram detectadas diferenças entre a expressão de mRNA de KIR6.2 e parâmetros bioquímicos em resposta às variações pioglItazona. Não houve diferença da resposta terapêutica e presença dos polimorfismos Pro12Ala e C161T. Após o tratamento, no tecido adiposo, a expressão de mRNA de PPARY aumentou. Não foram observadas diferenças na expressão dos genes PPARY2, SUR1 e KIR6.2. Em leucócitos totais de sangue periférico, pioglitazona demonstrou regular a expressão dos genes PPARY e PPARY2, e também atuando sobre as subunidades SUR1 e KIR6.2, possivelmente restaurando a função secretora das células beta. No tecido adiposo, o tratamento confirma a atuação da pioglitazona sobre PPARY, melhorando o estado de resistência a insulina. / The diabetes mellitus is a group of metabolic diseases characterized by hyperglycemia, the result from insulin secretion or action deficiency, or both. Pioglitazone is an oral hypoglycemic drug, included in the class of thiazolidinediones, which work by binding to nuclear receptors PPARY nuclear what improve the state of resistance to insulin. Pioglitazone may also restore the ability of the pancreatic beta cell to secrete insulin, process which is regulated thought ATP dependent potassium channels (KATP) and its subunits SUR1 and KIR6.2. The aim of our study was to begin a pharmacogenomic study of pioglitazone in type 2 diabetes patients by the expression of PPARY, PPARY2, SUR1 and KIR6.2 genes in peripheral blood leukocytes and fatty tissue and its association with the PPARY Pro12Ala and C161T polimorphisms. 36 type 2 diabetes and 16 normoglycemic patients were selected at the Dante Pazzanese Institute of Cardiology. The diabetic ones were treated with pioglitazone (15, 30 and 45 mg/ daily /orally) for 16 weeks. Samples of adipose - obtained through biopsy - and blood were collected before and after treatment to aim to laboratory experiments, DNA extraction and total RNA extraction. The polymorphisms were detected by the PCR-RFLP technique while the mRNA expression was quantified and evaluated by Real Time RT-PCR. After pioglitazone treatment, the expression of the PPARY, PPARY2 and KIR6.2 genes increased, while SUR1 decreased, all of them quantified in peripheral blood. Peripheral blood data has demonstrated that the variation of expression of PPARYmRNA is inversely correlated with insulin concentrations, Homa-IR, Homa-Beta and positively correlated with total cholesterol concentrations. Differently, PPARY2 gene expression was inversely correlated with total cholesterol blood concentrations. Variations in SUR1 mRNA expression were inversely correlated with Hb1Ac, Homa-IR, Homa-Beta and positively correlated with insulin. No differences were found between the KIR6.2 expression and biochemical parameters due to pioglItazone treatment. There was no difference in response to the treatment response and no Pro12Ala and C161T polymorphisms were noticed. After the treatment, the expression of PPARY gene increased in fatty tissue. No data showed differences in the expression of genes PPARY2, SUR1 and KIR6.2. Pioglitazone regulates the expression of genes PPARY and PPARY2, and also acts on the SUR1 and KIR6.2 subunits in total peripheral blood leukocyte likely restoring the function of secreting beta pancreatic cells. In adipose, the treatment reassures the functions of pioglitazone on PPARY, improving the state of insulin resistance.

O hiperinsulinismo congênito (CHI) é um distúrbio do pâncreas endócrino, mais freqüentemente causado por alterações dos canais de membrana KATP das células , resultando em secreção inapropriada de insulina e hipoglicemia severa e persistente nos recém-nascidos, que leva ao óbito ou a seqüelas neurológicas graves, se não diagnosticado a tempo. O diagnóstico depende da análise dos dados clínicos, laboratoriais, morfológicos e genético-moleculares (50% apresentam mutações dos canais KATP). As duas formas histopatológicas descritas requerem cirurgias radicalmente opostas: pancreatectomia quase-total (95-98%) na forma difusa que acomete todo o pâncreas, ou apenas exerese do foco adenomatoso de células , medindo em média 4,5 mm, na forma focal, e portanto a sua distinção é essencial durante o exame intra-operatório de congelação ou através de [18F]-L-Dopa PET-CT. Dez pacientes com CHI difuso e um com CHI focal, submetidos a pancreatectomia, foram analisados em relação a parâmetros clínicos, histopatológicos, de proliferação das células (IHQ de dupla marcação Ki-67 / insulina) e quanto à presença de mutações nos genes das únicas duas proteínas (SUR 1 e Kir 6.2) que formam os canais KATP, e comparados a 19 pâncreas controles normais da mesma faixa etária. Pacientes e controles foram estratificados em 3 meses e > 3 meses de idade. Nucleomegalia, ausente nos controles, foi observada apenas na forma difusa. Os critérios histológicos de maturação normalmente mais freqüentes nos controles 3 meses, foram freqüentemente observados nos recém-nascidos com CHI difuso > 3 meses, sugerindo um retardo na maturação do pâncreas endócrino destes pacientes. O índice de proliferação das células (Ki-67- LI), muito elevado nos focos adenomatosos da forma focal, foi útil na distinção destes focos dos agregados frouxos de ilhotas, histologicamente muito semelhantes, observados em dois casos difusos e um controle, que apresentam níveis de Ki-67-LI cerca de 10 vezes menor. Na forma difusa o Ki-67-LI também foi estatisticamente mais alto do que nos controles. Este é o primeiro estudo de pacientes com CHI no Brasil, e embora existam diferenças epidemiológicas entre os países relacionadas à determinação genética do CHI, não foram constatadas mutações ou novos polimorfismos nos exons 33-37 do gene ABCC8 (SUR 1) de 10/10 pacientes ou no único exon do gene KCNJ11 (Kir 6.2) de 4/10 pacientes / Congenital hyperinsulinism (CHI) is a rare pancreatic endocrine cell disease which most severe cases are found to be, at least in half of patients, associated with genetic defects in the -cell KATP channels. The aim of this study was to evaluate eleven Brazilian patients diagnosed, by standard criteria, as CHI non responsive to clinical therapy, and submitted to pancreatectomy, regarding: histology, -cell proliferation (IHC Ki-67 / insulin) and -cell KATP channels genes mutations in blood samples. For comparison of histology and -cell proliferation, 19 pancreatic control samples were included. According histology, ten patients were classified as diffuse and one as focal form. Nucleomegaly and -cells with abundant cytoplasm were absent in controls, and observed only in the group of diffuse CHI patients. Ki- 67-LI was useful to differentiate the adenomatous areas of the focal form CHI neonate from loose clusters of islets found in two diffuse form and one control samples. Proliferation was much higher in the focal CHI adenomatous areas, but diffuse CHI patients also have statistically higher Ki-67-LI than controls. This is the first genetic study of CHI patients in Brazil, and no mutations or new polymorphisms were found in the ABCC8 gene (SUR 1) (exons 33-37) or in the only exon of KCNJ11 gene (Kir 6.2) in 4/4 patients evaluated. On the other hand, enhanced -cell proliferation seems to be a constant feature in these patients both in diffuse and focal forms

Eine optimale Regulation der Koronardurchblutung ist für die Aufrechterhaltung der kardialen Pumpfunktion und damit der systemischen Perfusion von größter Bedeutung. Da Einschränkungen der Durchblutungszunahme des Herzmuskels Einschränkungen des maximalen myokardialen Sauerstoffverbrauchs und damit der Herzleistung zur Folge haben, ist es notwendig, die Koronardurchblutung kurzfristig an die jeweilige Stoffwechsellage des Herzens anzupassen (metabolische Koronarflussregulation). Die lokal-metabolischen Mechanismen gehören zu den wirksamsten Komponenten der Regulation der myokardialen Durchblutung und funktionieren auch am isolierten (denervierten) Herz. Dabei ist die hyperkapnie- und azidoseinduzierte Koronardilatation ein wesentlicher Bestandteil der metabolischen Koronarflussregulation. Die vorliegende Arbeit befasst sich mit der Hypothese der Abhängikeit der hyperkapnieinduzierten Koronardilatation von einer intakten NO-Produktion. Das Koronarsystem des isolierten WT-Mausherzens reagiert auf akute Hyperkapnie (91 % O2, 9 % CO2) mit einer deutlichen Koronarflusssteigerung von ca. 35 % über dem Basalfluss.Es konnte gezeigt werden das Stickstoffmonoxid (NO) und ATP-abhängige Kaliumkanäle (K+ATP-Kanäle) für die Koronarflussregulation der Maus eine ausschlagebende Rolle spielen und neben der Aufrechterhaltung des Basalflusses auch an der Vermittlung der hyperkapnieinduzierten Koronardilatation maßgeblich beteiligt sind.Interessanterweise ist bei einem Fehlen der endothelialen NO-Synthase durch genetischen Knockout die hyperkapnieinduzierte Flussantwort in Kinetik und Ausmaß vollständig erhalten. Die Vermittlung kann dabei durch andere Mechanismen kompensiert werden, wie zum Beispiel einer verstärkten Aktivität der K+ATP-Kanäle. Prostaglandine und neuronale NO-Synthase scheinen sowohl beim Wildtypherzen als auch bei Herzen mit fehlender NO-Synthase für die hyperkapnieinduzierte Koronardilatation von untergeordneter Bedeutung. Nach chronischer pharmakologischer Blockade der NO-Synthase durch zweiwöchige L-NAME Tränkung bleibt die hyperkapnieinduzierte Koronardilatation erhalten durch NOS-unabhängige Mechanismen. Die hyperkapnieinduzierte Flussantwort ist bei Herzen von weiblichen eNOSKO Tieren vorhanden, erscheint jedoch gegenüber den männlichen Mäusen geringer ausgeprägt. Daher wird vermutet, dass die Mediatorsysteme der endothelabhängigen Koronarflussregulation geschlechtsspezifisch bzw. geschlechtsabhängig sind.