The zygote and blastomeres of cleavage stage mouse embryos have the capacity to differentiate to the embryonic and both extra-embryonic lineages and are considered functionally totipotent. Until now, it has not been possible to establish stable cell lines that resemble these totipotent-like cells. In this work, I hypothesised that by modulating signalling pathways known to be important in early embryonic development it may be possible to capture in vitro a self-renewing state that possessed features of pre-implantation blastomeres. I succeeded in formulating a novel hypothesis driven cell culture medium which allowed the establishment of a stem cell state that possessed expanded differentiation potential to the embryonic and both extra-embryonic lineages in vitro and in vivo. These cells were isolated directly from in vitro culture of mouse pre-implantation embryos or single cell blastomeres, reprogrammed from somatic cells or converted from mouse ES cells. With these cells, I generated single cell chimeras which demonstrated extensive contribution to all lineages in the developing organism providing additional evidence that this chemical medium maintained a homogenous stem cell population. I demonstrated that the transcriptome of these cells was enriched with an early pre-implantation blastomere signature, distinct from other rare published totipotent-like cells. Finally, I demonstrated that the same chemical formulation permitted the establishment in vitro of a human stem cell state that possessed expanded differentiation potential to the embryonic and extra-embryonic lineage in vitro. My work has shown for the first time that through chemical modulation of pathways implicated to be involved in pre-implantation development, a novel homogenous stem cell state that possesses a pre-implantation transcriptional signature and expanded differentiation potential to both the embryonic and extra-embryonic lineage can be established and maintained in vitro in both mouse and human, suggesting a possible interspecies conservation of the signalling networks involved in early embryonic development.

IntroductionPreimplantation Genetic Diagnosis (PGD) was developed in the 1990s and has been used since to diagnose and discard embryos with genetic conditions or chromosomal abnormalities. CRISPR-Cas9 was discovered in 2012 and has been used in research, but has not become clinical practice on humans yet. CRISPR-Cas9 could potentially be applied to treat and prevent genetic disorders.AimThe aim was to investigate the ethical dilemmas of each method through a set of research questions. The ethics of applying PGD according to Swedish guidelines and applying CRISPR-Cas9 on humans was investigated.MethodologyThis was not a systematic literature review. Instead, articles have been selected based on their explanation of each method and uniqueness or volume of ethical arguments surrounding each method, that is of relevance for the discussed issues.ResultsArguments in favour of PGD addressed among other things the somatic and psychological health of future children and parents along with the economical benefits. Arguments against PGD addressed different dilemmas of discarding an embryo and thereby a future individual. Arguments against CRISPR-Cas9 addressed technical limitations, our limited knowledge of genetics and more. Arguments in favour addressed benefits in clinical medicine and research.ConclusionsPGD according to Swedish guidelines was found to be ethically acceptable, since its restrictive use that have not given room for ethically dubious applications. CRISPR-Cas9 was found not to be safe enough for human applications at this moment due to technical limitations. If these were to be solved, caution and restraint must be urged.

Ce travail de recherche vise à évaluer les enjeux éthiques posés par le recours au diagnostic anténatal dans le cadre des maladies génétiques à révélation tardive.Notre première étude a été d’analyser les décisions prises en réunions de Centres Pluridisciplinaires de Diagnostic Prénatal (CPDPN) et, à travers des situations réelles et singulières, relever les éléments de discussion et plus particulièrement ceux pouvant influencer la décision. Nous avons, ensuite réalisé deux enquêtes par questionnaires qui ont permis: 1) D’explorer le point de vue des personnes directement concernées par une telle pathologie (porteurs du gène responsable - malades ou asymptomatiques -, conjoints et/ou parents d’une personne porteuse du gène) ; 2) D’étudier la position des professionnels de la parentalité, travaillant en lien avec un CPDPN, et qui sont décideurs de la recevabilité ou non d’une demande de diagnostic anténatal dans ce contexte.Ce travail a ainsi contribué à faire émerger des questionnements pertinents sur le plan éthique et une réflexion sur de possibles évolutions législatives et sociétales dans ce domaine. / This research carries out with the aim of evaluating the ethical challenges faced by the use of antenatal diagnosis in late-onset genetic diseases.In a first study, we analysed the decisions of Multidisciplinary Centres for Prenatal Diagnosis (MCPD) and, through real and specific situations, we identified the elements for discussion and more particularly the ones that could influence the decision-making process. Then, we conducted two questionnaire surveys that allowed to: 1) Explore the viewpoints of people directly affected by this type of pathology (responsible gene carriers - ill or asymptomatic individuals -, partners and/or parents of gene carriers); 2) Examinate the opinions of professionals, working in association with a CPDPN and who are decision-makers of the acceptability or not for an antenatal diagnosis request in this context.This work has therefore brought out questions on ethics, and views on the potential legal and social developments in this area.

Les marqueurs épigénétiques, en particulier la méthylation de l’ADN des gènes soumis à empreinte parentale, sont sensibles aux changements environnementaux. Les techniques de l’aide médicalisée à la procréation (AMP) nécessitant la manipulation des gamètes et des embryons in vitro et dans la plupart des cas la stimulation hormonale de l’ovulation des patientes, peuvent interférer avec la reprogrammation et/ou le maintien de la méthylation des gènes soumis à empreinte. Afin d’évaluer ce risque nous avons analysé le profil de méthylation de KvDMR1, qui régule l’expression de KCNQ1OT1, dans des ovocytes humains mûris in vivo ou in vitro, provenant de patientes stimulées ou non. Nos résultats montrent que la mise en place de la méthylation au niveau de KvDMR1 se poursuit au cours de la maturation de l’ovocyte après reprise de la méiose, in vivo et in vitro et que la superovulation des patientes en AMP génère des ovocytes épigénétiquement immatures. Par ailleurs, l’étude de la méthylation de KvDMR1 et de H19 DMR (qui régule l’expression d’Igf2 et H19) dans des embryons issus d’ICSI, évolutifs ou présentant un défaut de développement, n’établit pas de lien entre les dérégulations de l’empreinte et l’arrêt du développement embryonnaire au stade blastocyste. / Epigenetic modifications, particularly DNA methylation of imprinted genes are sensible to environment. Techniques of assisted reproduction require in vitro manipulation of gamete and embryos and currently superovulation of patients. These technologies may interfere with eprogramming and maintenance of methylation at imprinted genes. To evaluate such a risk, we have determined the methylation profile of KvDMR1, the region that regulates KCNQ1OT1 imprinted gene, in human oocytes retrieved from stimulated or unstimulated cycles, at different phases of their maturation in vivo or in vitro. Our results show that the timing of establishment of the methylation profile of KvDMR1 covers the maturation phase of 199 oocyte growth, in vivo and in vitro, and that hyperstimulation likely recruits young follicles epigenetically immature. Analysis of the methylation profile of KvDMR1 and H19DMR (DMR of IGF2/H19) in ICSI embryos suggests that imprinting disorders are not responsible of embryo developmental failure prior the blastocyst stage

"Mémoire présenté à la Faculté des études supérieures en vue de l'obtention du grade de LLM en maîtrise option recherche axe Droit, Biotechnologies et Société" / Le diagnostic préimplantatoire (DPI), issu d'une alliance entre la procréation médicalement assistée et les techniques de diagnostic génétique, met à la disposition des êtres humains des conditions entièrement nouvelles pour le "contrôle de la qualité" des enfants. Sur la base d'un vaste ensemble de critères, telle choix du sexe ou l'élimination d'une maladie génétique, les parents peuvent désormais sélectionner leurs embryons créés par fécondation in vitro en fonction de leurs caractéristiques génétiques. Les applications du DPI suscitent toutefois de nombreuses questions. Pas surprenant que le DPI et ses différentes applications fassent l'objet d'un intense débat éthique; ils requièrent certes la mise en place d'un cadre normatif. En 2004, le Canada a finalement adopté la Loi concernant la procréation médicalement assistée et la recherche connexe (L.C. 2004, ch. 2). À titre de manipulation sur l'embryon, le DPI y est indirectement couvert. L'article 10 (2) établit en ce sens une condition générale concernant la modification, la manipulation, le traitement ou l'utilisation d'un embryon in vitro dont le régime de réglementation et d'autorisation en déterminera les limites. Nous pouvons à juste titre nous demander ce qu'il en sera dans le cas de chacune des applications du DPI. L'une d'entre elles, la sélection du sexe pour des raisons non médicales, est déjà prohibée en vertu du texte de loi. Que prévoiront les règlements pour les autres utilisations du DPI? Le gouverneur en conseil dispose du pouvoir pour désigner les catégories d'activités pouvant faire l'objet d'une autorisation ainsi que pour établir les modalités d'exercice de toute activité réglementée. De quelle nature seront ces règlements? Que doivent-ils ou peuvent-ils contenir? Je m'interroge sur le contrôle juridique des diverses applications de cette technique diagnostique. À cet égard, la France et le Royaume-Uni offrent des modèles normatifs fort intéressants pour le Canada. Au cours de cette analyse j'ai cherché à déterminer lequel de ces deux modèles est le plus adapté à la réalité canadienne en matière de procréation médicalement assistée et de DPI. J'ai d'autre part constaté que le choix d'un modèle dépend de notre position à l'égard de certaines questions éthiques telle l'importance de l'autonomie reproductive (i.e. la liberté de choix des embryons en fonction de critères établis par les individus). / Preimplantation genetic diagnosis (PGD), which results from an alliance between medically assisted reproduction and genetic diagnostic techniques, provides humans with an entirely new means of chiId "quality control." Based on a vast set of criteria, such as sex selection or the elimination of a genetic disorder, parents can now select embryos created via in vitro fertilization according to their genetic characteristics. These applications give rise to numerous questions. It is not surprising that PGD and its various applications are the subject of intense ethical debate; the implementation of a legislative framework is a definite necessity. ln 2004, Canada finally adopted the Act Respecting Assisted Human Reproduction and Related Research (S.C. 2004, ch. 2). PGD is indirectly covered under embryo manipulation. Section 10 (2) sets out general conditions concerning the modification, manipulation, treatment or use of an in vitro embryo-the limits of which are determined by the regulation and authorization framework. We may rightly ask what form this will take in each PGD application. One of them, sex selection for nonmedical reasons, is already prohibited in the text of the Act. What regulatory provisions will be made for other uses of PGD? The Governor-in-Council has the power to designate categories of activities that may be authorized and to establish conditions for the exercise of any regulated activity. What type of regulations will they be? What must they or should they contain? 1 have examined the judicial control of various applications of this diagnostic technique. Both France and the United Kingdom offer normative models of interest to Canada. During this analysis, 1 have endeavoured to determine which of these two models is most suited to the Canadian reality with respect to medically assisted reproduction and PGD. 1 thus noted that the choice of a model also depends on our position on certain ethical issues such as the importance of reproductive autonomy (i.e., freedom of choice of embryos according to criteria established by individuals).

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Le diagnostic préimplantatoire (DPI), issu d'une alliance entre la procréation médicalement assistée et les techniques de diagnostic génétique, met à la disposition des êtres humains des conditions entièrement nouvelles pour le "contrôle de la qualité" des enfants. Sur la base d'un vaste ensemble de critères, telle choix du sexe ou l'élimination d'une maladie génétique, les parents peuvent désormais sélectionner leurs embryons créés par fécondation in vitro en fonction de leurs caractéristiques génétiques. Les applications du DPI suscitent toutefois de nombreuses questions. Pas surprenant que le DPI et ses différentes applications fassent l'objet d'un intense débat éthique; ils requièrent certes la mise en place d'un cadre normatif. En 2004, le Canada a finalement adopté la Loi concernant la procréation médicalement assistée et la recherche connexe (L.C. 2004, ch. 2). À titre de manipulation sur l'embryon, le DPI y est indirectement couvert. L'article 10 (2) établit en ce sens une condition générale concernant la modification, la manipulation, le traitement ou l'utilisation d'un embryon in vitro dont le régime de réglementation et d'autorisation en déterminera les limites. Nous pouvons à juste titre nous demander ce qu'il en sera dans le cas de chacune des applications du DPI. L'une d'entre elles, la sélection du sexe pour des raisons non médicales, est déjà prohibée en vertu du texte de loi. Que prévoiront les règlements pour les autres utilisations du DPI? Le gouverneur en conseil dispose du pouvoir pour désigner les catégories d'activités pouvant faire l'objet d'une autorisation ainsi que pour établir les modalités d'exercice de toute activité réglementée. De quelle nature seront ces règlements? Que doivent-ils ou peuvent-ils contenir? Je m'interroge sur le contrôle juridique des diverses applications de cette technique diagnostique. À cet égard, la France et le Royaume-Uni offrent des modèles normatifs fort intéressants pour le Canada. Au cours de cette analyse j'ai cherché à déterminer lequel de ces deux modèles est le plus adapté à la réalité canadienne en matière de procréation médicalement assistée et de DPI. J'ai d'autre part constaté que le choix d'un modèle dépend de notre position à l'égard de certaines questions éthiques telle l'importance de l'autonomie reproductive (i.e. la liberté de choix des embryons en fonction de critères établis par les individus). / Preimplantation genetic diagnosis (PGD), which results from an alliance between medically assisted reproduction and genetic diagnostic techniques, provides humans with an entirely new means of chiId "quality control." Based on a vast set of criteria, such as sex selection or the elimination of a genetic disorder, parents can now select embryos created via in vitro fertilization according to their genetic characteristics. These applications give rise to numerous questions. It is not surprising that PGD and its various applications are the subject of intense ethical debate; the implementation of a legislative framework is a definite necessity. ln 2004, Canada finally adopted the Act Respecting Assisted Human Reproduction and Related Research (S.C. 2004, ch. 2). PGD is indirectly covered under embryo manipulation. Section 10 (2) sets out general conditions concerning the modification, manipulation, treatment or use of an in vitro embryo-the limits of which are determined by the regulation and authorization framework. We may rightly ask what form this will take in each PGD application. One of them, sex selection for nonmedical reasons, is already prohibited in the text of the Act. What regulatory provisions will be made for other uses of PGD? The Governor-in-Council has the power to designate categories of activities that may be authorized and to establish conditions for the exercise of any regulated activity. What type of regulations will they be? What must they or should they contain? 1 have examined the judicial control of various applications of this diagnostic technique. Both France and the United Kingdom offer normative models of interest to Canada. During this analysis, 1 have endeavoured to determine which of these two models is most suited to the Canadian reality with respect to medically assisted reproduction and PGD. 1 thus noted that the choice of a model also depends on our position on certain ethical issues such as the importance of reproductive autonomy (i.e., freedom of choice of embryos according to criteria established by individuals). / "Mémoire présenté à la Faculté des études supérieures en vue de l'obtention du grade de LLM en maîtrise option recherche axe Droit, Biotechnologies et Société"

Univ., Diss.-2005 u.d.T.: Fumagalli, Manuel Angelo: Die immanenten Schranken des pränatalen Familienrechtsverhältnisses--Hamburg, 2004. / Literaturverz. S. 303 - 328.

The aim of this dissertation thesis is to emphasize the sense of extended cultivation of embryos to the stadium of blastocyst and its influence on success of assisted reproduction and facilitation of pre implantation diagnosis, analysis of cultivation media and derivation of human embryonic stem cells. Author summarizes current literary findings in assisted reproduction and examines the currently used methods. Author also submits his own published experimental works, in which he compares his own results of infertility treatment with usage of extended cultivation to blastocyst with results of other techniques. Furthermore author submits his own published experimental works which are using extended cultivation for pre implantation diagnosis and its improvement. Another experimental works includes possibility of stem cells derivation. Usage of extended cultivation to blastocyst convincingly leads, according to author's own experiments and simultaneously to available literary findings, to higher success of infertility treatment. This is especially significant by middle-aged mothers. Sufficient term of cultivation enables not just selection, but also biopsy and its generic treatment. Long-term cultivation also enables analysis of cultivation media - but these didn't met the expectations for increase of...

Orientador: Ione Pellegatti Lemonica / Banca: João Lauro Viana de Camargo / Banca: Márcia Guimarães da Silva / Banca: Silvana Lima Górniak / Banca: Regiane Kawakami / Tese não possui um resumo geral, possue um resumo para cada capítulo / Resumo : O objetivo do presente estudo foi verificar, experimentalmente, o possível mecanismo pelo qual o extrato aquoso de Plectranthus barbatus (boldo-brasileiro), planta utilizada popularmente como abortiva, atua sobre o organismo materno ou sobre o desenvolvimento do concepto durante o período de pré-implantação, correlacionando sua ingestão com possíveis alterações no transporte e desenvolvimento embrionário ou com alterações hormonais maternas...(Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract : The present study was conducted to determine the possible mechanism by which the aqueous extract of Plectranthus barbatus (brazilian-boldo), a plant used popularly as abortive agent, can lead to early loss of pregnancy, correlating this possible effect with morphological alterations in the embryo, oviductal motility dysfunctions or maternal hormonal level modifications...(Complete abstract, access undermentioned electronic address) / Doutor