O remifentanil é um opióide potente comparável ao fentanil, mas, possui rápida eliminação plasmática e por isso necessariamente deve ser adiministrado por infusão contínua. A administração transdérmica pode liberar fármacos de forma prolongada, contínua e controlada. Características que facilitariam a administração do remifentanil, contornariam sua limitação farmacocinética e ampliariam os casos em que este fármacos seria útil. Lipossomas deformáveis são formados por fosfolipídios e por tensoativo que normalmente é um surfactante de cadeia simples que aumenta a flexibilidade da bicamada lipídica da membrana e torna os lipossomas deformáveis. Os lipossomas deformáveis são capazes de disponibilizar, de forma expressiva, várias substâncias transdermicamente incluindo macromoléculas e podem ser um eficiente sistema de liberação controlada de remifentanil. O presente estudo desenvolve diferentes dispersões de lipossomas deformáveis de remifentanil e caracteriza essas dispersões quanto a tamanho de diâmetro dos lipossomas, eficiência de encapsulação dos lipossomas, elasticidade da membrana, permeação e retenção cutânea in vitro. As dispersões de lipossomas deformáveis preparadas foram compostas por remifentanil, fosfatidilcolina de soja, tensoativo tween 80 ou tween 20 e etanol a 10% ou a 20% e foram preparadas por dois métodos: sonicação e hidratação de filme e sonicação. O tamanho e a distribuição de tamanho foram obtidos por espalhamento dinâmico de luz, a eficiência de encapsulação por diálise, a elasticidade por filtração, seguido de determinação do tamanho. Células de difusão de Franz e pele de orelha de porco foram usadas para estudar a permeação e a retenção cutânea in vitro. Os lipossomas deformáveis preparados apresentaram pequeno diâmetro (40 a 71 nm) quando comparado a outros na literatura e seus tamanhos foram dependentes da formulação. Todos os lipossomas deformáveis preparados apresentaram boa elasticidade e permeação dependente da eficiência de encapsulação e do tamanho de diâmetro. A solução hidroetanólica com remifentanil e a mistura física dos excipientes com remifentanil não apresentaram permeação e retenção. A eficiência de encapsulação dos lipossomas deformáveis é coerente com outros resultados na literatura e foi dependente da formulação e do método de preparação. A avaliação da permeação de dispersões de lipossomas deformáveis com remifentanil não encapsulado foi feita para se obter informações sobre os mecanismos de ação pelos quais estes lipossomas agem. Verificou-se que o transporte de substâncias encapsuladas nos lipossomas foi o mecanismo de maior importância / Remifentanil is a potent opioid comparable to fentanyl. Remifentanil has rapid systemic elimination and, therefore, it necessarily has to be administered by continuous parenteral infusion. Transdermal delivery can provide extended, continuous and controlled delivery of drug. Characteristics that could make the remifentanil administration easier, could resolve its phamacocinetcs limitation and could enlarge the cases that this drug would be useful. Deformable liposomes consist of phospholipid and surfactant that is often a single chain surfactant that increases the membrane lipid bilayer flexibility and makes the liposome deformable. Deformable liposomes are able to expressively improve skin delivery of many drugs, including macromolecules and could be an efficient controlled delivery system of remifentanil. The aim of this study has been to develop different deformable liposomes dispersions of remifentanil and to characterize those dispersions by liposome diameter size, liposome entrapment efficiency, membrane elasticity and in vitro skin permeation and deposition. The deformable liposomes consisted of remifentanil, soybean phosphatidylcholine, surfactant tween 80 or tween 20, and ethanol at 10% or 20%. They have been prepared by two methods: sonication or conventional mechanical dispersion and sonication. The size was determined by light scattering, the entrapment efficiency by dialysis, the membrane elasticity by filtration and size determination. Franz diffusion cells and ear porcine skin wore used to evaluate the in vitro skin permeation and the skin deposition. The deformable liposomes showed small size (40 a 71 nm) compared with others from literature and their sizes wore dependent of the formulation. All deformable liposomes showed good membrane elasticity and showed permeation that was dependent of the formulation and diameter size. The remifentanil hidroetanolic solution and the excipients physical mixture with remifentanil did not have any permeation and retention. The deformable liposomes entrapment efficiency has been coherent with others literature results and also was dependent of the formulation and preparation method. The permeation of deformable liposomes dispersions wore evaluated to get information about the deformable liposome action mechanisms. The transport of encapsulated substances on liposome was the action mechanism of major importance.

A indústria dos citros é de grande importância econômica e social para o Brasil, que é considerado o maior produtor e exportador de suco concentrado de laranja do mundo. Porém, sérios problemas relacionados a doenças têm afetado a produção e qualidade dos citros. Com o desenvolvimento da engenharia genética e a clonagem de genes relacionados à resistência a doenças em plantas, a transformação genética têm se mostrado uma ferramenta auxiliar a programas de melhoramento genético de citros. O objetivo deste trabalho foi a obtenção de plantas transgênicas de laranja doce das variedades ‘Hamlin’, ‘Valência, ‘Natal’ e ‘Pêra’ expressando o gene hrpN, sob o controle do promotor Pgst1, induzível pelo patógeno. A avaliação da resposta de plantas transgênicas da variedade ‘Hamlin’ contra o agente causal do cancro cítrico, a bactéria Xanthomonas axonopodis pv. citri, também foi realizada. Segmentos de epicótilo foram transformados via Agrobacterium tumefaciens, e selecionados em meio de cultura suplementado com canamicina ou gentamicina. A transformação genética foi confirmada por PCR e Southern blot. A transcrição do gene foi avaliada por RT-PCR e a produção da proteína harpina foi analisada por western blot. A eficiência de transformação variou de 2,7 e 6,2% de acordo com a variedade de laranja. Algumas linhagens de plantas transgênicas apresentaram desenvolvimento anormal, não permitindo a realização da análise por Southern blot nem a multiplicação por enxertia. Plantas de laranja ‘Hamlin’ foram propagadas por enxertia e avaliadas para resistência a Xanthomonas axonopodis pv. citri. Todas as linhagens apresentaram redução na severidade dos sintomas causados pela bactéria X. axonopodis pv. citri, avaliados 30 dias após a inoculação. / The citrus industry has a great economic and social importance for Brazil, which is considered largest producer and orange juice exporter in the world. However, serious problems related to pathogens have affected citrus production and quality. With the development of genetic engineering and the characterization of genes related with plant disease resistance, the genetic transformation became an important tool in citrus breeding programs. The objective of this work was the production of transgenic plants of four sweet orange cultivars ‘Hamlin’, ‘Valencia’, ‘Natal’ and ‘Pera’ expressing hrpN gene under the control of Pgst1 inducible promoter. The evaluation of ‘Hamlin’ sweet orange transgenic plants infected with the causal agent of citrus canker, Xanthomonas axonopodis pv. citri was carry out. Epicotyl segments were inoculated with Agrobacterium tumefaciens, and selected in a culture medium supplemented with kanamycin or gentamycin. The genetic transformation was confirmed by PCR and Southern blot analysis. The gene transcription was evaluated by RT-PCR and the production of harpin protein was detected by western blot. The genetic transformation efficiency varied from 2,7% to 6,2% depending on the cultivar. Some transgenic lines had abnormal development, not allowing performing Southern blot analysis or multiplication by grafting. Plants of ‘Hamlin&#146 sweet orange were propagated by grafting and evaluated for Xanthomonas axonopodis pv. citri resistance. All tested plants presented reduction in the severity of the symptoms caused by bacterium X. axonopodis pv. citri 30 days after the inoculation.

Catalisadores baseados em óxidos metálicos têm sido muito utilizados nos últimos anos para a desidrogenação oxidativa de alcanos leves. Dentre os principais catalisadores, estão os sistemas contendo V2O5, Nb2O5 e Al2O3. O processo de desidrogenação oxidativa do propano (DOP) representa uma via alternativa importante para a produção de propileno sob menores temperaturas, porém sua prática vem sendo limitada pela diminuição dos valores de seletividade ao propeno com o aumento da conversão do reagente. Metais alcalinos, dentre eles o potássio, são frequentemente utilizados como promotores em reações de oxidação seletiva com o objetivo de proporcionar melhores seletividades catalíticas aos mecanismos de reação, devido à redução da acidez e ao aumento da basicidade na superfície dos catalisadores. O projeto proposto tem como objetivo principal criar uma metodologia de síntese de novos suportes Nb2O5-Al2O3 e catalisadores V2O5-Nb2O5-Al2O3 dopados com potássio a serem utilizados em processos petroquímicos para a produção de olefinas leves. Para tanto, as seguintes técnicas de caracterização foram utilizadas: espectrometria de absorção atômica, espectroscopia de emissão atômica com plasma indutivamente acoplado (ICP-OES), volumetria de N2, difratometria de raios X (DRX) e redução à temperatura programada (RTP). As características ácidas e/ou básicas e a atividade catalítica dos suportes e catalisadores foram medidas pelas reações de decomposição do isopropanol e de desidrogenação oxidativa do propano, respectivamente. / Catalysts based on metal oxides have been extensively used in recent years for the oxidative dehydrogenation of light alkanes. Among the main catalysts, there are the systems containing V2O5, Nb2O5 e Al2O3. The oxidative dehydrogenation of propane (ODH) provides a potential low-temperature route for the synthesis of propylene, but its practice has been limited by a marked decrease in propene selectivity with increasing conversion of reactant. Alkali metals, such as potassium, are frequently used as promoters in selective oxidation reactions with the objective of providing higher selectivity in catalytic reaction mechanisms, due to the reduced acidity and increasing basicity of the catalysts surface. The considered project has as major objective create a new synthesis methodology of Nb2O5-Al2O3 supports and V2O5-Nb2O5-Al2O3 potassium-doped catalysts to be used in petrochemical processes for the production of light olefins. For in such a way, the following characterization techniques were used: atomic absorption spectrometry, inductively coupled plasma optic emission spectroscopy (ICP-OES), N2 volumetry, X-ray diffractometry (XRD) and temperature programmed reduction (TPR). The properties acid and/or basic and the catalytic activity of supports and catalysts were evaluated by the isopropanol decomposition and oxidative dehydrogenation of propane reactions, respectively.

BERTOLINI, WAGNER L. H. M. A influência do D-limoneno como promotor de absorção do ácido 5-aminolevulínico para Terapia Fotodinâmica do câncer de pele: avaliação in vitro e in vivo da permeação e retenção cutâneas. 2009 118f. Tese (Doutorado). Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Ribeirão Preto Preto Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto, 2009. O câncer é a segunda doença principal do planeta, muito próximo de se tornar a mais incidente. Os tratamentos tradicionais do câncer, tais como cirurgia, radioterapia e quimioterapia apresentam severos efeitos colaterais ao paciente devido à citotoxicidade que podem causar às células normais, além das cancerosas. Objetivando minimizar estes efeitos indesejáveis pesquisadores de diversas áreas afins vislumbram novas técnicas, novos tipos e formas de tratamentos que apresentem um melhor perfil terapêutico; que possam agir de forma mais seletiva contra as células cancerosas, minorando os efeitos indesejáveis em relação às células saudáveis. Dentre as técnicas pesquisadas destaca-se a Terapia Fotodinâmica (TFD). Esta é uma técnica de tratamento nova e promissora. A técnica do tratamento consiste em aplicar, no tecido alvo, substâncias fotossensibilizantes, posteriormente ativadas com luz de comprimentos de onda específicos, com a finalidade de produzir destruição celular, por meio da ação de produtos citotóxicos fotoativados. Destaca-se a seletividade apresentada pela técnica, que deve ser reconhecida como uma das vantagens entre as técnicas empregadas no tratamento do câncer. O presente trabalho objetiva verificar a influência do D-limoneno como promotor de permeação do ácido 5-aminolevulínico (5-ALA) em aplicação tópica. Isto visa aumentar a permeação do 5-ALA quando aplicado topicamente. O 5-ALA é convertido a protoporfirina-IX (PpIX) pela via do ciclo Heme. Esta é um potente agente fotossensibilizador endógeno. O interesse no uso deste promotor foi aumentar a taxa de penetração do 5-ALA, possibilitando a permeação de maiores quantidades do fármaco em questão. Para isto foram realizados estudos de permeação in vitro do 5-ALA, em concentração de 1% (p/p) utilizando-se formulações (emulsões O/A) com diferentes concentrações do promotor D-limoneno (0, 5, 10, 20 e 30%), (p/p). Observou-se que o fluxo in vitro do 5-ALA através da pele de orelha de porco aumentou para todas as formulações empregadas quando comparado ao controle, sem D-limoneno, para um período de estudo de 12h. A retenção no estrato córneo e na [epiderme + derme] apresentou aumento significativo, evidenciando, assim, um efeito eficiente do D-limoneno como promotor. Experimentos in vivo foram conduzidos em camundongos objetivando a análise do efeito da formulação na produção e acúmulo de PpIX na pele. Observou-se que o D-limoneno aumentou significantemente a quantidade de PpIX extraída da pele. Os resultados in vitro e in vivo mostraram o potencial do D-limoneno como promotor de absorção cutânea para o 5-ALA para a TFD tópica do cancer de pele. / BERTOLINI, WAGNER L. H. M. D-limonene influence in the cutaneous penetration enhancer for 5-aminolevulinic acid in photodynamic therapy of skin cancer: in vitro and in vivo skin permeation and retention studies. 2009 118f. Thesis (Doctoral). Faculdade de Ciências Farmacêuticas de Ribeirão Preto Preto Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto, 2009. The topical administration of 5-ALA has been distinguished on skin cancer photodynamic therapy (PDT) because of its efficiency in the treatment of tumors and the reduced phototoxic collateral effects. However, this effectiveness is limited by its low penetration in the skin. A proposal to optimize the 5-ALA penetration in the skin is the use of cutaneous penetration enhancers, which seek to alter the cutaneous barrier for many bioactive molecules. The aim of this work was the pharmaceutical development of formulations containing D-limonene as a cutaneous penetration enhancer, seeking the increase of the cutaneous penetration of 5-ALA for skin cancer PDT. The in vitro flux of 5-ALA present in 1% (w/w) from different formulations containing D-limonene (20 e 30% w/w) was significantly increased after 12 hours of experiment, in comparison with formulations without D-limonene, mainly for the formulations containing 20% and 30% of D-limonene with 1% of 5-ALA (1,45 and 2,01 times, respectively). The stratum corneum (SC) and [epidermis + dermis] without SC retention were also significantly increased, showing an enhancer effect of the promoter. In addition, in vivo experiments were accomplished in mice, with the purpose of analyzing the formulation effect on the PpIX production and accumulation in the skin. It was observed that the penetration enhancer\'s presence significantly increased the amount of PpIX extracted from the skin. Both in vitro and in vivo results showed the potentiality of the formulations containing D-limonene as a cutaneous penetration enhancer for 5-ALA delivery on the skin cancer PDT.

A conversão da proteína prion celular normal (PrPc), cuja função ainda esta sob investigação, para a forma infecciosa (PrPsc) é a causa de algumas doenças neurodegenerativas em humanos e animais. Vários estudos têm sido realizados e mostram que PrPc pode participar de processos normais como memória, estresse oxidativo, neuritogênese e outros. Portanto, a elucidação dos processos de regulação de sua expressão é importante tanto para definir uma estratégia para controlar a infecção quanto para entender melhor a função fisiológica de PrPc. Este trabalho tem por objetivo avaliar a expressão do gene de PrPc, a partir da regulação da atividade de seu promotor frente a drogas que foram eleitas de acordo com a composição dos elementos de resposta a fatores de transcrição nele contidos. Para isto o promotor foi clonado em um vetor contendo o gene \"reporter\" de luciferase, células C6 e PC-12 foram transfectadas e clones com expressão estável de luciferase foram selecionados. Os resultados dos tratamentos dos clones celulares mostram que éster de forbol (TPA) e AMPc induzem a atividade do promotor de 1,5 a 3 vezes, ácido retinóico (RA) diminui esta atividade em cerca de 50% enquanto que NGF e Dexametasona não têm efeito. A dependência da conformação da cromatina na regulação deste gene também foi testada utilizando-se Tricostatina A (TSA), esta droga foi capaz de aumentar de 10 a 4.000 vezes a atividade do promotor, o que foi seguida tanto pela indução de expressão do RNAm quanto da proteína PrPc. Este efeito parece não ser generalizado a todos os promotores uma vez que esta droga não alterou expressão de GAPDH e de β-actina. Quando TPA e AMPc foram associados à TSA uma potencialização do efeito indutor destas drogas foi observada e a associação de RA e TSA mostrou que RA reduz a indução gerada por TSA. Estes novos dados indicam que a regulação de PrPc é extremamente dependente da conformação da cromatina. / Conversion of the cellular normal prion protein (PrPc), whose physiological function is still under investigation, to an infectious form called prion is the cause of some neurodegenerative diseases. Therefore, the elucidation of PrPc gene regulation is important both to define a strategy to control the infection and to better understand PrPc function. We cloned the rat PrPc gene promoter region into a luciferase reporter vector, transfected C6 and PC-12 cells and isolated clones with stable luciferase expression. The phorbol ester TPA and cAMP induced promoter activity by 1.5 to 3 times, retinoic acid decreased it by 50% while NGF and dexamethasone had no effect. We also tested the dependence of chromatin conformation for PrPc promoter activity using Trichostatin A (TSA), which was able to highly increase not only promoter activity but also PrPc rnRNA and protein leveIs. Moreover, the TSA effect seems to be restricted since any alteration was observed regarding GAPDH (Glyiceraldehyde 3-phosphate desydrogenase) and β-actin expression. When cAMP, TPA or retinoic acid were associated with TSA a potentiation of their primary effects was observed. These new data indicate that PrPc gene regulation is highly dependent on disruption of chromatin fiber assembly what permits assess of trascription factors.

Catalisadores baseados em óxidos metálicos têm sido muito utilizados nos últimos anos para a desidrogenação oxidativa de alcanos leves. Dentre os principais catalisadores, estão os sistemas contendo V2O5, Nb2O5 e Al2O3. O processo de desidrogenação oxidativa do propano (DOP) representa uma via alternativa importante para a produção de propileno sob menores temperaturas, porém sua prática vem sendo limitada pela diminuição dos valores de seletividade ao propeno com o aumento da conversão do reagente. Metais alcalinos, dentre eles o potássio, são frequentemente utilizados como promotores em reações de oxidação seletiva com o objetivo de proporcionar melhores seletividades catalíticas aos mecanismos de reação, devido à redução da acidez e ao aumento da basicidade na superfície dos catalisadores. O projeto proposto tem como objetivo principal criar uma metodologia de síntese de novos suportes Nb2O5-Al2O3 e catalisadores V2O5-Nb2O5-Al2O3 dopados com potássio a serem utilizados em processos petroquímicos para a produção de olefinas leves. Para tanto, as seguintes técnicas de caracterização foram utilizadas: espectrometria de absorção atômica, espectroscopia de emissão atômica com plasma indutivamente acoplado (ICP-OES), volumetria de N2, difratometria de raios X (DRX) e redução à temperatura programada (RTP). As características ácidas e/ou básicas e a atividade catalítica dos suportes e catalisadores foram medidas pelas reações de decomposição do isopropanol e de desidrogenação oxidativa do propano, respectivamente. / Catalysts based on metal oxides have been extensively used in recent years for the oxidative dehydrogenation of light alkanes. Among the main catalysts, there are the systems containing V2O5, Nb2O5 e Al2O3. The oxidative dehydrogenation of propane (ODH) provides a potential low-temperature route for the synthesis of propylene, but its practice has been limited by a marked decrease in propene selectivity with increasing conversion of reactant. Alkali metals, such as potassium, are frequently used as promoters in selective oxidation reactions with the objective of providing higher selectivity in catalytic reaction mechanisms, due to the reduced acidity and increasing basicity of the catalysts surface. The considered project has as major objective create a new synthesis methodology of Nb2O5-Al2O3 supports and V2O5-Nb2O5-Al2O3 potassium-doped catalysts to be used in petrochemical processes for the production of light olefins. For in such a way, the following characterization techniques were used: atomic absorption spectrometry, inductively coupled plasma optic emission spectroscopy (ICP-OES), N2 volumetry, X-ray diffractometry (XRD) and temperature programmed reduction (TPR). The properties acid and/or basic and the catalytic activity of supports and catalysts were evaluated by the isopropanol decomposition and oxidative dehydrogenation of propane reactions, respectively.

No genoma de camundongo existem por volta de 1000 genes que codificam para receptores olfatórios (ORs) e 150 genes que codificam para receptores de feromônios do tipo 1 (V1Rs) distribuídos em vários cromossomos. Cada neurônio olfatório e vomeronasal seleciona um único alelo de um único gene de receptor OR ou de V1R, respectivamente, para expressar enquanto que o restante do repertório é mantido silenciado. Os mecanismos que regulam esse padrão de expressão não são conhecidos. As similaridades no padrão de expressão dos genes de ORs e de V1Rs sugerem que o mecanismo de regulação possa ser comum. Até então poucas regiões promotoras de genes de ORs e de genes de V1Rs haviam sido experimentalmente determinadas e pesquisadas. Realizamos uma análise na qual regiões a montante de um grande número de diferentes genes de ORs e de genes de V1Rs foram comparadas. Primeiro, utilizando a técnica de RLMRACE, combinada com o uso de oligonucleotídeos capazes de reconhecer regiões conservadas entre diversos membros das famílias de genes de ORs e de V1Rs, geramos centenas de cDNAs contendo a região 5UTR completa para um total de 198 genes de ORs e 39 genes de V1Rs diferentes. Então, alinhamos as sequências desses cDNAs contra o genoma de camundongo e localizamos a posição exata dos sítios de início da transcrição (TSSs) de cada gene. Extraímos seqüências a 5 dos TSSs dos 198 genes de ORs e dos 39 genes de V1Rs e buscamos por motivos de DNA comuns, presentes em várias dessas regiões promotoras, que pudessem ser 6 candidatos a elementos cis-atuantes envolvidos na regulação geral desses genes de receptores sensoriais. Identificamos, na grande maioria das regiões promotoras dos genes de ORs e dos genes de V1Rs analisadas, a presença de motivos semelhantes a sítios de ligação para os fatores de transcrição O/E que são fatores de transcrição já caracterizados e envolvidos com a expressão de genes específicos do sistema olfatório. Ensaios de EMSA mostraram que os motivos semelhantes aos sítios de ligação de O/E identificados interagem com proteínas nucleares de epitélio olfatório, mas não interagem com proteínas nucleares de cérebro e fígado. Identificamos também nas regiões promotoras de genes de V1Rs a presença de um sítio de ligação que não se assemelha a nenhum sítio de ligação de fatores de transcrição conhecido. Esse motivo de DNA, além de estar presente na maioria dos promotores de genes de V1Rs analisados (77% do total de 39 genes pesquisados), também aparece, com alta frequência, em promotores de genes de ORs (52% do total de 198 genes analisados), preferencialmente próximo aos TSSs. Ensaios de interação in vitro indicam que este novo motivo de DNA interage com proteínas nucleares extraídas de órgão vomeronasal e também de epitélio olfatório, mas não interage com proteínas nucleares de cérebro, fígado e pulmão. Nosso trabalho mostra que genes de ORs e de V1Rs compartilham elementos comuns em suas regiões promotoras os quais podem ser sítios de ligação de fatores de transcrição específicos do sistema olfatório envolvidos no mecanismo de regulação da expressão desses genes. / In the mouse genome there are approximately 1000 genes that encode olfactory receptors (ORs) and 150 genes that encode type 1 vomeronasal receptors (V1Rs) dispersed in various chromosomes. Each olfactory or vomeronasal neuron selects one single allele from one single receptor gene (OR or V1R) for expression while the rest of the repertoire remains silenced. The mechanisms underlying OR and V1R gene expression are still unknown. The similarities of the pattern of expression in both types of olfactory sensory neurons suggest that the regulation of OR and V1R gene expression may be under the control of a common mechanism. Until now, promoter regions of different OR and V1R genes had not been extensively analyzed. We carried out a comprehensive analysis in which the upstream regions of a large number of different OR and V1R genes were compared. First, using the RLM-RACE strategy, combined with degenerate PCR we generated hundreds of complete 5UTR cDNAs for a total of 198 OR genes and 39 V1R genes. Then, these cDNAs were aligned against the mouse genome sequence and the transcription start sites (TSSs) were precisely determined. Sequences upstream of the TSSs were retrieved and searched for common DNA motifs that may play a role as cis-acting elements involved in the general regulation of OR and V1R gene expression. The analysis revealed the presence of motifs that resemble O/E-like sites overrepresented in the OR and V1R promoter regions. These O/E-like motifs specifically interact with nuclear protein prepared from olfactory epithelium, but not from brain and liver. 8 We also identified a new motif that does not resemble any known transcription factor binding site. Besides, this new motif is present in 77% of the 39 V1R promoter regions and in 52% of the 198 OR promoter regions analyzed, preferentially concentrated near the TSSs. Interestingly, binding assays indicate that this new motif interacts with nuclear proteins prepared from the vomeronasal and the olfactory epithelia, but not from brain, liver and lung. Our results indicate that OR and V1R genes share common promoter elements that may be binding sites for specific olfactory transcription factors and may play a role in a common mechanism of olfactory and vomeronasal gene regulation

No genoma de camundongo existem por volta de 1000 genes que codificam para receptores olfatórios (ORs) e 150 genes que codificam para receptores de feromônios do tipo 1 (V1Rs) distribuídos em vários cromossomos. Cada neurônio olfatório e vomeronasal seleciona um único alelo de um único gene de receptor OR ou de V1R, respectivamente, para expressar enquanto que o restante do repertório é mantido silenciado. Os mecanismos que regulam esse padrão de expressão não são conhecidos. As similaridades no padrão de expressão dos genes de ORs e de V1Rs sugerem que o mecanismo de regulação possa ser comum. Até então poucas regiões promotoras de genes de ORs e de genes de V1Rs haviam sido experimentalmente determinadas e pesquisadas. Realizamos uma análise na qual regiões a montante de um grande número de diferentes genes de ORs e de genes de V1Rs foram comparadas. Primeiro, utilizando a técnica de RLMRACE, combinada com o uso de oligonucleotídeos capazes de reconhecer regiões conservadas entre diversos membros das famílias de genes de ORs e de V1Rs, geramos centenas de cDNAs contendo a região 5UTR completa para um total de 198 genes de ORs e 39 genes de V1Rs diferentes. Então, alinhamos as sequências desses cDNAs contra o genoma de camundongo e localizamos a posição exata dos sítios de início da transcrição (TSSs) de cada gene. Extraímos seqüências a 5 dos TSSs dos 198 genes de ORs e dos 39 genes de V1Rs e buscamos por motivos de DNA comuns, presentes em várias dessas regiões promotoras, que pudessem ser 6 candidatos a elementos cis-atuantes envolvidos na regulação geral desses genes de receptores sensoriais. Identificamos, na grande maioria das regiões promotoras dos genes de ORs e dos genes de V1Rs analisadas, a presença de motivos semelhantes a sítios de ligação para os fatores de transcrição O/E que são fatores de transcrição já caracterizados e envolvidos com a expressão de genes específicos do sistema olfatório. Ensaios de EMSA mostraram que os motivos semelhantes aos sítios de ligação de O/E identificados interagem com proteínas nucleares de epitélio olfatório, mas não interagem com proteínas nucleares de cérebro e fígado. Identificamos também nas regiões promotoras de genes de V1Rs a presença de um sítio de ligação que não se assemelha a nenhum sítio de ligação de fatores de transcrição conhecido. Esse motivo de DNA, além de estar presente na maioria dos promotores de genes de V1Rs analisados (77% do total de 39 genes pesquisados), também aparece, com alta frequência, em promotores de genes de ORs (52% do total de 198 genes analisados), preferencialmente próximo aos TSSs. Ensaios de interação in vitro indicam que este novo motivo de DNA interage com proteínas nucleares extraídas de órgão vomeronasal e também de epitélio olfatório, mas não interage com proteínas nucleares de cérebro, fígado e pulmão. Nosso trabalho mostra que genes de ORs e de V1Rs compartilham elementos comuns em suas regiões promotoras os quais podem ser sítios de ligação de fatores de transcrição específicos do sistema olfatório envolvidos no mecanismo de regulação da expressão desses genes. / In the mouse genome there are approximately 1000 genes that encode olfactory receptors (ORs) and 150 genes that encode type 1 vomeronasal receptors (V1Rs) dispersed in various chromosomes. Each olfactory or vomeronasal neuron selects one single allele from one single receptor gene (OR or V1R) for expression while the rest of the repertoire remains silenced. The mechanisms underlying OR and V1R gene expression are still unknown. The similarities of the pattern of expression in both types of olfactory sensory neurons suggest that the regulation of OR and V1R gene expression may be under the control of a common mechanism. Until now, promoter regions of different OR and V1R genes had not been extensively analyzed. We carried out a comprehensive analysis in which the upstream regions of a large number of different OR and V1R genes were compared. First, using the RLM-RACE strategy, combined with degenerate PCR we generated hundreds of complete 5UTR cDNAs for a total of 198 OR genes and 39 V1R genes. Then, these cDNAs were aligned against the mouse genome sequence and the transcription start sites (TSSs) were precisely determined. Sequences upstream of the TSSs were retrieved and searched for common DNA motifs that may play a role as cis-acting elements involved in the general regulation of OR and V1R gene expression. The analysis revealed the presence of motifs that resemble O/E-like sites overrepresented in the OR and V1R promoter regions. These O/E-like motifs specifically interact with nuclear protein prepared from olfactory epithelium, but not from brain and liver. 8 We also identified a new motif that does not resemble any known transcription factor binding site. Besides, this new motif is present in 77% of the 39 V1R promoter regions and in 52% of the 198 OR promoter regions analyzed, preferentially concentrated near the TSSs. Interestingly, binding assays indicate that this new motif interacts with nuclear proteins prepared from the vomeronasal and the olfactory epithelia, but not from brain, liver and lung. Our results indicate that OR and V1R genes share common promoter elements that may be binding sites for specific olfactory transcription factors and may play a role in a common mechanism of olfactory and vomeronasal gene regulation

Introduction: Amyotrophic lateral sclerosis (ALS) is a deadly, progressive neuromuscular disease that affects individuals all over the world. About 10% of the patients have a familial predisposition (FALS) while the remainder of cases are isolated or sporadic (SALS) and of unknown cause. To date, the principal recognized risk factors for ALS are higher age, male gender, slim figure (BMI<23) and a family history of ALS. In 1993, Rosen et al. observed that some FALS cases were associated with mutations in the gene encoding the CuZn superoxide dismutase enzyme (SOD1). Since then, several mutations in the SOD1 gene have been discovered, and mutations in more than 18 other genes have been associated with causing ALS. The aim of this thesis was to identify new mutations associated with ALS pathogenesis, and by comparing patients from different countries, were we also able to identify population-specific genetic variations. The studies are referred to as I–V. Methods: With written informed consent and adhering to the tenets of the Declaration of Helsinki, through a national network of ALS clinicians´, venous blood samples were collected from ALS patients and healthy subjects in Europe and the USA. The patients were diagnosed according to the El Escorial criteria, and as having FALS according to the criteria of Byrne et al. (2011). The DNA variations were amplified by various PCR techniques. (I, III and IV) The amplicons of ataxin 2 (ATXN2), profilin 1 (PFN1), and vesicle-associated membrane protein type B (VAPB) were characterised by direct sequencing. (II) After quantitative PCR, a genotype-phenotype correlation was performed to assess whether the survival motor neuron gene (SMN) modulates the phenotype of ALS. (V) The amplicons of the 50 base pair deletion in the SOD1 promotor (50 bp) were separated by electrophoresis on agarose. Results: (I) We observed a significant association between CAG expansions in the ATXN2 gene and ALS in a European cohort. (II) Abnormal copy number of the SMN1 gene was identified as a risk factor in France, but not in Sweden. Homozygosity of the SMN2 deletion prolonged survival among Swedish ALS patients, compared to French patients. (III) We identified two mutations in the PFN1 gene, the novel p.Thr109Met mutation and the p.Gln117Gly mutation, in two unrelated FALS patients. (IV) In our cohort, we identified five VAPB mutations p.Asp130Glu, p.Ser160del, p.Asp162Glu, p.Met170Ile, and p.Arg184Trp, two of which are novel. (V) The 50 bp deletion upstream of the SOD1 gene was found in equal frequencies in both the patient and control cohorts. The 50 bp deletion did not affect SOD1 enzymatic activity. Furthermore, we found no differences in age of onset or disease duration in relation to the 50 bp deletion genotype.VI Conclusions: (I) Our findings indicate that ATXN2 plays an important role in the pathogenesis of ALS, and that CAG expansions in ATXN2 are a significant risk factor for the disease. (II) We suggest that abnormal SMN1 gene copynumber cannot be considered a universal genetic susceptibility factor for ALS. We also propose that the effect of abnormal SMN2 gene copy number on ALS phenotype may differ between populations. (III) This work provides evidence that PFN1 mutations can cause ALS as a Mendelian dominant trait. The novel p.Thr109Met mutation also shows that disturbance of actin dynamics can cause motor neuron degeneration. (IV) We find it unlikely that the VAPB mutations cause ALS in our cohorts. (V) We find it unlikely that the 50 bp region contains important regulatory elements for SOD1 expression. This thesis supports the theory that ALS is a multigenetic disease, but there appears to be great genetic variation among apparently identical populations. These studies emphasise the importance of continuous genetic screening, to identify further mutations and genes involved in ALS disease, but it also highlights the importance of cooperation and comparison between countries. / On the aetiology of ALS: A comprehensive genetic study

Dissertation (Ph.D.)--University of South Florida, 2007. / Title from PDF of title page. Document formatted into pages; contains 82 pages. Includes vita. Includes bibliographical references.