L’homéostasie calcique est régulée par de nombreux canaux ioniques, parmi lesquels des canaux intracellulaires perméables au Ca2+, comme l’IP3R. Récemment, la protéine Bcl-2 a été montré comme régulant l’activité de ce canal ionique. Cependant, les acteurs moléculaires précis de cette interaction ne sont pas très bien établis. Ici nous montrons grâce à une nouvelle technique que l’IP3R est inhibé par le domaine BH4 de Bcl-2 et que ce domaine est nécessaire et suffisant pour inhiber son activité. De plus, la liaison de l’ABT-199 dans la poche hydrophobe de Bcl-2 conduit à un changement de structure du domaine BH4. Le niveau d’expression des différentes isoformes d’IP3R ainsi que des protéines Bcl-2 et Bcl-xL ont été étudié dans différentes lignées cancéreuses prostatiques. De manière intéressante, l’expression du récepteur à l’IP3 de type 3 (IP3R3) est augmentée en fonction de l’agressivité des lignées cancéreuses prostatiques. De plus, nous pouvons observer un effet important de l’IP3R3 sur la migration et l’invasion des lignées humaines de cancer de la prostate. Globalement, ces données montrent que l’IP3R3 participe à l’augmentation du potentiel métastatique des cellules cancéreuses prostatiques. Par conséquent, l’IP3R3 peut être un marqueur diagnostic intéressant ainsi qu’une cible thérapeutique, notamment pour les stades avancés de cancer de la prostate. / Calcium homeostasis is regulated by various ion channels, among which intracellular Ca2+-permeable channels, such as IP3R. Lately, Bcl-2 protein have been shown to regulate this ion channel activity. However, the study of the functional properties of IP3R in interaction with Bcl-2 is not a straightforward procedure and the molecular players implicated in that interaction are still not well established. Here, we show with the use of a new electrophysiological method, that the IP3R is inhibited by Bcl-2 via its BH4 domain and that the BH4 domain of Bcl-2 can inhibit by itself the single channel activity of the IP3R. Moreover, the binding of the ABT-199 in the hydrophobic groove of Bcl-2 leads to a tail-flip structural change in BH4 domain. We also studied the expression level of different IP3R isoforms as well as Bcl-2 and Bcl-xL protein in different prostate cancer cell lines. Interestingly, IP3R type 3 (IP3R3) expression is increased according the aggressiveness of prostate cancer cell lines. Indeed, IP3R3 was expressed preferentially in highly aggressive prostate cancer cell lines. Moreover, we can observe an significantly important effect of the IP3R3 on migration and invasion properties of human prostate cancer cell lines. Our study also revealed that IP3R3 was not involved in viability, proliferation. Overall, these data provide evidence on IP3R3 contribution to the increased metastatic potential of human prostate cancer cells. Therefore, IP3R3 could provide new perspective molecular target for the disease suppression, in particular at its advances stages.

Le carcinome rénal représente 5% des tumeurs de l’adulte et se développe au niveau des tubules rénaux. Le sous-type histologique majeur des cancers du rein est le carcinome rénal à cellules claires (cRCC). 90% des cRCC présentent une inactivation biallélique du gène suppresseur de tumeur de Von Hippel Lindau (VHL) induisant une activation constitutive de la voie de l’hypoxie via le facteur de transcription HIF1-α (Hypoxia Inducible Factor) qui contribue à la physiologie des tumeurs. Les cRCC sont des tumeurs à la fois radio- et chimiorésistantes, rendant la prise en charge thérapeutique des patients très difficile.Nos recherches consistaient en l’étude des rôles de la mucine membranaire MUC1, dont la queue cytoplasmique (MUC1 CT) peut interagir avec différentes voies de signalisation et agir en tant que co-activateur transcriptionnel de nombreux gènes impliqués dans la progression tumorale et la diffusion métastatique. Des travaux antérieurs réalisés au laboratoire montraient que la surexpression de MUC1 observée dans les cRCC était associée au statut métastatique des patients et marquait un mauvais pronostic. Cette surexpression de MUC1 est également impliquée dans la voie de l’hypoxie, voie majeure de la carcinogenèse rénale. Le premier objectif de l’étude était donc de déterminer les effets de la surexpression de MUC1 sur les propriétés des cellules de cRCC. Nous montrons ainsi que le domaine extracellulaire de MUC1 ainsi que sa partie cytoplasmique sont impliqués dans l’augmentation des capacités migratoires et de la viabilité des cellules cancéreuses rénales et qu’elle leur confère une résistance à l’anoïkis, programme de mort cellulaire déclenché lorsque la cellule perd ses contacts avec les cellules voisines ou avec la matrice extra-cellulaire et diminuent les propriétés d’agrégation des cellules tumorales. Nous montrons également que MUC1 est impliquée dans la chimiorésistance des cRCC en induisant l’expression de genes de chimiorésistance comme ABCG2 et GSTO2. Nous montrons par ailleurs que les propriétés invasives des cellules de cRCC sont exclusivement liées à MUC1 CT. Le deuxième objectif de l’étude était d’identifier les mécanismes moléculaires à l’origine du clivage de MUC1 CT. En utilisant différentes stratégies (siARN, inhibiteurs pharmacologiques et peptides), nous montrons pour la première fois que deux sheddases, ADAM10 et ADAM17 et la gamma secrétase sont nécessaires au clivage de MUC1 C, permettant ainsi sa délocalisation nucléaire et l’augmentation des propriétés invasives des cellules de cRCC. Enfin, nous montrons que la surexpression de MUC1 augmente l’expression protéique d’ADAM10/17, suggérant une boucle de régulation positive existant en conditions pathologiques.En conclusion, notre étude souligne le rôle de MUC1 dans la progression tumorale rénale et montre que la localisation nucléaire de MUC1-C est à l’origine de l’acquisition d’un phénotype invasif et chimiorésistant via l’action des sheddases ADAM10/17 et de la gamma secrétase. MUC1 apparait alors comme une cible thérapeutique potentielle intéressante dans la prise en charge des cRCC. / Renal cell carcinoma corresponds to 5% of all adult malignancies and originates from renal tubules. The main histologic subtype is represented by clear renal cell carcinoma. Ninety percent of cRCC present a biallelic inactivation of the von Hippel Lindau (VHL) tumor suppressor gene resulting in constitutive activation of hypoxia signaling pathway via the Hypoxia Inducible Factor (HIF) -1 transcription factor that contributes to the physiology of tumours. cRCC is typically highly resistant to conventional systemic therapies. MUC1 is a membrane-anchored mucin and its cytoplasmic tail (CT) can interact with many signaling pathways and act as a co-transcription factor to activate genes involved in tumor progression and metastasis. Previous studies have shown that MUC1 is diffusely overexpressed in cRCC and MUC1 overexpression has been found to be associated with metastatic disease and a worse prognosis.MUC1 is overexpressed in renal cell carcinoma with correlation to prognosis and has been implicated in the hypoxic pathway, the main renal carcinogenetic pathway. In this context, we assessed the effects of MUC1 overexpression on renal cancer cells properties. Using shRNA strategy and/or different MUC1 constructs, we found that MUC1-extracellular domain and MUC1 CT are both involved in increase of migration, cell viability, resistance to anoikis and to decrease of cell aggregation in cancer cells. We also showed that MUC1 is involved in cRCC chemoresistance by inducing chemoresistance genes expression like ABCG2 and GSTO2. Invasiveness depends only on MUC1 CT. Then, by using siRNA strategy and/or pharmacological inhibitors or peptides, we showed that sheddases ADAM10, ADAM17 and gamma-secretase are necessary for MUC1 C-terminal subunit (MUC1-C) nuclear location and in increase of invasion property. Finally, MUC1 overexpression increases ADAM10/17 protein expression suggesting a positive regulatory loop. In conclusion, we report that MUC1 acts in renal cancer progression and MUC1-C nuclear localization is driving invasiveness of renal cancer cells through a sheddase/gamma secretase dependent pathway. MUC1 appears as a therapeutic target by blocking MUC1 cleavage or nuclear translocation by using pharmacological approach and peptide strategies.

La technique de diffraction de monocristaux est la plus utilisée pour déterminer une structure tridimensionnelle de protéine, permettant ainsi la compréhension de sa fonction biologique.Cependant, cette technique nécessite l'obtention d'un monocristal.La détermination d'une structure par diffraction de poudre ne requiert que l'obtention d'un précipité cristallin, souvent obtenu lors de la recherche d'une condition de cristallisation.Nous présentons dans cette thèse plusieurs protéines étudiées par diffraction de poudre. Le développement de nouvelles méthodes pour la préparation des échantillons et l'acquisition des données sont présentées, étant donnée leur importance cruciale dans ces études.Nous avons étudié le polymorphisme de l'urate oxidase par la détermination des différentes phases cristallines résultant des modifications des conditions de cristallisation. Cette étude a débouché sur l'identification d'une forme cristalline nouvelle d'intérêt pharmaceutique. Une des phases d'urate oxidase à permis l'obtention d'un cliché de diffraction de qualité suffisante à la redétermination et l'affinement de sa structure.Un protocole pour le refroidissement cryogénique de poudre de protéineest présenté, offrant une durée de vie accrue de l'échantillon lors de l'acquisition de données.Ce protocole a permis l'affinement de deux structures d'insuline humaine. Nous présentons également la détermination d'une structure préliminaire du domaine macro du virus Mayaro, basé uniquement sur des données acquises sur un unique échantillon polycristallin en forme d'oursin. Une étude de la matrice de protection de deux baculovirus illustre les limites auxquelles se heurte actuellement la technique de diffraction de poudre de protéines.En annexes, les étapes nécessaires pour la préparation et l'analyse des données sont présentées. / Knowledge of the structure of proteins helps in understanding theirbiological function.The main technique used, single crystal diffraction, requires thelimiting step of growing a single crystal.On the other hand, powder diffraction requires only a crystallineprecipitate made of many microcrystals such as those often discardedduring the search for suitable single crystal growth conditions.We present in this thesis different studies of proteins by powder diffraction.Development of new methods for sample preparation and data acquisitionare also presented, as they have been crucial steps to obtain highquality diffraction data.We studied the polymorphism of Urate oxidase by observing thedifferent crystallographic phases resulting from the changes in thecrystallisationconditions.A crystallographic phase of pharmaceutical interest has been identified.Also one phase of urate oxidase complexed with its inhibitor gave apowder pattern sufficient to re-determine and refine its structure.A protocol for cryocooling protein powder samples has been found,extending the lifespan of the sample in the intense X-ray beam.This allowed the refinement from powder data of two forms ofcryocooled human insulin.We present also the determination of a preliminary structure of themayaro virus macro domain, based on a powder diffraction patternobtained on a single urchin-like bundle of needles.A study of the protective protein matrix of two baculoviruses ispresented, showing some current limits of the method.In annexes, the steps for preparing and analysing protein powders are described.

Contexte. Les protéines transmembranaires ont une importance considérable tant au niveau de la survie d'une cellule qu'au niveau de ces interactions avec les autres cellules. En raison de contraintes techniques, la cristallisation de ce type de protéine demeure très complexe, ce qui limite grandement l’exploration de leur structure. Pour contourner ces difficultés, différents outils de prédiction ont été développés,en se fondant originellement sur l'hydrophobicité des régions enfouies dans la membrane. Méthode. L'outil développé repose sur une dérivation de la moyenne d'hydrophobicité calculée sur deux ensembles de taille de fenêtres. Le premier ensemble (G1) contient des petites tailles de fenêtres ce qui correspond à des événements locaux, tandis que le second (G2) correspond à des tailles de fenêtres plus larges, adaptées à la taille des hélices formant certaines protéines transmembranaires. La variation d'hydrophobicité est obtenue en dérivant les moyennes d'hydrophobicité. Un consensus est établi pour chaque groupe, et les résultats sont comparés à un ensemble de protéines transmembranaires cristallisées. Résultats. Les variations d'hydrophobicité G2 sont liées aux extrémités des hélices transmembranaires,tandis que les variations G1 sont en relation avec la limites des structures et certaines irrégularités structurelles.Ces résultats nous ont amené à introduire une nouvelle notion : les unités transmembranaires(TMU). Les TMU consistent en un ensemble de sous-structures qui composent les structures transmembranaires. / Background. Few high-resolution structures of integral membranes proteins are available, as crystallization of such proteins needs yet to overcome too many technical limitations. Nevertheless, prediction oftheir transmembrane (TM) structure by bioinformatics tools provides interesting insights on the topology of these proteins.Method. We describe here how to extract new information from the analysis of hydrophobicity variations or hydrophobic pulses (HPulses) in the sequence of integral membrane proteins using the Hydrophobic Pulse Predictor, a new tool we developed for this purpose. To analyze the primary sequence of 70 integralmembrane proteins we defined two levels of analysis : G1-HPulses for sliding windows of n=2 to 6 andG2-HPulses for sliding windows of n=12 to 16.Results. The G2-HPulse analysis of 541 transmembrane helices allowed the definition of the new conceptof transmembrane unit (TMU) that groups together transmembrane helices and segments with potentialadjacent structures. In addition, the G1-HPulse analysis identified helix irregularities that correspondedto kinks, partial helices or unannotated structural events. These irregularities could represent key dynamicelements that are alternatively activated depending on the channel status as illustrated by the crystalstructures of the lactose permease in different conformations. Our results open a new way in the understanding of transmembrane secondary structures : hydrophobicity through hydrophobic pulses stronglyimpacts on such embedded structures and is not confined to define the transmembrane status of aminoacids.

La protéine MC1 est une petite protéine structurale très abondante chez Methanosarcina thermophila (archaeabactérie). Nous avons utilisé la méthode SELEX (Systematic Evolution of Ligands by EXponential enrichment) pour rechercher ses séquences préférentielles de fixation. Après 10 cycles de sélection, une séquence consensus avec une affinité 50 fois plus forte que celle pour une séquence aléatoire a été déterminée. Cette séquence a été étudiée par simulation de dynamique moléculaire. Le mode de fixation de MC1 sur l?ADN a ensuite été déterminé par des empreintes moléculaires (DMS, OH·). Les résultats montrent une fixation par une face et dans le petit sillon de l?ADN. Une reconnaissance par lecture indirecte des séquences est probable. L?oxydation de certains acides aminés (Trp, Met) par les rayons gamma entraîne une modification des propriétés de la protéine : perte de la reconnaissance de structures et séquences particulières et diminution de sa capacité à courber l?ADN.

Les protéines solubles sont généralement faiblement immunogènes, ce qui constitue une limite pour le développement de vaccins sous unitaires à base de protéines. Mes travaux de thèse ont eu pour objectif de décrypter certains mécanismes moléculaires et cellulaires qui contribuent à l'immunogénicité et d'en tirer partie pour développer des approches originales permettant d'améliorer la capacité des protéines à déclencher la réponse immunitaire. Pour cela, j'ai principalement utilisé le transactivateur transcriptionnel (Tat) du VIH-1. J'ai montré que l'oligomérisation de Tat permet à un mécanisme de collaboration B-TH-2 d'induire la réponse immunitaire en absence d'adjuvant. J'ai identifié le déterminant minimal responsable de l'effet et montré qu'il confère la propriété adjuvante à d'autres antigènes. J'ai ensuite montré que la présentation aux cellules T restreinte aux CMH I et CMH II est accrue lorsque les protéines sont dotées de la capacité à lier des sucres sulfatés d'expression ubiquitaire: les héparanes sulfate. Ces travaux ont permis de définir de nouvelles approches pour améliorer l'immunogénicité de protéines susceptibles d'être intégrées dans des préparations vaccinales.

La technique de diffraction de monocristaux est la plus utilisée pourdéterminer une structure tridimensionnelle de protéine, permettantainsi la compréhension de sa fonction biologique.Cependant, cette technique nécessite l'obtention d'un monocristal.La détermination d'une structure par diffraction de poudre ne requiertque l'obtention d'un précipité cristallin, souvent obtenu lors de larecherche d'une condition de cristallisation.Nous présentons dans cette thèse plusieurs protéines étudiées pardiffraction de poudre. Le développement de nouvelles méthodes pour lapréparation des échantillons et l'acquisition des données sontprésentées, étant donnée leur importance cruciale dans ces études.Nous avons étudié le polymorphisme de l'urate oxidase par ladétermination des différentes phases cristallines résultant desmodifications des conditions de cristallisation. Cette étude a débouchésur l'identification d'une forme cristalline nouvelle d'intérêtpharmaceutique. Une des phases d'urate oxidase à permis l'obtentiond'un cliché de diffraction de qualité suffisante à la redéterminationet l'affinement de sa structure.Un protocole pour le refroidissement cryogénique de poudre de protéineest présenté, offrant une durée de vie accrue de l'échantillon lors del'acquisition de données.Ce protocole a permis l'affinement de deux structures d'insulinehumaine. Nous présentons également la détermination d'une structurepréliminaire du domaine macro du virus Mayaro, basé uniquement sur desdonnées acquises sur un unique échantillon polycristallin en formed'oursin. Une étude de la matrice de protection de deux baculovirusillustre les limites auxquelles se heurte actuellement la technique dediffraction de poudre de protéines.En annexes, les étapes nécessaires pour la préparation et l'analysedes données sont présentées.

Tétracyclines (TC) sont une famille d'antibiotiques important, qui se lient SPECI ャ ... allié aux protéines du ribosome et solidaire. Le mécanisme le plus important de la résistance à la tétracycline est régie par sa reliure en Tc: Mg2 + complexe à la protéine Tet Repressor (TetR). Il est donc d'intérêt pour améliorer notre compréhension des deux Tc: TetR et Tc: liaison au ribosome. Les structures cristallines des tétracyclines dans plusieurs complexes avec les protéines et les ribosomes ont fourni des informations essentielles. Une approche complémentaire consiste à développer des modèles de simulation par ordinateur, qui peut être utilisée pour étudier la structure, la dynamique et la thermodynamique de Tc: protéines ou Tc: complexes ribosome. Malgré son importance, à la tétracycline a rarement été soumis à la modélisation informatique, en partie en raison de la nécessité de ャ> St développer un modèle de mécanique moléculaire pour le TC. Ici, nous avons développé un tel modèle, de manière à être compatible avec le ャ CHARMM27 force »ld pour les protéines et les acides nucléiques, de 12 analogues de tétracycline importants, notamment la tétracycline plaine. paramètres ld ャ forces intermoléculaires ont été dérivées de supermolécule une approche standard. Le modèle reproduit la géométrie ab initio et Fxibility ャ de chaque Tc. Comme les tests, nous avons fait des simulations d'un cristal de Tc, Tc: Mg2 + et Tc: complexes Ca2 + en solution aqueuse, et d'un complexe solvaté entre TC: Mg2 + et le TetR. Le modèle se compare bien avec un large corpus de données expérimentales. Nous ャ> St utilisé notre modèle pour l'étude Tc: reconnaissance TetR qui est un problème complexe. Nous avons utilisé des simulations d'énergie libre pour étudier les interactions électrostatiques entre la protéine et ligand et le rôle éventuel de ャ induite "en Tc contraignant. Nous avons constaté que la tétracycline préfère une étendue, l'état zwitterioniques fois en solution et en complexe avec la protéine. Tc est donc préorganisés pour la reliure. En l'absence de Tc, TetR est étroitement liée à son ADN opérateur; lors de la liaison de Tc il se dissocie de l'ADN, permettant l'expression des gènes réprimés. Son contrôle serré par Transports Canada fait TetR largement utilisables dans le génie génétique. Le Tc site de liaison est plus de 20 ヒ A partir de l'ADN, de sorte que le signal de liaison doivent se propager sur une longue distance. Nous utilisons des simulations de dynamique moléculaire et calculs continuum électrostatique pour élucider le mécanisme allostérique. Lorsque [TC: Mg] lie +, l'ion Mg2 + permet des interactions avec hélice 8 de TetR un monomère et Helix 6 de l'autre monomère, et Helix 6 est tiré en direction du noyau central de la structure. Hy- interactions drophobic avec hélice 6 puis tirez hélice 4 dans un mouvement pendulaire, avec un déplacement maximum à son extrémité N-terminale: l'interface de l'ADN. Le résidu N-terminal de l'hélice 4, Lys48, est très conservée dans l'ADN de liaison des protéines régulatrices de la classe TetR et fait la plus grande contribution de tout acide aminé à l'TetR: l'ADN d'énergie libre contraignant. Ainsi, les changements de conformation conduire à une réduction drastique de la TetR: la liaison d'un ADN lité ャハ, permettant TetR se détacher de l'ADN. Nous avons ensuite utilisé le modèle pour l'étude Tc liaison au ribosome et de facteur d'élongation Tu (EF-Tu). Les structures cristallines de Tc lié à la Thermus thermophilus 30S sous-unité montrer le même site Tc primaire obligatoire (appelé TET1), avec la plus forte densité d'électrons Tc, à proximité du site A-, compatible avec un rôle inhibiteur. Un site secondaire Tc-contraignant, TET5 appelé a également été observée dans les deux structures. Nous avons fait de la dynamique moléculaire (MD) des simulations de sous-unités 30S du ribosome pour caractériser Tc contraignant et aider à résoudre l'ambiguïté en ce qui concerne le nombre et la force de Tc sites de liaison. Nous avons présenté des preuves pour les lier à TET1 prédominante, indiquant que d'autres sites de liaison signalés sont plus faibles et pas très occupés à des concentrations physiologiques Tc. Récemment, la structure cristalline d'un complexe entre le facteur d'allongement Tu (EF-Tu) et Tc a été résolu, ce qui soulève la question de savoir si Tc 窭 冱 contraignant à EF-Tu a un rôle dans l'inhibition de la synthèse protéique. Nous montrons que la contribution directe de EF-Tu à l'énergie libre de Tc contraignant à l'EF-Tu: PIB: complexe Mg est négligeable, mais plutôt la liaison peut être attribuée uniquement à Tc interactions avec l'ion Mg et le phosphate PIB groupes . Nous montrons aussi que EF-Tu ne présente pas de préférence contraignant pour le TC sur la non-antibiotiques, 4-dedimethyl-Tc, et EF-Tu ne lie pas la tigécycline analogique Tc, qui est un antibiotique puissant. Globalement, nos résultats appuient l'idée que les EF-Tu n'est pas la cible principale de la tétracycline. Les articles présentés ci-dessous comprennent à la fois de calcul et les résultats expérimentaux. Tout le travail expérimental a été réalisé par Winfried Hinrichs et ses collabora-teurs. Tout le travail de calcul a été fait par moi-même. Les connaissances acquises dans ce travail et les techniques de modélisation employées doivent être d'intérêt pour l'amélioration des techniques antibiotiques Tc et TetR protéines améliorées pour la régulation des gènes.

Lors de la grossesse, différentes complications peuvent survenir et amener des conséquences néfastes sur la santé de la mère et du foetus. Par exemple, une malformation du placenta peut mener à des conditions pathologiques telles le retard de croissance intra-utérin ou la pré-éclampsie. Ces maladies semblent, respectivement, être causées par un désordre lors de la différenciation des cytotrophoblastes en syncytiotrophoblastes et une altération du transport de calcium de la mère au foetus. Il est donc essentiel de découvrir les mécanismes cellulaires et moléculaires qui régissent ces phénomènes afin de pouvoir, dans l'avenir, contrer le développement de telles conditions pathologiques. Chez la souris, le transport placentaire du calcium est dépendant du peptide apparenté à la parathormone (PTHrP) et son fragment N-terminal est impliqué dans le processus de différenciation des trophoblastes. Ainsi, cette étude a pour but premier de découvrir si la PTHrP (1-34) régule le transport calcique à travers les syncytiotrophoblastes humains. Par ailleurs, comme les Mitogen Activated Protein Kinases (MAPK) ERK1/2 et p38 sont impliquées dans le processus de différenciation des trophoblastes humains, cette étude vise aussi à déterminer si la PTHrP (1-34) peut stimuler la différenciation des trophoblastes humains via ces deux MAPKs. Il a tout d'abord été nécessaire de mettre au point un milieu de culture sans sérum pour observer les effets directs de l'hormone sur la différenciation cellulaire. Les cellules trophoblastiques sont isolées à partir de placentas humains frais et cultivées dans un milieu de culture sans sérum où la PTHrP est ajoutée en concentrations croissantes. Tout d'abord, la cytotoxicité cellulaire des différents traitements a été mesurée. La différenciation des cellules trophoblastiques est ensuite mesurée de manière biochimique par le dosage de l'hormone hCG et, de manière morphologique, par l'observation de la fusion cellulaire. L'activation des voies de signalisation de ERK1/2 et p38 est observée par irnmunobuvardage de type Western et par la capacité de l'hormone de réactiver la voie de signalisation suite à son blocage par un inhibiteur spécifique. La captation du calcium par les syncytiotrophoblastes est étudiée à l'aide de calcium radiomarqué (⁴⁵Ca²⁺) alors que l'effet de la PTHrP (1-34) sur les protéines impliquées dans le transport de l'ion calcique est étudié par PCR en temps réel et par immunobuvardage de type Western. Les résultats obtenus indiquent que les différents traitements administrés aux cellules trophoblastiques ne causent pas de mortalité cellulaire. Par la suite, nous avons constaté qu'une forte concentration de l'hormone stimule la différenciation des cellules cytotrophoblastiques en syncytiotrophoblastes. Ce processus de différenciation semble se faire par la MAPK ERK1/2 puisque cette dernière est davantage activée en présence de PTHrP (1-34). De plus, le fragment N-terminal de la PTHrP est capable de réactiver cette MAPK suite à son inhibition. Par la suite, il a été possible de constater que la présence du fragment N-terminal de la PTHrP dans le milieu de culture des cellules trophoblastiques permet une augmentation significative de l'expression des protéines PMCA1 et 4 au premier jour de culture. Ainsi, une perturbation de la concentration de PTHrP (1-34) pourrait être un phénomène impliqué dans des conditions pathologiques lors de la grossesse chez la femme enceinte. Éventuellement, il serait donc intéressant d'observer l'effet de cette hormone sur la différenciation et le transport calcique des trophoblastes chez des femmes atteintes de pré-éclampsie ou dont l'enfant souffre de retard de croissance intra-utérin. ______________________________________________________________________________ MOTS-CLÉS DE L’AUTEUR : Placenta, Trophoblaste, PTHrP, Différenciation, ERK1/2, p38, Calcium.

La protéine L-isoaspartate (D-aspartate) méthyltransférase (PIMT) est une enzyme de réparation qui cible les protéines endommagées par l'accumulation de résidus L-isoaspartates anormaux. Les voies de signalisation qui contrôlent l'expression de la PIMT sont peu connues. D'autre part, la kinase mTOR est une protéine centrale pour les cellules. Elle contrôle la synthèse des protéines, le cycle cellulaire et l'intégration des voies de signalisation régulées par des facteurs de croissance et des nutriments. Or, nous démontrons dans cette étude que l'expression de la PIMT est dépendante de mTOR. En utilisant des analyses par immunobuvardage de type Western et RT-PCR, nous montrons qu'une concentration physiologique (0.02 µM) et élevée (1 µM) de l'inhibiteur spécifique de mTOR, la rapamycine, inhibe (40% et 70%) l'expression de la PIMT sans modulation du niveau d'ARNm. D'un autre côté, l'expression de la PIMT diminue lorsqu'on prive les cellules en glutamine, une condition expérimentale connue pour inhiber mTOR. De plus, nous montrons que l'inhibition de l'expression de la PIMT est dépendante de mTOR mais semble indépendante de la PI3K. Pour cela, nous avons employé des inhibiteurs de la PI3K (Wortmannin, LY294002), un analogue inactif (LY303511) qui n'agit pas sur la PI3K mais qui a été rapporté pour inhiber l'activité de mTOR, et un inhibiteur d'AKT. Enfin, nous avons utilisé un siRNA dirigé contre mTOR et montré que cela entraînait une diminution de 50% de l'expression de mTOR et de la PIMT. Ces résultats suggèrent fortement un mécanisme de régulation de la PIMT par mTOR. Sachant que mTOR est surexprimée dans certains cancers, l'inhibition de l'expression de la PIMT par l'inhibition de mTOR pourrait avoir une implication thérapeutique. ______________________________________________________________________________ MOTS-CLÉS DE L’AUTEUR : Protéine L-isoaspartate (D-aspartate) méthyltransférase (PIMT), Mammalian target of rapamycin (mTOR), Glioblastomes, Inhibiteurs des kinases, Voies de signalisation.