La réponse cellulaire aux stimuli extracellulaires est souvent médiée par des voies de signalisation qui agissent en aval des récepteurs transmembranaires, comme les récepteurs tyrosine kinases (RTK). Avec quatorze membres, la famille des récepteurs Eph représente la plus grande famille de RTK chez l'humain. Contrairement aux autres RTK, les ligands des récepteurs Eph, les éphrines, sont des protéines associées à la membrane cellulaire. La signalisation Eph-éprhines est donc principalement impliquée dans des événements de communication qui impliquent des contacts cellule-cellule comme la migration cellulaire, la répulsion et l'adhésion cellule-cellule. Ces événements sont cruciaux pour certains processus biologiques tels le guidage axonal et l'organisation tissulaire dans l'organisme en développement et chez l'adulte. Les récepteurs Eph sont fréquemment surexprimés ou dérégulés dans divers cancers, en particulier dans les plus agressifs et mortels. Récemment, la signalisation Eph-éphrines est devenue une nouvelle cible émergente pour le traitement du cancer. Bien que les fonctions biologiques des récepteurs Eph aient été largement étudiées, notre compréhension des mécanismes moléculaires grâce auxquels les récepteurs Eph régulent des phénotypes cellulaires précis demeure incomplète. Pour mieux comprendre le système de signalisation impliquant les Eph, mes travaux ont porté sur l'identification de nouvelles protéines effectrices en aval des récepteurs Eph et sur l'étude de leurs implications dans les fonctions régulées par les récepteurs Eph. Pour mieux comprendre les complexes de signalisation associés aux récepteurs Eph dans des conditions natives, j'ai appliqué une approche basée sur la spectrométrie de masse (MS), le marquage de proximité BioID. Cela m'a permis de surmonter les limites de l'utilisation d'approches conventionnelles de purification par affinité pour cartographier les interactions protéine-protéine liées aux récepteurs transmembranaires. J'ai obtenu un réseau de signalisation dépendant des récepteurs EphA4, - B2, -B3 et -B4, qui comprend 395 protéines, dont la plupart n'avaient jamais été liées à la signalisation Eph-dépendante. Pour tester la pertinence biologique des partenaires identifiés, j'ai examiné la contribution de 17 candidats en utilisant une approche de perte de fonction dans une expérience de tri cellulaire dépendante des récepteurs Eph. J'ai pu montrer que la déplétion de quelques candidats, incluant la protéine Par3, bloque le tri des cellules. En utilisant la purification par affinité combinée à la MS, j'ai aussi identifié un complexe de signalisation impliquant la kinase C-terminal SRC (CSK), dont le recrutement aux complexes Par3 dépend des signaux des récepteurs Eph. Pour mieux comprendre les interactions protéiques suivant la liaison Eph-éphrine, j'ai effectué des expériences de TurboID. Ces études m'ont permis d'identifier des complexes protéiques associés au récepteur EphA4 lorsqu'il est lié à l'éphrine-B2. J'ai également étudié les interactions protéine-protéine dépendantes de la liaison du récepteur EphB2 aux éphrines-B1 et -B2. Pour explorer si l'interaction d'EphB2 avec ces deux ligands peut mener à une réponse de signalisation inverse différente, j'ai identifié les partenaires de des ephrin-B1/-B2 lorsque stimulés par EphB2. Enfin, j'ai cartographié les réseaux de signalisation dépendants des récepteurs EphA4 et EphB2 sauvages ou kinase-inactifs, ce qui m'a permis de conclure que la perte de leur activité catalytique a conduit à des changements majeurs dans les interactomes dépendants de ces récepteurs. L'ensemble de mes résultats a permis de mieux définir les complexes protéiques dépendants des récepteurs Eph. Mes études ont mené à une meilleure compréhension des mécanismes moléculaires sous-jacents aux récepteurs Eph et de leur contribution dans le processus de délimitation des tissus, un processus souvent perturbé dans des maladies comme le cancer. / The cellular response to extracellular stimuli is often mediated by signaling pathways that act downstream of transmembrane receptors, such as receptor tyrosine kinases (RTKs). With fourteen members, the Eph family of RTKs is the largest in humans. In contrast to other RTKs, Eph receptor cognate ligands, ephrins, are tethered to the cell surface. This results in Eph receptor-ephrin signaling being mainly involved in short-range cell-cell communication events that regulate cell migration, repulsion and cell-cell adhesion. These events are crucial in biological processes such as axon guidance and tissue boundary formation in the developing and adult organisms. Eph receptors are frequently overexpressed or deregulated in a variety of human tumors, especially in the more aggressive and lethal ones. In recent years, the Eph-ephrin signaling system became an emerging new target for cancer treatment. Although a plethora of Eph receptor biological functions have been extensively studied, we still have a vague idea on the molecular mechanisms of Eph receptor signal transduction, underlying how Eph receptors regulate precise cellular phenotypes. To better understand the Eph receptor signaling system, my studies focused on the identification of novel Eph receptor downstream effector proteins and the determination of their requirement for Eph receptor-regulated functions. To unravel Eph receptor-associated signaling complexes under native conditions, I applied a mass spectrometry (MS)-based approach, namely BioID proximity labeling. This allowed me to overcome the limitations of conventional affinity purification approaches for mapping protein-protein interactions of transmembrane receptors. I obtained a composite signaling network from EphA4, -B2, -B3 and -B4 receptors that comprises 395 proteins, most of which not previously linked to Eph signaling. To test the biological relevance of the identified Eph receptor proximity interactors, I examined the contribution of 17 candidates using a loss-of-function approach in an Eph receptor-dependent cell sorting assay. I showed that depletion of a few candidates, including the signaling scaffold Par3, blocks Eph receptordependent cell sorting. Using affinity purification combined with MS, I further delineated a signaling complex involving C-terminal SRC kinase (CSK), whose recruitment to Par3 complexes is dependent on Eph receptor signals. To further elucidate Eph receptor-centric signaling complexes that are formed upon ephrin binding and are affected by Eph receptor catalytic activity I performed TurboID experiments. I systematically mapped ligand stimulation-dependent signaling networks downstream of EphA4 and EphB2 receptors. I dissected the impact of ephrin-B2 stimulation on the formation of EphA4- nucleated proximal protein complexes. Moreover, I showed the differential recruitment of EphB2 partners upon receptor binding to the same subclass of ligands, ephrin-B1 and ephrin-B2. To explore whether the EphB2 interactions with these two ephrin-B ligands elicit different reverse signaling responses, I delineated ephrin-B1/-B2 proximity partners recruited upon EphB2 stimulation. I also determined that the kinase domain of EphA4/-B2 plays a major role in determining the composition of signaling networks around the receptors, as a loss of catalytic activity led to a drastic decrease in a number of interactors with the receptors. Collectively, my definition of Eph receptor signaling networks sheds light on physiologically relevant Eph receptor-centered protein complexes that occur in living cells. These studies will lead to a better understanding of the mechanisms by which Eph receptors transmit signals at the membrane and give insight into how Eph receptor-mediated signaling pathways contribute to boundary formation, a process often disrupted in diseases like cancer.

Tableau d’honneur de la Faculté des études supérieures et postdoctorales, 2012-2013. / L'anémie de Fanconi est une maladie génétique récessive rare, caractérisée par une défaillance de la moelle osseuse et une incidence accrue d'anomalies du développement et de cancer. Les protéines FANC sont impliquées dans la voie Fanconi pour réparer les pontages interbrins de l'ADN. En présence de dommages, la protéine FANCD2 est mono-ubiquitinée et s'accumule à la chromatine. Il est admis que FANCD2 occupe un rôle central dans la voie Fanconi, mais sa fonction biochimique exacte est inconnue. La purification de la protéine FANCD2 et de plusieurs fragments de la protéine, dans le but d'étudier leur capacité à lier l'ADN, a mené à l'identification de deux domaines de liaison à l'ADN. La perte de l'un ou l'autre de ces domaines empêche la localisation de la protéine FANCD2 aux foyers de réparation suite à l'induction de dommages, suggérant que ces domaines sont essentiels pour la fonction de FANCD2.

Tableau d’honneur de la Faculté des études supérieures et postdoctorales, 2010-2011 / Les mécanismes de mort cellulaire programmée (MCP), dont l'apoptose est le mieux caractérisé, assurent l'élimination des cellules qui sont potentiellement dangereuses pour l'organisme. Or, l'acquisition de lésions génétiques touchant des régulateurs clefs de l'apoptose contribue à la transformation cellulaire et à la résistance face à plusieurs thérapies anticancéreuses. Les travaux présentés dans cette thèse visent une meilleure compréhension des mécanismes alternatifs de MCP qui opèrent sélectivement dans les cellules cancéreuses. La protéine E4orf4 de 1'adenovirus humain active un tel mécanisme de MCP qui est indépendant des caspases et insensible à la surexpression de BCL-2. Au début de mon doctorat, les données indiquaient que l'activité toxique de E4orf4 reposait sur une modulation de l'activité des kinases de la famille Src (Src family kinases, SFKs) menant à des changements de la dynamique de l'actine régulés par les Rho GTPases. Notamment, il était établi que Cdc42 était activé par E4orf4 et stimulait la polymérisation de l'actine au niveau des endosomes de recyclage (ERs). En se basant sur ces données, l'objectif de cette thèse était d'étudier l'impact des changements de l'actine régulés par Cdc42 sur le trafic des ERs et les conséquences sur la dynamique des organelles impliquées dans la signalisation de la MCP. Mes résultats ont mis en évidence une voie de signalisation dépendante des SFKs Src et Yes, de Cdc42 et de Rabl la qui stimule le transport rétrograde des ERs au Golgi et inhibe le recyclage de cargos à la membrane plasmique. Une telle mobilisation des ERs au Golgi est associée à des changements de la dynamique du Golgi, lesquels sont requis pour la progression du signal de mort cellulaire et mènent à une fragmentation du Golgi. Ce processus a également été impliqué dans la mort cellulaire induite par la staurosporine en présence d'inhibiteurs de caspases, suggérant un rôle conservé dans les mécanismes alternatifs de mort cellulaire. Mes travaux ont aussi suggéré que les changements observés dans le transport endosomal et la dynamique du Golgi influence la dynamique des mitochondries en inhibant la fusion mitochondriale, laquelle est normalement requise pour le métabolisme énergétique et la survie cellulaire. En somme, mes travaux ont identifié une nouvelle voie de signalisation qui est activée en réponse au stress et qui est impliquée dans la communication inter-organelle via la mobilisation des ERs vers diverses organelles.

Avec leurs caractéristiques d'auto-renouvellement illimité et de pluripotence, les cellules souches embryonnaires humaines (hESC) représentent une source infinie de cellules pour la thérapie cellulaire de maladies, telle que la dystrophie musculaire de Duchenne. Des études ont démontré que les hESC pouvaient être différenciées en cellules musculaires squelettiques, mais les techniques employées sont longues et inefficaces. Ce mémoire décrit un nouveau protocole de différenciation des hESC en cellules musculaires squelettiques à l'aide d'un adénovirus exprimant le gène MyoD sous le contrôle du promoteur CAO (Ad.CAO-MyoD). L'efficacité de ce virus pour induire la myogenèse des hESC a été mise en évidence par la présence de divers marqueurs myogéniques. Ensuite, le potentiel de fusion de ces cellules a été illustré par le marquage de la MyHC et par l'observation de quelques myotubes. Ces résultats préliminaires semblent indiquer que l'Ad.CAO-MyoD est un outil prometteur pour différencier les hESC en cellules musculaires squelettiques.

Le large éventail d'applications du système CRISPR-Cas a conduit à des innovations biotechnologiques qui sont sur le point de transformer l'industrie pharmaceutique actuelle. Néanmoins, l'atteinte d'un haut niveau d'efficacité à un gène cible reste encore aujourd'hui un défi pour l'édition du génome. Ceci est dû principalement à la capacité encore limitée de modifier tous les sites du génome humain, tout comme le faible taux de recombinaison homologue obtenu chez les cellules de mammifères. Ainsi, l'optimisation des processus de modification génique s'avère indispensable pour favoriser les diverses utilisations de l'édition du génome. Dans cette thèse, il a été question de (i) développer une méthode d'enrichissement de cellules génétiquement modifiées et (ii) augmenter la polyvalence de l'édition du génome en augmentant la plage de ciblage du système CRISPR-Cas9 dans le génome humain. L'objectif de la première partie de cette thèse visait à étudier la fonctionnalité du gène ATP1A1, codant pour la pompe sodium/potassium (Na⁺/K⁺ ATPase), comme marqueur endogène de l'édition du génome. Dans ce sens, nous avons modifié la sensibilité de cette pompe pour l'ouabaïne en insérant des mutations dominantes dans le locus ATP1A1, ce qui a permis de générer des cellules résistantes à l'ouabaïne. La capacité de multiplexage du système CRISPR-Cas permet de co-cibler simultanément ATP1A1 et le locus d'intérêt, où il est possible d'enrichir des évènements de réparation par NHEJ ou par RH dans les deux locus à la suite de l'ajout d'ouabaïne. Ainsi, nous avons démontré que cette approche peut être appliquée non seulement aux lignées cellulaires, mais aussi aux cellules primaires ce qui permet d'envisager une possible utilisation pour le développement thérapeutique ex vivo. Dans le deuxième objectif de cette thèse, il était question d'optimiser le système CRISPR1-Cas9 de Streptococcus thermophilus dans le but d'élargir le répertoire de nucléases pour l'édition du génome. Dans ce sens, nous avons optimisé l'expression de l'ARN guide et nous avons caractérisé diverses variantes de St1Cas9 permettant de cibler des régions riches en A/T. Autant sous forme de nucléase que d'éditeur de base, l'application de nos variantes de St1Cas9 in vitro a permis d'obtenir des hauts taux d'édition du génome humain. Ainsi, la taille de St1Cas9 est idéale pour sa vectorisation avec son ARN guide dans un seul vecteur adéno-associés (AAV). Dans ce sens, nous avons démontré que l'administration du vecteur AAV-St1Cas9 permet de sauver la létalité et les anomalies métaboliques dans un modèle murin de tyrosinémie héréditaire de type I. En tout, ces travaux illustrent des outils permettant d'augmenter le rendement d'édition et l'ouverture de nouvelles régions géniques pouvant être ciblées à l'intérieur du génome humain à l'aide du système CRISPR-Cas9. Ainsi, nous avons démontré la fonctionnalité des outils développés au cours de ce projet de thèse pour diverses applications ex vivo et in vivo, permettant ainsi d'élargir le potentiel thérapeutique de l'édition du génome.

La maladie d'Alzheimer (MA) est caractérisée par la présence de plaques amyloïdes. Le peptide amyloïde provient d'un clivage séquentiel du peptide précurseur amyloïde par l'activité de la β-sécrétase (BACE) et l'activité y-sécrétase des présénilines (PSI et PS2). L'activité présénilinase consiste à couper PSI pour former un complexe y-sécrétase fonctionnelle. Il a été démontré que BACE interagit directement avec PSI mais le rôle de cette interaction demeure inconnu. Pour explorer les voies de signalisation de ces deux protéines, nous avons utilisé le système double-hybride en levure en utilisant BACE comme appât. Le résultat de ce criblage a permis d'identifier un interacteur protéique potentiel de BACE: l'ubiquiline 1 (UBQLN1). L'UBQLN1 est impliquée dans la dégradation protéique et son variant (UBQLN1delta8) a été associé à la MA. Nous avons observé une interaction entre BACE et UBQLN1. Cette interaction est perdue quand BACE est exprimée avec le variant UBQLN1delta8. La surexpression de l'UBQLNl entraîne la réduction de l'activité de BACE ainsi qu'une réduction de sa demi-vie contrairement à l'expression d'UBQLN1delta8. L'UBQLN1delta8 s'avère à augmenter la production du peptide amyloïde. Par ailleurs, l'expression de dominant négatif de BACE affecte la maturation de PSI en augmentant le niveau de PSI FL. Un inhibiteur de BACE, le Z-VLL s'avère à ne pas inhiber l'activité de BACE. Par contre, il accumule PSI FL et inhibe l'activité de PSI. Nous suggérons que UBQLN1delta8 entraîne le développement de la MA via une dérégulation au niveau du mécanisme de dégradation de BACE augmentant ainsi son activité et la production du peptide amyloïde. Avec le Z-VLL, nous avons inhibé l'activité présénilinase entraînant une inhibition de l'activité γ-sécrétase. Les mutations dans PSI affectent également la signalisation de la β-caténine, une protéine similaire à une plakophiline neuronale (NPRAP). NPRAP est spécifique au cerveau et interagit avec PSI. Le rôle de cette interaction est inconnu. Le criblage en levure en utilisant NPRAP comme appât, nous a permis d'identifier certaines protéines comme la karyophérine-α2 (KPN2A). Pour découvrir les fonctions de NPRAP, nous avons effectué un ± microarray ¿. II en résulte que NPRAP fait varier l'expression de plusieurs gènes dont le gène codant pour la butyrylcholinestérase. La capacité de NPRAP de migrer au noyau et d'activer certains gènes est bien établi mais il est impossible pour le moment de la rallier à la MA.

Les bactériophages sont des maîtres manipulateurs, prenant le contrôle complet d'une cellule bactérienne, contournant les systèmes de défense et détournant la machinerie de transcription et de traduction du génome bactérien pour la réplication virale. Les grandes étapes de la multiplication des phages sont connues, pourtant les mécanismes intrinsèques de cette prise de contrôle restent un mystère bien préservé. Malgré la petite taille et la simplicité relative des génomes de phages, seuls les gènes associés à la structure des virions sont amplement caractérisés. Toutefois, les protéines non structurales qui sont susceptibles d'être responsables de la prise de contrôle sont rarement étudiées. C'est effectivement le cas pour le phage modèle 2972, infectant la souche Streptococcus thermophilus DGCC7710 largement utilisée en industrie laitière. Son génome code pour 44 protéines putatives, dont 14 protéines sont classées comme étant non structurales et dont aucune fonction n'est encore associée. Lors de ce projet de maîtrise, le système CRISPR-Cas de type II-A, naturellement présent chez S. thermophilus, a été utilisé à des fins d'édition du génome de ce phage pour étudier le rôle des protéines non structurales. Ce système est idéal pour les manipulations génétiques des phages virulents généralement complexes à modifier. Ainsi, une connaissance approfondie des interactions entre le phage et son hôte sera un outil indispensable pour développer de meilleures méthodes de contrôle des phages en industrie laitière. / Bacterial viruses are master manipulators of bacterial cells. They are able to take complete control of a bacterium, bypassing bacterial immune systems, hijacking core transcription and translation machinery, and typically resulting in lysis of the host. Although the major steps of phage replication are well understood, very little is known about the mechanisms of the host-cell takeover. Despite phages having relatively small and 'simple' genomes, generally only the structural proteins have been well characterized. In contrast, non-structural proteins, which include those involved in host cell takeover, tend to be completely uncharacterized. This is certainly the case for the model of Streptococcus thermophilus phages, 2972, which infects the strain DGCC7710 widely used by the dairy industry. Its genome encodes for 44 putative proteins, 14 of which are non-structural and have no known function. In this master thesis, the type II-A CRISPR-Cas system naturally present in S. thermophilus was used for genome engineering purposes to investigate the role of non-structural proteins of phage 2972. This natural bacterial immune system provides an ideal means for genetic manipulation of virulent phages, which are otherwise intractable. This could lead to potentially valuable discoveries allowing us to further fine-tune the bacteria used in various biological processes.

Les polymorphonucléaires neutrophiles sont les principales cellules effectrices du système immunitaire inné. Les cristaux d'urate monosodique sont l'agent étiologique de l'arthrite goutteuse. L'interaction directe entre les neutrophiles humains et les cristaux d'UMS est essentielle pour le déclenchement de la crise de goutte aiguë. Le principal objectif de ce projet de recherche est d'identifier les voies de signalisation activées par les cristaux d'UMS et de caractériser leurs fonctions dans les réponses des neutrophiles humains.

La maladie d'Alzheimer (MA) est la forme de démence la plus commune. Cette maladie neurodegenerative reliée à l'âge est caractérisée par des pertes de mémoire ainsi qu'une diminution des facultés de planification et de pensée. À ce jour, aucun traitement efficace n'est disponible pour ralentir ou arrêter l'évolution de la maladie. Selon la théorie de la cascade amyloïde, cette maladie, d'apparition héréditaire ou spontanée, serait causée par une accumulation de protéines bêta-amyloïde (Aβ) dans le cerveau des patients. La présence d'oligomères Aβ solubles serait hautement associée à l'accumulation d'enchevêtrements neurofîbrillaires ainsi qu'à une réaction inflammatoire importante. Les microglies sont reconnues comme les cellules immunitaires du cerveau. Pendant la MA, ces cellules sont reconnues pour produire des cytokines pro-inflammatoires et des molécules nocives pour les neurones. Ces cellules seraient cependant très importantes pour l'élimination de l'Aβ par phagocytose et pourrait alors être bénéfiques en empêchant l'évolution de la MA. Une meilleure compréhension des molécules impliquées dans l'activation des cellules microgliales contre les protéines Ap pourrait permettre le développement de nouveaux traitements contre la MA. Nous avons donc démontré que les cellules microgliales exprimaient le Toll-like receptor 2 (TLR2) en réponse à l'Aβ. De plus, plusieurs évidences démontrent aussi que ces récepteurs seraient très importants pour l'élimination de l'Aβ. Nous avons ici utilisé un modèle murin de MA pour démontrer l'importance du récepteur TLR2 ainsi que de la voie de signalisation intracellulaire dépendante de la protéine adaptatrice MyD88 dans l'évolution de la MA. L'importance de l'expression de ces protéines dans les cellules microgliales infiltrant le cerveau chez l'adulte a aussi été démontrée par la production de souris chimériques et par les techniques de thérapie génique, c'est-à-dire par la transduction de cellules de la moelle osseuse par un vecteur lentiviral. Ces résultats ont été obtenus dans le but de connaître davantage l'activation microgliale et l'élimination de l'Aβ du cerveau. Dans un avenir rapproché, ces connaissances nous permettront de moduler le système immunitaire des patients atteints de cette maladie dans le but d'arrêter ou du moins de ralentir sa progression.

Le neutrophile humain est impliqué dans la première ligne de défense du corps humain. Pour jouer ce rôle le neutrophile doit se rendre au site inflammatoire et phagocyter les agents microbiens. L'objectif de cette étude est d'étudier les mécanismes impliqués lors de la chimiotaxie des neutrophiles et la phagocytose. Les résultats obtenus permettent d'identifier plusieurs voies de signalisation impliquées dans ces deux réponses majeures du neutrophile et décrivent des différences majeures entre les signaux chimiotactiques qui permettent une spécialisation de la réponse.