L’astringence est une sensation de sécheresse ressentie en bouche lors de la dégustation des vins rouges, qui résulte de la complexation entre les polyphénols du vin et les protéines de la salive, provoquant une diminution de lubrification en bouche. Parmi les protéines salivaires, les protéines riches en prolines (PRP) sont connues pour leur capacité à se lier aux polyphénols et à précipiter avec eux. Une meilleure connaissance de ce phénomène au niveau moléculaire est nécessaire pour le comprendre et le maîtriser. Il a été montré qu’un peptide de quatorze acides aminés, IB714, dont la séquence est conservée au sein des protéines riches en proline, était un mime représentatif des PRP. Un travail préliminaire par spectrométrie de masse résolue en énergie a permis de caractériser les interactions entre des polyphénols et le peptide IB714. Une échelle d’affinité en phase gazeuse a ainsi été déterminée. Cependant, cette méthodologie d’analyse d’un système modèle ne permet pas de s’accommoder de la complexité du vin. C’est pourquoi nous avons conçu une nouvelle stratégie reposant sur l'utilisation de sondes moléculaires immobilisée sur des billes magnétiques. Dans un premier temps nous avons élaboré une sonde peptidique, en greffant le peptide IB714 sur des billes magnétiques portant des fonctions carboxylates. Cette sonde peptidique a ensuite été étudiée avec des polyphénols modèles. Après sédimentation des billes magnétiques, les polyphénols non captés par la sonde ont été dosés par spectrométrie de masse en utilisant un étalon interne. Une échelle d'affinité en phase liquide a été établie de cette manière. Les positions relatives des polyphénols modèles sur cette échelle sont similaires à celles qui ont été établies en phase gazeuse. Dans un second temps, nous avons construit sur le même principe une sonde polyphénolique. Pour cela, un polyphénol modifié chimiquement a été immobilisé sur des billes magnétiques portant des fonctions amines. Cette sonde polyphénolique a été utilisée pour étudier l'interaction avec le peptide IB714. Par ailleurs, pour préparer une étude des interactions entre polyphénols et protéines salivaires avec des mélanges plus complexes que les systèmes modèles, une étude de fractionnement des protéines salivaires a été entreprise, permettant notamment de d’éliminer l’amylase, protéine majoritaire de la salive humaine. De même, un fractionnement d’un vin rouge a été entrepris pour disposer de fractions de tannins caractérisées par spectrométrie de masse. La sonde peptidique est l’outil moléculaire qui offre le plus de perspectives de développement ultérieur. / Astringency is a pucker or dry mouth sensation, typically experimented with red wine tasting, that finds its origin in the complexation of polyphenols with salivary proteins, producing a reduced lubrication of the oral cavity. Among salivary proteins, proline rich proteins (PRPs) are well known for their capacity to bind and precipitate dietary polyphenols. A better knowledge of this phenomenon at the molecular level is required in order to master it. A 14 amino acid stretch from the PRP IB7 has been synthesized and shown to be a representative mimic of PRPs. Previous work by Energy Resolved Mass Spectrometry (ERMS) allowed characterizing the keys parameters of the interactions between these polyphenols and the IB714 probe. An affinity scale in the gas phase was determined in this way. However, the ERMS approach was hardly compatible with the complexity of wine polyphenols, and a validation of the affinity scale in condensed phase was required. Thus, we designed a new strategy relying on the use of molecular probes immobilized on magnetic beads. A peptidic probe was obtained by grafting the synthetic IB714 peptide on magnetic beads bearing carboxylate functions, and used to study its interaction with model polyphenols. After magnetic precipitation of the beads, unbound polyphenols left in the supernatant were quantified by mass spectrometry using an internal standard. An affinity scale in liquid phase was established in this way. Relative positions of model polyphenols on this latter scale were similar to those determined by ERMS. A polyphenolic probe was obtained by grafting a model polyphenol on beads bearing amine functions. This probe has been used to study the interaction with IB714. To prepare further work on more complex mixtures, attempts were made to fractionate human saliva; this allowed eliminating amylase, the major salivary protein. Wine tannins were also fractionated, in order to isolate condensed polyphenols that are characterized by mass spectrometry. The peptidic probe is the molecular tool that offers the best perspectives for future work.

Le système de communication SCF/KIT est impliqué dans le développement et l’homéostasie de plusieurs lignages cellulaires. Des dysfonctionnements de la voie sont à l’origine de pathologies affectant ces compartiments. En particulier, des mutations gain-de-fonction, qui entraînent l’activation constitutive du récepteur à activité tyrosine kinase KIT, sont responsables de néoplasies chez l’homme.L’objectif des travaux réalisés durant cette thèse était d’étudier certaines spécificités de la signalisation de formes oncogéniques de KIT, ceci dans le modèle du mastocyte transformé par l’oncogène KIT-D816V. Cette étude a été menée au niveau proximal sur le récepteur lui-même ainsi qu’au niveau distal sur la voie STAT ,une des voies de signalisation spécifiquement activée de manière constitutive par le récepteur mutant.Au niveau proximal, nous avons pu montrer que le motif dityrosine Y568-Y570situé dans le domaine juxtamembranaire de hKIT est une plateforme majeure de recrutement des effecteurs de la signalisation intracellulaire avec au moins 15partenaires différents recrutées. Par ailleurs l’étude de modèles cellulaires dans des analyses liées aux fonctions physiologiques du récepteur réalisés in vitro et in vivo ont révélé que le site est impliqué dans la régulation négative du signal transformant issu de l’oncogène KIT-D816.Au niveau distal, nous avons analysé les mécanismes de phosphorylation des protéines STAT1, -3 et -5 ainsi que l’importance fonctionnelle de leur activation dans la transformation dépendante de KIT-D816. Nous avons ainsi étudié la contribution de différentes kinases dans les phosphorylations activatrices des STATs sur tyrosine et serine. Nos résultats suggèrent que seul STAT5 a une activité transcriptionnelle dans nos modèles suggérant une implication potentielle non canonique des STAT1et -3 dans la transformation dépendante de KIT-D816.L’ensemble de nos travaux contribue à une meilleure compréhension des mécanismes de l’oncogenèse dépendante de KIT-D816, un point critique dans le développement raisonné de thérapeutiques anticancéreuses ciblées. / The receptor tyrosine kinase KIT and its ligand, the stem cell factor (SCF), are implicated both in the development and the homeostasis of multiple cell lineages. Dysfunctions in the KIT/SCF pathway are involved in several pathologies affecting these compartments. In particular, gain-of-function mutations that lead to constitutive activation of the receptor KIT are found in human neoplasia.The purpose of this thesis project was to investigate some differences between normal and oncogenic signalling of KIT receptor using mast cells transformed by the KIT-D816 oncogene as a model. This question was analysed at aproximal level on the oncogenic receptor itself and at a more distal level on the STAT signal transduction pathway, which is specifically and constitutively activated by theKIT-D816 mutant.At the proximal level, we show that the juxtamembrane dityrosine motif Y568-Y570 of KIT is the major platform of recruitment of intracellular signalling partnerswith more than 15 interactors found in mast cells. Furthermore, the analysis ofcellular models in both in vitro and in vivo assays related to KIT physiological functions has revealed the negative role of the motif in KIT-D816-mediated cell transformation. At the distal level, we have analysed the mechanisms of phosphorylation ofSTAT1, -3 and -5 proteins and the functional relevance of their activation in KITD816-mediated transformation. We describe the contribution of different kinases inthe phosphorylation of STATs on both serine and tyrosine residues. Our results suggest that only STAT5 is transcriptionaly active whereas STAT1 and STAT3 are not, suggesting a non conventional implication of their activation in celltransformation. Our work contributes to a better understanding of the mechanisms of KITD816-mediated oncogenesis and could be used to improve the rational developmentof new targeted cancer therapies

Le système Tol-Pal est un complexe de l’enveloppe d’Escherichia coli composé de CINQ protéines. Les protéines ToIQ, ToIR, TolA forment un complexe dans la membrane interne; la lipoprotéine Pal interagit avec le peptidoglycane avec la protéine périplasmique TolB. Ce système est conservé chez la plupart des bactéries à Gram négatif. Il joue un rôle important dans le maintien de la stabilité de l’enveloppe et dans l’étape tardive de la division cellulaire. Une interaction entre TolA et Pal relie les membranes interne et externe, et dépend des protéines ToIQ, TolR et de la force proton motrice (PMF). Les protéines ToIQ-R-A formeraient un moteur moléculaire utilisant la PMF afin de relier membranes interne, externe et le peptidoglycane. Mon travail a consisté à étudier l’organisation des segments transmembranaires (STs) de TolQ et TolR au sein de la membrane interne d’E. coli en utilisant l’approche expérimentale du « cysteine scanning ». Ainsi, nous avons pu identifier les résidus impliqués dans les interactions entre les STs et améliorer la connaissance de l’organisation moléculaire de ce système. Nous avons aussi démontré la dimérisation du ST de TolRet l’importance de la dynamique dans le fonctionnement de ce moteur. Le système Tol est parasité par certaines toxines (comme les colicines) et par des phages filamenteux. Les colicines sont produites par des souches d’Escherichia coli et active contre les entérobactéries. Je me suis aussi intéressé à l’organisation structurale de la protéine d’immunité de la colicine A. La colicine A forme un canal ionique dans la membrane interne pour tuer la bactérie cible. Les cellules produisant la Colicine A synthétisent également une protéine d’immunité (Cai) qui les protègent de l’action de la colicine A. Par une approche combinant « cysteine scanning » classique et un « anti-cysteinescanning », nous avons pu apporter des informations nouvelles sur l’organisation des quatre STs deCai. Nous avons montré que Cai forme un dimère dans la membrane et que ce dimère se dissocie au contact de sa cible, la colicine A. / The Tol-Pal system is a protein complex of the Escherichia coli cell envelope. It consists offive proteins. The ToIQ, TolR, TolA proteins form a complex in the inner membrane, the lipoproteinPal interacts with the peptidoglycan and with the periplasmic protein TolB. This system is conservedin most Gram-negative bacteria. It plays an important role in maintaining the integrity of the outermembrane and in the late stage of cell division. The interaction between Pal and TolA connects innerand outer membranes and depends on ToIQ, TolR and the proton motive force (pmf). The ToIQ-R-Aproteins are suspected to form a molecular motor using pmf to connect the inner and outermembranes and the peptidoglycan. The first aim of my work was to study the organization of thetransmembrane helices (TMHs) of E. coli TolQ and TolR using the cysteine scanning approaches. Weidentified residues involved in the interactions between the TMHs and improved the knowledge ofthe molecular organization of this system. We have also demonstrated the dimerization of the TMHof TolR and the importance of its dynamic movement in the system. The second aim of my work wasto analyze the structural organization of the immunity protein to colicin A. The colicins are producedby certain strains of E. coli and are active against other Enterobacteriaceae. The colicin A forms anion channel in the bacterial inner membrane which kill the bacteria. It hijacks the Tol system to enterin the cell. Cells producing colicin A also synthesize the colicin A immunity protein (Cai) whichprotects the producing cells against the action of colicin A. The approaches combining "cysteinescanning" and "anti-cysteine-scanning”, we found that Cai form a dimer in the membrane whichdissociates upon contact with its target, the colicin A

Le mauvais pronostic du cancer pancréatique est en partie dû à l’acquisition extrêmement rapide de propriétés invasives et métastatiques par les cellules tumorales pancréatiques et à la faible efficacité des thérapies actuelles. Il est donc essentiel d’identifier de nouvelles cibles utiles au développement de nouvelles stratégies thérapeutiques. Nos travaux impliquent directement la diminution de l'expression d'ArgBP2 dans le processus de dérivation ma ligne du pancréas. ArgBP2 est une protéine adaptatrice régulant la dynamique du cytosquelette d’actine et la transduction des signaux. Nous avons montré que l’activité anti-tumoraled’ArgBP2 in vivo est corrélée à une diminution de l’adhésion, de l’étalement et de la migration des cellules cancéreuses pancréatiques in vitro. Dans le but d’identifier les fonctions associées à son rôle anti-tumoral, nous avons recherché de nouveaux partenaires moléculaires d’ArgBP2 et mis en évidence son interaction avec les protéines WAVE (facteurfavorisant la polymérisation de l’actine), la phosphatase PTP-PEST et la protéine adaptatriceCIP4 qui elles-mêmes sont connues pour réguler le cytosquelette d’actine et la motilité cellulaire. De manière intéressante, nous avons montré que PTP-PEST est indispensable à l’inhibition de la migration cellulaire par ArgBP2. Par ailleurs, nos résultats montrentqu’ArgBP2 régule la fonction de WAVE1 en contrôlant sa phosphorylation par la kinase c-Abl et sa déphosphorylation par PTP-PEST. Nous avons en outre montré que CIP4 est aussi un partenaire de WAVE1, phosphorylé par c-Abl, et qu’elle participe à cette régulation. Enfin,nos résultats mettent en évidence un rôle essentiel de la phosphorylation et de la dimérisationd’ArgBP2 dans la régulation de ses interactions avec ses partenaires et de ses fonctions. / The poor prognosis of pancreatic cancer is partly due to the early acquisition of invasive andmetastatic properties by pancreatic tumoral cells and to the limited efficacy of actualtherapies. Thus, the identification of new targets for novel therapeutic strategies is animportant challenge. Our works directly implicate the decrease of ArgBP2 expression in thetumorigenic process of pancreatic cancer. ArgBP2 is an adaptor protein regulating actincytoskeleton dynamics and cell signaling. We found that the anti-tumoral activity of ArgBP2is correlated with the inhibition of the adhesion, spreading and migration of pancreaticcancerous cells. In order to better understand its anti-tumoral function, we searched newpartners for ArgBP2 and identified, among them, WAVE1 (a nucleation promoting factor),the phosphatase PTP-PEST and the adaptor protein CIP4, which are known to regulate actincytoskeleton and cellular motility. Interestingly, we found that PTP-PEST is necessary toArgBP2 mediated inhibition of cell migration. Additionally, we showed that ArgBP2regulates WAVE1 function by controlling its phosphorylation by c-Abl kinase and itsdephosphorylation by PTP-PEST. Moreover we found that CIP4 is also a WAVE1 interactingprotein, phosphorylated by c-Abl, and that CIP4 participates to the ArgBP2 dependent controlof WAVE1. Finally, our results highlight a primordial role of ArgBP2 phosphorylation anddimerization in the control of its interactions with its partners and in the regulation of itsfunctions

RhoH est une petite protéine G de la famille Rho constitutivement activée. Cette protéine, exclusivement exprimée dans les cellules hématopoïétiques, intervient dans le développement du système immunitaire. Elle régule la croissance des cellules souches et des progéniteurs hématopoïétiques, la différenciation des lymphocytes T et la signalisation des récepteurs TCR, BCR et FcεRI présents respectivement à la surface des cellules T, B et des mastocytes. La dérégulation de l’expression du gène RHOH est un facteur de progression tumorale dans certaines leucémies. En effet, l’augmentation de son expression dans la Leucémie Lymphoïde Chronique (LLC) et sa répression dans la leucémie à tricholeucocytes (HCL) sont des évènements impliqués dans la progression de ces maladies. La LLC et l’HCL sont deux pathologies affectant des lymphocytes B matures mais, pour cette dernière, les cellules présentent un état de différenciation plus avancé. RhoH module donc différemment les processus de prolifération, de migration et de survie cellulaires selon le stade de maturation des cellules, suggérant que son expression soit finement régulée dans les cellules hématopoïétiques. Au laboratoire, notre équipe a mis en évidence la répression de RHOH dans l’HCL, responsable de la progression de cette maladie. Cette expression anormale est le résultat d’une diminution des transcrits RHOH initiés en amont de l’exon 4. Le même phénomène a également été observé dans la leucémie T de l’adulte (ATL). L’HCL et l’ATL sont deux maladies caractérisées par une prolifération anormale de cellules matures activées de type B (HCL) ou de type T (ATL). Nous avons donc projeté de comprendre les mécanismes moléculaires intervenant dans la régulation physiologique du gène RHOH au cours de l’activation lymphocytaire B et T ; puis de mettre en évidence les évènements responsables de la répression de RHOH dans l’HCL et l’ATL. Notre objectif serait d’y restaurer l’expression de RHOH et ainsi d’essayer de contrecarrer le phénotype leucémique, ceci dans le but de proposer de potentielles nouvelles cibles thérapeutiques dans ces deux leucémies, dont les traitements sont soit inefficaces (ATL), soit satisfaisants mais associés à des taux de rechutes assez élevés (HCL). Notre projet s’est tout d’abord orienté sur l’étude de la régulation normale du gène RHOH dans les cellules B et T. Nos résultats ont permis de montrer que l’expression du gène RHOH est principalement due à l’activité du promoteur P3 dans les lymphocytes B et T normaux et dans des lignées cellulaires lymphoïdes. Dans les lignées lymphoïdes B, le promoteur P3 a été caractérisé et correspond à la séquence -236/+67, en regard du site d’initiation de la transcription. Nous avons observé une augmentation de son activité suite à l’activation de ces cellules par un analogue du diacylglycérol (DAG), suggérant que des facteurs de transcription comme AP1, complexe formé des membres des familles Jun et Fos, sont impliqués dans la régulation du gène RHOH dans des lignées cellulaires lymphoïdes B. Nos résultats ont également permis de mettre en évidence : d’une part, la fixation de JunD sur le promoteur P3, par immunoprécipitation de la chromatine et son rôle de régulateur négatif dans la transcription de RHOH ; d’autre part, l’importance des membres de la famille Fos dans l’expression de ce gène, dans la lignée lymphoïde B Raji. Dans les lymphocytes T, l’activation des cellules par des anticorps anti-CD3 et anti-CD28 a permis d’observer une variation biphasique de l’expression des transcrits RHOH initiés en amont de l’exon 4, au niveau du promoteur P3 : tout d’abord, une forte augmentation du taux des ARN messagers, reproduite par l’utilisation d’un ionophore pour le calcium, suivie d’une répression, mimée par l’analogue du DAG. / The hematopoietic GTPase RhoH is an atypical family member of the Rho GTPases as it is constitutively active and not regulated through the classical cycling between GTP- and GDP-bound state. A number of studies investigated the role of RhoH in hematopoietic cells. RhoH is associated with regulation of proliferation of hematopoietic stem and progenitors. This protein exhibits essential functions in thymocyte development and TCR, BCR, FcεRI signaling in T, B and mast cells, respectively. Recently, a report provided evidence implicating RhoH overexpression in the initiation and progression of Chronic Lymphocytic Leukemia (CLL); on the other hand, RhoH underexpression has been implicated in the progression of Hairy Cell Leukemia (HCL). Most data indicate that RhoH is an important regulatory molecule with antagonistic functions in proliferation, adhesion or migration in hematopoietic cells and therefore must be accurately regulated. Previous experiments from our laboratory reported that HCL is characterized by abnormal underexpression of RhoH, corresponding to a decreased level of RHOH mRNA initiated upstream of exon 4. Reconstitution of RhoH expression reduced proliferation, adhesion and migration that is central in HCL pathogenesis. Transcriptional repression of this gene was also observed in another leukemia, Adult T cell Leukemia (ATL). Aimed at identifying new therapeutic targets to combat HCL and ATL, we wanted to examine molecular mechanisms implicated in RhoH underexpression in both diseases. HCL and ATL are chronic lymphoproliferative disorders characterized by proliferation of mature cells with memory B cell or T-helper cell phenotype, respectively. In the first part of our work, we wanted to investigate molecular mechanisms mediating normal RhoH expression in activated B and T cells, as well as induced pathways; in the second part, we tempted to identify transcription factors implicated in RhoH repression in HCL and ATL. Firstly, our work has focused onto physiological expression of RHOH gene in B and T cells. We showed that RHOH gene expression observed in these cells was mostly due to transcriptional activity of P3 promoter, upstream of RHOH exon 4. The promoter was isolated spanning nucleotides -236/+67 relative to the transcription start site, in B cells. B cells stimulation by PMA (Phorbol-12-Myristate-13-Acétate) induced an increase of P3 promoter activity. PMA is a DiacylGlycerol (DAG) analogous. This result suggested that transcription factors related to DAG pathway stimulation, like AP1 (Activator Protein 1), could be responsible for RHOH expression in B cells. We could show that the Jun family member JunD is able to bind to endogenous P3 promoter and can act as a repressor of RHOH expression in a B cell line, Raji. Other Jun family members seemed not to be implicated in this regulation. We also reported that Fos family members are important in RHOH expression. Our results suggest that the transcription factor AP1 could regulate this process in B cells. T cell activation by antibodies directed against CD3 and CD28 induced biphasic kinetics of expression of RHOH mRNA initiated upstream of exon 4. We observed a high increase of RHOH transcript level, mimicked by use of ionomycin, followed by an important decrease, mimicked by use of PMA. RHOH P3 promoter was isolated in a T cell line, Jurkat, then we investigated putative binding sites for transcription factors, which could be implicated in this biphasic event in T cells. Our preliminary results have shown that some potential binding sites for transcription factors related to calcium pathway and inducing RHOH expression are present between nucleotides -236 and -201; also sites for transcription factors induced by DAG pathway and repressing this gene are present between nucleotides -583 and -380.

Le séquençage intégral du génome de Mycobacterium tuberculosis a permis de mettre en évidence l’existence de onze Sérine/Thréonine Protéine-Kinases (STPKs) chez cette bactérie. Bien que la quasi-totalité des STPKs aient été biochimiquement caractérisées, très peu de substrats endogènes ont pu être identifiés. Par conséquent, le rôle physiologique de ces couples kinase/substrat reste à élucider. Tout d’abord, les études réalisées au cours de ce travail ont concerné la caractérisation biochimique de la protéine-kinase PknL, ainsi que l’identification de ses substrats potentiels, et notamment la protéine Rv2175c. En effet, l’analyse de l’environnement génétique du gène pknL de la kinase a révélé la présence du gène adjacent rv2175c, pouvant ainsi représenter un substrat éventuel de PknL. Les différentes approches mises en oeuvre ont permis d’identifier cinq sites de phosphorylation sur PknL, et de mettre en évidence le caractère essentiel des résidus K48, T173 et T175 dans les mécanismes d’autophosphorylation de PknL et de phosphorylation de Rv2175c, confirmant ainsi Rv2175c comme substrat spécifique de PknL. Par ailleurs, la caractérisation par RMN de la structure de Rv2175c a permis de déterminer la fonction de cette protéine. Rv2175c possède toutes les caractéristiques structurales d’une protéine capable de fixer l’ADN. Des études fonctionnelles ont permis de confirmer la capacité de Rv2175c de fixer l'ADN et ont mis en évidence le mécanisme de régulation via phosphorylation régissant son activité de fixation. Ensuite, nous avons mis en évidence la phosphorylation des protéines chaperonnes mycobactériennes et, plus particulièrement, caractérisé GroEL1. Nous avons démontré que GroEL1 était phosphorylée par PknF, et identifié les résidus T25 et T54 comme étant les sites de phosphorylation de GroEL1. L’ensemble de cette étude nous a donc permis de caractériser de nouveaux substrats de phosphorylation chez M. tuberculosis, de mieux appréhender les interactions kinase/substrat et d’impliquer la phosphorylation dans la régulation de l’activité de ces substrats / Analysis of the genome sequence of Mycobacterium tuberculosis predicted the presence of eleven Serine / Threonine Protein-Kinases (STPKs). Although most kinases have been investigated for their physiological roles, little information is available regarding how STPK-dependent phosphorylation regulates the activity of kinase substrates. As a result, the physiological role of these kinase / substrate couples remains to be clarified. During the course of this work, we first characterized a substrate/kinase pair, PknL/Rv2175c. Moreover, pknL (rv2176) is adjacent to rv2175c, a gene encoding a putative DNA-binding transcriptional regulator. We demonstrated that PknL can recruit and phosphorylate Rv2175c and that phosphorylation of Rv2175c was dependent on a specific phosphorylated residue located within the activation loop of PknL. However, although Rv2175c harbours a DNAbinding domain carrying a helix-turn-helix (HTH) motif, it shares only weak similarity to transcriptional regulatory proteins. Therefore, to provide further evidence for the function of Rv2175c, we have solved the soluble NMR structure of Rv2175c. In addition, we confirmed by gel shift mobility assays that Rv2175c was indeed able to bind DNA. More importantly, we identified Thr9 as the unique phosphorylation site in Rv2175c, and demonstrated that phosphorylation of Rv2175c strongly altered its DNA-binding activity. In addition, although mycobacterial GroEL1 proteins have been extensively studied, no data were available with respect to their potential post-translational modifications. We reported here, for the first time, phosphorylation of the M. tuberculosis GroEL1 chaperone. We demonstrated that M. tb GroEL1 is phosphorylated by PknF at two positions, Thr25 and Thr54. Unexpectedly, Mycobacterium smegmatis GroEL1 is not a substrate of its cognate PknF. This study showed that the phosphorylation profile of conserved proteins is species dependent and provides insights that may explain the numerous biological functions of these important proteins

Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Les protéines existent sous différents états fonctionnels régulés de façon précise par leur environnement afin de maintenir l‘homéostasie de la cellule et de l‘organisme vivant. La prévalence de ces états protéiques est dictée par leur énergie libre de Gibbs alors que la vitesse de transition entre ces états biologiquement pertinents est déterminée par le paysage d‘énergie libre. Ces paramètres sont particulièrement intéressants dans un contexte thérapeutique et biotechnologique, où leur perturbation par la modulation de la séquence protéique par des mutations affecte leur fonction. Bien que des nouvelles approches expérimentales permettent d‘étudier l‘effet de mutations en haut débit pour une protéine, ces méthodes sont laborieuses et ne couvrent qu‘une fraction de l‘ensemble des structures primaires d‘intérêt. L‘utilisation de modèles bio-informatiques permet de tester et générer in silico différentes hypothèses afin d‘orienter les approches expérimentales. Cependant, ces méthodes basées sur la structure se concentrent principalement sur la prédiction de l‘enthalpie d‘un état, alors que plusieurs évidences expérimentales ont démontré l‘importance de la contribution de l‘entropie. De plus, ces approches ignorent l‘importance de l‘espace conformationnel protéique dicté par le paysage énergétique cruciale à son fonctionnement. Une analyse des modes normaux peut être effectuée afin d‘explorer cet espace par l‘approximation que la protéine est dans une conformation d‘équilibre où chaque acide aminé est représenté par une masse régie par un potentiel harmonique. Les approches actuelles ignorent l‘identité des résidus et ne peuvent prédire l‘effet de mutations sur les propriétés dynamiques. Nous avons développé un nouveau modèle appelé ENCoM qui pallie à cette lacune en intégrant de l‘information physique et spécifique sur les contacts entre les atomes des chaînes latérales. Cet ajout permet une meilleure description de changements conformationnels d‘enzymes, la prédiction de l‘effet d‘une mutation allostérique dans la protéine DHFR et également la prédiction de l‘effet de mutations sur la stabilité protéique par une valeur entropique. Comparativement à des approches spécifiquement développées pour cette application, ENCoM est plus constant et prédit mieux l‘effet de mutations stabilisantes. Notre approche a également été en mesure de capturer la pression évolutive qui confère aux protéines d‘organismes thermophiles une thermorésistance accrue.

Mémoire numérisé par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal.