Le pronostic de l’arrêt cardiaque (AC) reste dramatique. Diagnostiquer sa cause rapidement et prédire précocement son pronostic ("pronostication") de manière fiable permettrait de mieux guider les traitements initiaux, en évitant de traiter futilement les patients avec faible probabilité d’évolution favorable ou à l’inverse de permettre d’intensifier le traitement de patients avec forte probabilité d’évolution favorable. Les biomarqueurs, dont l’utilité diagnostique et pronostique reste débattue, semblent actuellement insuffisamment sensibles et précis, surtout dans les 1ères heures après la reprise de l’activité circulatoire spontanée (RACS). Dans l’algorithme pronostique, seule la Neuron Specific Enolase (NSE) est validée après le 3ème jour post-AC et en 2ème intention. Notre première étude a montré que la valeur diagnostique des biomarqueurs "spécifiques" des lésions cérébrales en post-AC (protéine S100B : S100 et surtout NSE) était insuffisante, à l’admission en réanimation, pour étayer précisément le diagnostic de cause neurologique d’AC. Si la coronarographie précoce est l’outil diagnostique de référence de l’AC de probable cause cardiaque, les biomarqueurs ne peuvent remplacer le scanner cérébral pour diagnostiquer une cause neurologique d’AC. La deuxième étude a évalué, au 1er jour post-AC, S100 et NSE avec 2 témoins d’œdème cérébral proposés comme outils pronostiques : le diamètre de l’enveloppe du nerf optique (DENO) par échographie et le rapport de dédifférenciation substance grise / substance blanche (DSG/B) par scanner cérébral. Même si une relation directe ne peut être affirmée formellement entre ces paramètres, l’élargissement du DENO à J1 post-AC était corrélé aux lésions cérébrales, surtout l’œdème cérébral et les lésions neuronales suspectés sur l’élévation de la NSE (à l’admission et à J1) et la baisse de DSG/B. Si NSE, DSG/B et DENO à J1 étaient liés, S100, plus spécifique de la glie, n’était pas corrélée au DENO ni au DSG/B. NSE et S100 à l’admission, à J1 et J2 post-RACS et DENO à J1 étaient associées à la mortalité hospitalière. La troisième étude évaluait la valeur pronostique des biomarqueurs à la phase précoce de l’AC (NSE et S100 étant prélevées en médiane 220 min après la RASC). S100, réalisée en aveugle des cliniciens, était le biomarqueur le plus précis à l’admission en réanimation pour prédire correctement le pronostic défavorable à la sortie de l’hôpital et à 3 mois après AC, par rapport au lactate, pH et créatininémie, et surtout à la NSE. Les variations de S100 dans le temps permettaient d’affiner cette prédiction. S100 à l’admission était un facteur indépendant du pronostic défavorable à la sortie de l’hôpital, avec la durée sans massage cardiaque, le rythme initial non-choquable, le lactate initial et la présence de convulsion clinique. Selon les recommandations, la pronostication nécessite théoriquement d’être différée et multimodale, les biomarqueurs seuls n’étant pas recommandés, surtout précocement. Les biomarqueurs ne peuvent constituer une alternative, en comparaison à l’imagerie, pour l’aide diagnostique de la cause d’AC. A l’inverse, certains biomarqueurs comme la S100 après admission pourraient facilement et spécifiquement discriminer les AC ayant une certitude de pronostic défavorable. Associée à d’autres outils prédictifs clinico-radiologiques, la S100 pourrait être incorporée dans des algorithmes permettant de guider les thérapeutiques initiales. Une pronostication correcte précoce pourrait éviter des traitements invasifs inutiles, ou au contraire optimiser certaines thérapeutiques agressives. Le choix de méthodes recommandées et automatisées de contrôle ciblé de la température, très efficaces mais invasives et onéreuses, ou l’indication d’utiliser -ou pas- une assistance cardio-circulatoire extra-corporelle pourrait bénéficier d’une telle stratégie précoce de sélection des patients. / Outcome of cardiac arrest (CA) remains dramatic. To quickly diagnose the cause of CA and establish a reliable outcome prediction (prognostication) as early as possible could help to guide initial treatments. It could avoid futile treatments in patients with low chance of survival or of good neurological recovery, or conversely allow treatment optimization in patients expected to have a high likelihood of good neurological outcome. Usefulness of biomarkers to guide clinicians in finding the CA diagnosis and helping prognostication is debated. Biomarkers are considered as not sensitive and accurate enough, especially within the first hours after return of spontaneous circulation (ROSC). Their use is only recommended in prognostication for Neuron Specific Enolase (NSE) as a second line tool and after the third day from CA. Our first study confirmed that biomarkers “specific” of brain injury (S100B protein: S100 and moreover NSE) cannot sufficiently discriminate the neurological cause of CA on ICU admission. If early coronary angiogram is the standard for diagnosing a probable cardiac cause of CA, biomarkers cannot replace brain computed-tomography (CT) in CA from a neurological cause. The second study evaluated, during the 1st day after ROSC, the link between biomarkers (S100 and NSE) and 2 surrogates of brain oedema recently proposed as outcome predictors: echography of the optic nerve sheath diameter (ONSD), and grey to white matter attenuation ratio (GWR) on brain CT-scan. Even though we cannot conclude on a definitive relationship between these parameters, ONSD enlargement at day 1 was associated with specific brain damage after CA, such as brain oedema and mostly axonal injuries, as reflected by increases in NSE (on admission and at day 1) and low GWR measurements. Whereas NSE, GWR and ONSD at day 1 were correlated, S100, which is more specific of glial injuries, did not reach significance. NSE and S100 on admission, at days 1 and 2 after ROSC, as well as ONSD at day 1, were associated with survival at hospital discharge. The third study evaluated the prognostic value of several biomarkers in the early phase after CA (NSE and S100 being sampled at median 220 min after ROSC). S100, blinded to physicians, was the biomarker with the best accuracy after ICU admission to correctly predict unfavourable outcome at hospital discharge and at 3 months after CA, compared with all other biomarkers such as lactate, pH, creatinine, and especially NSE. S100 variations during the first day after admission refined prognostication. Initial S100 was an early independent predictive factor associated with unfavourable outcome at hospital discharge, with the no-flow duration, initial lactate value, initial non-shockable rhythm, and the presence of clinical seizure. According to guidelines, prognostication theoretically needs to be delayed and multimodal, biomarkers alone not being recommended especially in the early phase after CA. Biomarkers cannot seem to be an alternative option compared to imaging to precisely diagnose the CA cause. By contrast, some biomarkers, such as S100 after admission, could easily and specifically discriminate CA patients with certainty of unfavourable outcome. Associated with other predictive tools (clinical or using imaging), biomarkers could interestingly be incorporated in early decisional algorithms to optimally guide initial therapies. This correct patient classification could help to avoid unuseful treatments versus to maximize aggressive therapies. The choice of recommended servo-controlled targeted temperature management devices, very efficient but invasive and expensive, or the indication -or not- of a cardio-circulatory assist device implementation should be guided in the early stage after ROSC using this simple strategy of patient selection.

L’Autophagie médiée par les protéines chaperonnes (ou CMA pour Chaperone-Mediated Autophagy) est une voie majeure du catabolisme lysosomal considérée aujourd’hui comme un acteur central de contrôle de nombreuses fonctions cellulaires, et dont les défauts sont associés à plusieurs pathologies humaines, dont des maladies neurodégénératives, des cancers et des troubles du système immunitaire. Selon l’idée actuellement admise, cette fonction cellulaire n’existerait que chez les mammifères ou les oiseaux, qui seraient les seuls à exprimer la protéine LAMP2A, une protéine nécessaire au fonctionnement de la CMA. Or, récemment, nous avons pu mettre en évidence l’existence de séquences exprimées présentant une forte homologie avec LAMP2A de mammifères chez plusieurs espèces de poissons, remettant ainsi en question ce point de vue et suggérant que la CMA soit apparue beaucoup plus tôt au cours de l'évolution qu'on ne l'avait initialement cru. Dans cette thèse, nous retraçons l’histoire évolutive du gène LAMP2 chez les vertébrés. Nous démontrons que ce gène est apparu après la seconde duplication complète du génome survenue chez l'ancêtre commun des vertébrés il y a environ 500 millions d'années. En outre, en adaptant une méthode récemment décrite pour mesurer l’activité de la CMA dans des cellules de mammifères à une lignée de fibroblastes de medaka (Oryzias latipes), nous apportons la preuve de l’existence de cette fonction cellulaire chez cette espèce de poisson. Enfin, afin de caractériser le rôle physiologique de cette fonction chez les poissons, nous avons procédé à l’invalidation par crispR-cas9 de lamp2a chez le medaka. Les poissons générés présentaient de sévères perturbations du métabolisme intermédiaire, comme précédemment décrit chez des souris dont LAMP2A a été invalidée dans le foie. Dans l’ensemble, ces résultats démontrent clairement, et pour la toute première fois, qu’il existe bien une activité CMA fonctionnelle chez les poissons, et apportent ainsi de nouvelles perspectives dans ce domaine de recherche, notamment en autorisant l'utilisation de modèles génétiques complémentaires, tels que le poisson zèbre ou le medaka, pour faire avancer nos connaissances sur les mécanismes régissant cette fonction cellulaire. / Chaperone-Mediated Autophagy (CMA) is a major pathway of lysosomal proteolysis recognized as a key player in the control of numerous cellular functions, and whose defects have been associated to several human pathologies, including neurodegenerative diseases, cancers and immune disorders. To date, this cellular function was presumed to be restricted to mammals and birds, due to the absence of an identifiable lysosome-associated membrane protein 2A (LAMP2A), a limiting and essential protein for CMA, in non-tetrapod species. However, we recently identified the existence of expressed sequences displaying high homology with the mammalian LAMP2A in several fish species, challenging that view and suggesting that CMA appeared much earlier during evolution than initially thought. In the present thesis, we first present new evidences about the evolutionary history of the gene LAMP2 in vertebrates. We demonstrate that LAMP2 appeared after the second whole genome duplication that occurred at the root of the vertebrate lineage approximately 500 million years ago. By using a fluorescent reporter previously used to track CMA in mammalian cells, we then revealed the existence of a CMA-like pathway in a fibroblast cell line of the fish medaka (Oryzias latipes). Finally, to address the physiological role of Lamp2a in fish, we generated, medaka knockout for the splice variant lamp2a, and found severe alterations in the intermediary metabolism, as previously demonstrated in mice deficient for CMA in liver. Altogether, our data provide the first evidence for a CMA-like pathway in fish and bring new perspectives on the use of complementary genetic models, such as zebrafish or medaka, for studying CMA in an evolutionary perspective.

Pour la cellule, l’assemblage du cytosquelette d’actine joue un rôle central dans son déplacement, sa division ou sa morphogenèse. Cette réorganisation est orchestrée par des protéines régulatrices et des contraintes mécaniques. Savoir comment les combinaisons de ces actions biochimiques et physiques régulent les différentes architectures d’actine reste un véritable défi.La formine protéine est un régulateur essentiel de l’actine. Ancrée à la membrane, elle assemble les filaments d’actine (nucléation et élongation) présents dans des architectures linéaires et non branchées. La formine est impliquée notamment dans la génération de filopodes, protrusions guidant la locomotion cellulaire.Une propriété remarquable est sa capacité à suivre processivement le bout barbé d’un filament qu’elle allonge, tout en stimulant son élongation en présence de profiline. La régulation de cette processivité de la formine est encore à clarifier. C’est une caractéristique importante, intervenant dans le contrôle de la longueur des filaments, dont les connaissances sont à approfondir.L’étude de cette processivité est facilitée par l’utilisation d’un outil microfluidique novateur pour l’étude de la dynamique de multiples filaments individuels d’actine in vitro. Au sein d’une chambre en PDMS, les filaments sont ancrés à la surface par un seul bout, le reste s’alignant avec le flux. Nous pouvons précisément y changer l’environnement biochimique,tandis que la friction visqueuse sur les filaments permet d’exercer une tension contrôlée sur chacun d’entre eux.Simultanément à l’action de la formine au bout barbé, j’étudie l’effet d’autres protéines ou de la vitesse d’élongation sur sa processivité, en mesurant son taux de détachement. Par ailleurs nous pouvons reproduire l’ancrage membranaire cellulaire en attachant spécifiquement nos formines à la surface. Dans la chambre, par l’intermédiaire du filament qu’elle allonge, nous pouvons alors exercer des forces et en étudier l’effet sur la formine.Premièrement, j’ai étudié l’impact de la protéine de coiffe (CP) sur l’activité de la formine au bout barbé. La liaison de ces deux protéines aubout barbé a jusqu’ici été considérée mutuellement exclusive. Nous avons observé qu’elles peuvent toutefois se retrouver simultanément liées au bout barbé, au sein d’un complexe à courte durée de vie. Ce complexe ternaire est capable de stopper l’activité du bout barbé même si l’affinité d’une protéine est réduite par la présence de l’autre. Nous proposons qu’une compétition entre la protéine de coiffe et la formine régule la dynamique du bout barbé dans des architectures où les longueurs doivent être hautement contrôlées.J’ai ensuite étudié l’influence de divers facteurs sur la processivité. La processivité est très sensible à la présence du sel et à la fraction demarquage fluorescent utilisée dans nos expériences. Nous avons également observé l’effet de la vitesse d’élongation, qui peut être modifiée en changeant la concentration en actine ou en profiline. D’une part, l’actine réduit la processivité, à n’importe quelle concentration de profiline. D’autre part, la concentration en profiline augmente cette processivité,indépendamment du taux d’élongation. Cela suggère qu’une incorporation de monomère diminue la processivité, tandis que la profiline, par sa présence au bout barbé, l’augmente.Enfin, la tension exercée sur les formines abaisse fortement la processivité : quelques piconewtons réduisent la processivité de plusieurs ordres de grandeurs. Cet effet, purement mécanique, prédomine sur les facteurs biochimiques. Ces résultats nous indiquent que les contraintes mécaniques de tension joueraient un rôle prédominant dans le contexte cellulaire. Cette étude nous aide à construire un modèle plus complet de l’élongation processive par les formines.En conclusion, ce projet permet de mieux comprendre le fonctionnement moléculaire de la formine, en particulier le mécanisme de l’élongation processive et de sa régulation / Actin filament assembly plays a pivotal role in cellular processes such as cell motility, morphogenis or division. Elucidating how the actin cytoskeleton is globally controlled remains a complex challenge. We know that it is orchestrated both by actin regulatory proteins and mechanical constraints.The formin protein is an essential actin regulator. Anchored to the cell membrane, it is responsible for the assembly (nucleation and elongation) of actin filaments found in linear and unbranched architectures. It is notably involved in the generation of filopodia protrusions at the leading edge of a motile cell. One important feature is that it processively tracks the barbed end of an actin filament, while stimulating its polymerization in the presence of profilin.Formin processivity and its regulation is not yet completely understood. As an important factor determining the length of the resulting filament, it must be investigated further.A perfect assay to look at formin processivity in vitro is an innovative microfuidics assay coupled to TIRF microscopy, pioneered by the team, to simultaneously track tens of individual filaments. In a designed chamber,filaments are anchored to the surface by one end, and aligned with the solution flow. We can precisely control the biochemical environment of the filaments. Moreover, we can exert and modulate forces on filaments, due to the viscous drag of flowing solutions. By varying chemical conditions during formin action at the barbed end, I investigated how others proteins or the elongation rate can modulate formin processivity, by looking at the detachment rate of formins.Moreover, we can mimic the membrane anchoring in the cell by specifically attaching formins at the surface. In our chamber, through the filament they elongate, we can apply force to formins.In complement to biochemical studies, we then investigate the effect oftension on their processivity.I first investigated the impact of a capping protein on formin action at the barbed end. Their barbed end binding is thought to be mutually exclusive.We measured that the affinity of one protein is reduced by the presence of the other. However we observed they both can bind simultaneously the barbed end, in a transient complex, which block barbed end elongation.Competition of formin and CP would regulate barbed end dynamics in a cell situation where length is tightly controlled.I next studied formin processivity dependence on various parameters. We show that processivity is sensitive to salt and labelling fraction used in our solutions. We also looked at how processivity is affected by the elongation rate, which can either be varied by actin or profilin concentration. On one hand, actin concentration reduces processivity, at any given concentrationsof profilin. On the other hand, raising the concentration of profilin increasesprocessivity, regardless of the elongation rate. This indicates that theincorporation of actin monomers decreases processivity while in contrast,the presence of the profilin at the barbed end increases it.Moreover, tension exerted on formin was observed to largely favor its detachment. In a quantitative matter, the effect of tension prevails over anyothers biochemical factor on processivity : only a few piconewtons decreaseit by several orders of magnitude. This important effect helps us build amore complete model of processive elongation. These results indicate thatmechanical stress is likely to play an important role in a cellular context.In conclusion, this project brings insights into the molecular properties offormin and helps to decipher the mechanism of processive elongation and its regulation.

Un inconvénient majeur de l’utilisation des protéines thérapeutiques est leur immunogénicité,c'est-à-dire le déclenchement chez les patients d’une réponse immunitaire, avec production d’anticorps (anti-drug antibodies, ADA). Parmi les facteurs contributifs, les agrégats de protéines dans les spécialités administrées pourraient jouer un rôle majeur dans l’immunogénicité. Par ailleurs, la présence d’ADA de haute affinité et de divers isotypes suggère la mise en place d’une réponse immunitaire classique, faisant intervenir les cellules présentatrices d’antigènes et plus particulièrement les cellules dendritiques.Nous avons développé un modèle d’étude de l’impact d’agrégats de protéines sur la maturation de cellules dendritiques, dérivées de monocytes isolés du sang(moDC). Dans ce but, des agrégats d’hormone de croissance (GH) et d’anticorps (Rituximab) ou d’IgG1 polyclonale ont été produits et caractérisés.Nous avons montré que ces agrégats induisent la maturation des moDC, objectivée par une augmentation de l’expression de marqueurs d’activation et de co-stimulation (CD40, CD80,CD83, CD86 et HLA-DR), et par l’augmentation dela production de cytokines et chimiokines proinflammatoires (IL-6, IL-8,IL-12p40, CCL2, CCL3,CCL4 et CXCL10).En utilisant un modèle de co-culture allogénique,nous avons montré que les moDC stimulées par les agrégats induisent la prolifération de lymphocytes TCD4+, dont la polarisation dépendait de la nature de la protéine. Ainsi les agrégats de GH conduisent à une production majoritaire d’IFNγ, signe d’une réponse de type Th1, tandis que les agrégats d’anticorps induisent une réponse mixte, Th1, Th2,Th17 (production d’IFNγ, IL-5, IL-13 et IL-17.Enfin, nous avons commencé l’étude des mécanismes intra cellulaires impliqués dans l’activation des moDC, en montrant que les agrégats de GH induisent la phosphorylation de p38MAPK, ERK, JNK et NF-κB (p65). Ces mêmes voies de signalisation sont impliquées dans l’expression de CXCL10,chimiokine connue pour induire la polarisation Th1.Au final, ces résultats confirment l’effet immunomodulateur des agrégats de protéines sur les cellules dendritiques et précisent leur rôle de signal de danger conduisant à la mise en place d’une réponse immunitaire contre les protéines thérapeutiques. / A major drawback in therapeutic biological products (BP) use is the development of anti-drug antibodies (ADA) in patients. Among other factors, BP aggregates seems to play a major role in immunogenicity. Moreover, the presence of ADA with high affinity and different isotypes suggest a CD4 T-cell dependent immune response and therefore a pivotal role for antigen presenting cells, such as dendritic dells (DC).In order to determine if BP aggregates participate to DC activation, aggregates form human growth hormone (GH) and antibodies (Rituximab and polyclonal IgG1) were produced and characterized.Their impact was tested on a model of monocytederived dendritic cells (mo-DC).We have shown aggregates were able to induce moDC maturation, as observed with increase of key co-stimulatory and maturation markers (CD40, CD80, CD83, CD86 and HLA-DR), and by increase of pro-inflammatory cytokines and chemokines (IL-6, IL-8, IL-12p40, CCL2, CCL3, CCL4, CXCL10).Using an allogenic model of co-culture, we have shown that moDC stimulated with aggregates were able to induce CD4+ T cells proliferation.Polarization was different following the nature of the protein. GH aggregates were able to induceIFNγ, sign of Th1 response, whereas antibody aggregates induced Th1, Th2, Th17 mix response (with production of IFNγ, IL-5, IL-13 and IL-17).Finally, we started to study intracellular mechanisms involved in moDC activation, by showing that GH aggregates were able to induce p38MAPK, ERK, JNK and NF-κB (p65)phosphorylation. These pathways are involved in CXCL10 expression, which is implicated in Th1 polarization. These results confirmed the immunomodulary effect of protein aggregates on DC and their role as danger signal, inducing an immune response against therapeutic proteins.

Suite aux conséquences environnementales provoquées par l’accident nucléaire de Fukushima, il est fondamental d’étudier les mécanismes gouvernant les effets des radionucléides sur la biosphère et ainsi identifier les processus moléculaires responsables du transport et de la déposition d’actinides comme le neptunium et l’uranium. Cependant, les informations concernant l’aspect microscopique des interactions entre actinide et molécules biologiques sont rares. Les données publiées étant majoritairement issue d’études in vivo, la structure des sites de coordination et l’effet de cette complexation sur les fonctions des protéines restent encore à découvrir.La calmoduline (CaM), qui est connue pour son affinité envers les actinides, agit comme un régulateur métabolique du calcium. Cette protéine, qui est présente de manière ubiquitaire dans le corps humain, peut également complexer d’autres métaux comme les actinides. Ainsi, en cas de contamination interne, les actinides complexés à la protéine pourraient l’empêcher de fonctionner correctement et donc avoir des répercussions sur un grand nombre de fonctions vitales pour l’organisme.La complexation du Np et de l’U par la CaM a été étudiée par spectroscopie EXAFS ce qui nous a permis de montrer que les actinides sont incorporés au site de complexation du calcium. Une fois les aspects structuraux et thermodynamiques étudiés, c’est l’impact de cette complexation sur les fonctions de la protéine qui a été étudié.Afin d’évaluer les conséquences de la complexation, une méthode calorimétrique basée sur une réaction enzymatique (Phosphodiesterase) a été développée. Ces expériences réalisées avec des concentrations variables d’actinides (30-500 nM) montrent une diminution de l’activité enzymatique lorsque la concentration d’actinide augmente. Les résultats montrent que le complexe CaM-An agit comme un inhibiteur enzymatique. De plus, on observe qu’à haute concentration en actinide, le complexe CaM-métal agit comme un poison et tue complètement l’activité enzymatique. / Considering the environmental impact of the Fukushima nuclear accident, it is fundamental to study the mechanisms governing the effects of the released radionuclides on the biosphere and thus identify the molecular processes generating the transport and deposition of actinides, such as neptunium and uranium. However, the information about the microscopic aspect of the interaction between actinides and biological molecules (peptides, proteins…) is scarce. The data being mostly reported from a physiological point of view, the structure of the coordination sites remains largely unknown. These microscopic data are indeed essential for the understanding of the interdependency between structural aspect, function and affinity.The Calmodulin (CaM) (abbreviation for CALcium-MODULated proteIN), also known for its affinity towards actinides, acts as a metabolic regulator of calcium. This protein is a Ca carrier, which is present ubiquitously in the human body, may also bind other metals such as actinides. Thus, in case of a contamination, actinides that bind to CaM could avoid the protein to perform properly and lead to repercussions on a large range of vital functions.The complexation of Np and U was studied by EXAFS spectroscopy which showed that actinides were incorporated in a calcium coordination site. Once the thermodynamical and structural aspects studied, the impact of the coordination site distortion on the biological efficiency was analyzed.In order to evaluate these consequences, a calorimetric method based on enzyme kinetics was developed. This experiment, which was conducted with both uranium (50 – 500 nM) and neptunium (30 – 250 nM) showed a decrease of the heat produced by the enzymatic reaction with an increasing concentration of actinides in the medium. Our findings showed that the Calmodulin actinide complex works as an enzymatic inhibitor. Furthermore, at higher neptunium (250 nM) and uranium (500 nM) concentration the metals seem to have a poison-like behavior and “kill” completely the enzymatic activity.

L’enveloppe des bactéries à Gram négatif est composée de plusieurs polysaccharides dont certains, comme le peptidoglycane et les lipopolysaccharides, sont essentiels à leur survie et sont impliqués dans les interactions entre ces bactéries et leur environnement (e.g. résistance à des agents antimicrobiens et reconnaissance par le système immunitaire de l’hôte). La biosynthèse de ces polymères nécessite la translocation de leurs sous-unités à travers la membrane interne, ce qui requiert un lipide "porteur", l’undécaprényl phosphate (C55-P). Ce lipide est formé par la déphosphorylation de son précurseur, l’undécaprényl pyrophosphate (C55-PP), qui est lui-même généré par synthèse de novo ou par un recyclage. Chez Escherichia coli, les protéines membranaires BacA, YbjG, PgpB et LpxT présentent une activité C55-PP phosphatase et participe donc de façon redondante au recyclage du C55-P. Pour mieux comprendre le rôle physiologique spécifique de ces protéines dans la biogénèse de l’enveloppe, notre travail a porté sur l’étude des mécanismes d’action, de la fonction et de la régulation de deux de ces enzymes, PgpB et LpxT.L’activité de la protéine PgpB a été caractérisée in vivo et in vitro afin de mieux comprendre son rôle et sa capacité à participer à deux voies métaboliques essentielles, le recyclage du C55-P et la biosynthèse du phosphatidylglycérol. Nous avons mis en évidence des résidus d’acides aminés qui étaient essentiels à la catalyse des deux substrats naturels et d’autres qui n’avaient pas le même rôle dans l’hydrolyse des deux substrats, nous permettant de proposer des mécanismes différenciés. En outre, des données calorimétriques ont montré que PgpB pouvait être grandement stabilisée par la liaison d’un substrat. Hypothétiquement, le changement structural sous-jacent serait susceptible de libérer de l’énergie mobilisée pour le flip du produit à travers la membrane. La protéine LpxT est responsable d’une modification constitutive des lipopolysaccharides en transférant le phosphate libéré du C55-PP sur la partie lipide A. Dans certaines conditions de stress, l’activité de LpxT est spécifiquement inhibée par un petit peptide (PmrR) pour permettre à d’autres modifications de s’opérer. Nous avons montré que la modification catalysée par LpxT était déterminante pour permettre à E. coli de résister aux acides biliaires et de coloniser efficacement le tractus intestinal de l’hôte. LpxT constitue ainsi un point de contrôle clé chez E. coli pour résister à différent agents antimicrobiens qui ciblent les lipopolysaccharides mais qui possèdent des propriétés physico-chimiques opposées. En outre, nous avons montré que LpxT et PmrR formaient un complexe stable mais que de façon inattendue, cette liaison n’inhibait pas l’activité phosphotransférase de l’enzyme in vitro. Nous proposons que PmrR inhibe l’activité de LpxT in vivo en modifiant sa capacité à interagir avec ses partenaires de la voie de biosynthèse des lipopolysaccharides. La biogénèse des polymères de l’enveloppe est absolument nécessaire à la survie des bactéries et les modifications structurales de ces éléments sont autant de stratégies plus ou moins spécifiques qui participent au fitness et à un mode de vie particulier des bactéries. Les C55-PP phosphatases qui participent activement à ces processus constituent ainsi autant de cibles potentielles intéressantes pour la conception de nouveaux antibiotiques. / The bacterial cell envelope is composed of many polysaccharides such as the peptidoglycan and the lipopolysaccharides (LPS) that are required for survival and are involved in the interactions that the bacteria establish with their surroundings, including antimicrobial resistance and host immune system recognition. The biosynthesis of these polymers requires the translocation of the sugar sub-units across the plasma membrane, which implies an essential lipid carrier, the undecaprenyl phosphate lipid (C55-P). This lipid is generated by the dephosphorylation of its precursor, C55-PP, itself arising from either de novo synthesis or recycling. The Escherichia coli bacterial species possesses four membrane proteins (BacA, YbjG, PgpB and LpxT) exhibiting a C55-PP phosphatase activity, which all contribute redundantly to C55-P recycling. To highlight the specific physiological role of these enzymes in the cell wall biogenesis, our work was focused on the characterization of the mechanism of action, the function and the regulation of two of these phosphatases, PgpG and LpxT.The PgpB activity was characterized both in vivo and in vitro to decipher its role and ability to participate in two essential metabolic pathways, the C55-P recycling and the phosphatidylglycerol biosynthesis. We identified essential residues of PgpB involved in the hydrolysis of both natural substrates, C55-PP and PGP, and some others that function differently in the hydrolysis of these two lipids, allowing us to propose different reaction mechanisms for this enzyme. In addition, calorimetric data showed that substrate binding greatly stabilized the PgpB protein. Hypothetically, the underlying structural change would release energy allowing translocation of the lipid across the membrane. LpxT is responsible for a constitutive modification of the LPS by transferring the phosphate released from C55-PP to lipid A. Under certain environmental stresses, the LpxT activity is specifically inhibited by a small peptide (PmrR), thereby allowing other modifications of the lipid A structure to take place. We showed that the LpxT-dependent modification accounts for bile acids resistance in E. coli and is critically important for E. coli colonization in the host’s gut. LpxT constitutes a key critical control point in E. coli to resist different antimicrobial agents with opposite physical-chemical properties but which all target the LPS. In addition, we demonstrated that PmrR forms a stable complex with LpxT, but unexpectedly, this binding did not inhibit the phosphotransferase activity of the enzyme in vitro. We propose that PmrR inhibits LpxT activity in vivo by modulating its ability to interact with its protein partners that are involved in LPS biosynthesis. The biogenesis of cell wall polymers is essential for bacterial survival and structural changes in these components participate more or less specifically to the fitness and particular lifestyles of bacteria. The C55-PP phosphatases which participate actively in these processes therefore constitute interesting potential targets for new antibiotics design.

Macrophages associés aux tumeurs (TAMs) sont étroitement liés à l'initiation et la croissance tumorale, l'angiogenèse, l'invasion et les métastases tumorale, la résistance au traitement anti-cancéreux et sont associées à un mauvais pronostic dans de nombreux cancers. La radiothérapie est un des traitements les plus importants antitumoraux et a été montré pour pouvoir moduler les fonctions TAMs. Cependant, les mécanismes moléculaires dans l'activation des macrophages induite par irradiation sont largement inconnues. Dans cette étude, nous avons démontré que les rayonnements ionisants (IR) induit une activation des macrophages de type M1 in vitro et in vivo, qui est associée à une inhibition de la croissance tumorale induite par IR. Nous révélons que la protéine X induit par IR est essentiels dans le déclenchement de l'activation des macrophages. Nous confirmons l'importance de ces résultats en montrant que la sur-expression de la protéine X est liée à une augmentation des macrophages de type M1 chez les patients rectales suivants radiothérapie néo-adjuvante. L'accumulation des macrophages de type M1 est associée à une réponse antitumorale améliorée. Ce travail dévoile des rôles importants de la protéine X dans l'activation des macrophages IR-induite et constitue une base pour le développement de nouvelles stratégies thérapeutiques pour améliorer l’efficacité de la radiothérapie par modulation de l'activation des macrophages. / Tumour-associated macrophages (TAMs) are closely related to tumour initiation and growth, angiogenesis, tumour invasion and metastasis, anti-cancer treatment resistance and are associated with poor prognosis in many cancers. Radiotherapy is among the most important anti-tumour therapies and has been shown to modulate TAMs functions. However, molecular mechanisms underlying irradiation-induced macrophage activation are largely unknown. In this study, we demonstrated that ionizing radiation (IR) induces macrophage M1 activation both in vitro and in vivo, which is associated with IR-induced tumour growth inhibition. We reveal that IR-induced X protein is critical in triggering macrophage activation. We confirm the significance of these findings by showing that up-regulation of X protein is related with increased M1 macrophages infiltration in rectal patients following neo-adjuvant radiotherapy. Accumulation of M1 macrophages is associated with an improved anti-tumour response. This work unveils important roles of X protein in IR-induced macrophages activation and provides basis for the development of new therapeutic strategies to enhance radiotherapy efficacy through modulating macrophage activation.

Le bactériophage T5, qui infecte la bactérie Escherichia coli, est constitué d’une capside icosaédrique renfermant un ADN double brin et d’une queue permettant le transfert de son ADN dans le cytoplasme de la cellule hôte. Au cours de la morphogénèse, la capside et la queue sont assemblées séparément puis connectées pour former les particules infectieuses. La capside de T5 est d'abord assemblée sous forme d'une procapside vide constituée de 775 copies d’une protéine unique qui s'organise en hexamères et pentamères pour former respectivement les faces et les sommets de l’icosaèdre. Un des sommets est occupé par la protéine portale qui constitue un pore d’entrée pour l’ADN. L’encapsidation du génome à travers le canal portal, assurée par un moteur moléculaire, provoque l’expansion de la procapside. La capside pleine d'ADN est ensuite décorée par la protéine pb10 qui se fixe sur sa surface externe, au centre des 120 hexamères, et elle est fermée par la protéine p144 qui constitue le point d'ancrage pour la queue.Les objectifs de ma thèse étaient de déterminer la structure, la fonction et le mécanisme de fixation à la capside des deux protéines pb10 et p144. J’ai produit et purifié la protéine de fermeture p144 dont la structure et les caractéristiques de fixation sur la capside seront prochainement étudiées. J’ai résolu la structure de la protéine de décoration pb10 en solution par résonance magnétique nucléaire (RMN), ce qui a révélé une protéine formée de deux domaines. Le domaine N-terminal structuré en hélices alpha se fixe à la capside, alors que le domaine C-terminal, de type immunoglobuline, est exposé au solvant. La détermination des constantes cinétiques d'association et de dissociation par résonance plasmonique de surface (SPR) a permis de montrer que pb10 se fixe sur la capside de T5 de manière quasi-irréversible, avec une affinité de l’ordre du picomolaire. Des expériences de mutagenèse dirigée sur le domaine de fixation de pb10 indiquent que cette forte affinité repose sur un réseau d’interactions électrostatiques et hydrophobes. J’ai démontré que pb10 participe à la stabilisation de la capside de T5 par des techniques de calorimétrie différentielle à balayage (DSC) et thermo-fluorescence (FTSA). Par ailleurs, j'ai démontré qu’il était possible de fusionner des protéines de grande taille au domaine C-terminal de pb10 sans affecter sa haute affinité pour la capside. J’ai ainsi pu fonctionnaliser des capsides avec une protéine d’intérêt fusionnée à pb10. Ces résultats ouvrent la voie vers diverses applications, dont la présentation d’antigènes en vue de créer de nouveaux vaccins. / Bacteriophage T5, a lytic phage which infects the bacterium Escherichia coli, is composed of an icosahedral capsid containing a double stranded DNA and a tail responsible for DNA transfer into the host cell cytoplasm. The capsid and the tail are assembled separately and then connected to form infectious viruses. The T5 capsid is first assembled as an empty procapsid composed of 775 copies of the major head protein organized in hexamers on the faces and pentamers on the vertices of the icosahedron. A single vertex is occupied by the portal protein which forms an entry channel for DNA. DNA is packaged through the portal channel by a molecular motor thus triggering procapsid expansion. The DNA-filled capsid is then decorated by the protein pb10 which binds on the outer surface in the center of each hexamer, and closed by the connector protein p144 needed for tail attachment.The goals of my PhD were to characterize the structure, function and mechanisms of capsid binding of both pb10 and p144 proteins. I have produced and purified the head completion protein p144 for future exploration of its structure and capsid binding properties. I have solved the solution structure of the decoration protein pb10 by nuclear magnetic resonance (NMR), thus unravelling that pb10 has two domains. The alpha-helical N-terminal domain binds to the capsid and the immunoglobulin-like C-terminal domain is exposed to the environment. Surface plasmon resonance (SPR) showed that that pb10 attachment to the T5 capsid is quasi-irreversible with a picomolar affinity. Site-directed mutagenesis of the binding domain of pb10 suggested that the decoration mechanism is driven by both hydrophobic and electrostatic interactions. Differential scanning calorimetry (DSC) and fluorescence thermal shift assays (FTSA) demonstrated the role of the decoration protein in capsid stabilization. I have also demonstrated that a large protein can be fused to the C-terminal end of pb10 without affecting its high affinity for the T5 capsid. Capsids can thus be functionalized with a protein of interest fused to pb10. Possible applications of this work include antigen presentation for new vaccines.

Les nanoparticules sont de plus en plus présentes dans notre quotidien et leur présence dans les organismes vivants est aujourd’hui avérée. Aussi, dans un milieu biologique, des protéines recouvrent spontanément la surface des nanoparticules pour former une couronne de protéines. Suivant la composition de cette couronne, une nanoparticule acquiert une "identité biologique" spécifique qui peut conditionner sa biodistribution ainsi que son éventuelle toxicité.De nombreuses zones d’ombre persistent quant à la connaissance des mécanismes d’adsorption des protéines sur les nanoparticules. Deux caractéristiques physico-chimiques, peu abordées jusqu’à maintenant, ont été étudiées ici : la taille des protéines et la présence de modification post-traductionnelles. Aussi, du fait de leur forte utilisation, nous nous sommes concentrés sur les nanoparticules de silice (SiNPs).L’adsorption d’hémoprotéines, de nature similaire mais de tailles différentes, sur des SiNPs, elles-mêmes de tailles différentes, a été étudiée. Les isothermes d’adsorption et les titrations calorimétriques ont notamment montré qu’il existe une relation entre la taille des protéines et leur affinité pour une surface de silice. Des différences plus fines ont aussi pu être observées selon la taille des nanoparticules. Une analyse structurale des protéines adsorbées a également été effectuée par dichroïsme circulaire et diffusion de neutrons aux petits angles. Les hémoprotéines apparaissent comme des protéines très structurées qui sont peu affectées par l’adsorption. Cependant, bien que la structure quaternaire soit conservée, des modifications structurales sont observables.Des études faites en présence de mélanges de protéines (extraits de protéines de levure) ainsi que de peptides de synthèse ont également montré le rôle important de la diméthylation asymétrique de l’arginine sur l’interaction protéines/SiNPs. L’utilisation d’un panel de techniques expérimentales et de simulations a permis de comprendre le mécanisme responsable de la forte affinité de peptides contenant cette méthylation particulière. De façon plus générale, nos travaux suggèrent que les modifications post-traductionnelles peuvent influencer notablement les interactions de biomolécules avec des surfaces minérales. / Nanoparticles are ubiquitous in our environment and their presence inside our bodies is now established. Besides, in a biological medium, nanoparticles are spontaneously covered by proteins that form the so-called protein corona. Depending on the corona composition, a nanoparticle will possess a specific "biological identity" conditioning its biodistribution as well as its potential toxicity.Despite being highly studied, many aspects of the protein adsorption mechanisms remain unknown. Here we particularly focused on the influence of two physicochemical characteristics, which had rarely been addressed: protein size and post-translational modifications. Also, because of their intensive use, we worked on silica nanoparticles (SiNPs).We studied the adsorption of hemoproteins on SiNPs, both of them having different sizes. Adsorption isotherms and calorimetry studies showed a relationship between the protein size and its affinity towards silica surfaces. Finer differences could also be observed by varying the SiNPs size. Additionally, structural analyses of adsorbed proteins were performed using circular dichroism and small-angle neutron scattering. The adsorption of hemoproteins, which are well-structured proteins, seems to have little effects on their structure. However, even though the quaternary structure is maintained, structural modifications can be seen.Using yeast protein extracts and synthetic peptides, the major role of arginine asymmetric dimethylation on proteins/SiNPs interaction could be established. The use of experimental and simulation techniques allowed us to understand the mechanism responsible for the high affinity of peptides having this peculiar methylation. As a whole, this work suggests that post-translational modifications can influence considerably the interactions between biomolecules and mineral surfaces.

Les mutations du gène codant pour la protéine C (SP-C) du surfactant pulmonaire (SFTPC) sont à l’origine de pathologies interstitielles chroniques du nourrisson, de l’enfant mais également de l’adulte. Une importante hétérogénéité phénotypique est cependant observée, y compris au sein d’une même famille. Par un épissage alternatif, le gène SFTPC permet la synthèse de deux isoformes du précurseur protéique de SP-C (proSP-C) pour aboutir à la protéine mature après plusieurs modifications post-traductionnelles. Les conséquences des mutations de SFTPC sur l'homéostasie du surfactant ne sont pas clairement élucidées, mais il semble que le mauvais repliement de la protéine soit une caractéristique commune. A l’issue de nos travaux antérieurs, nous avons mis en évidence un effet de certaines mutations et de polymorphismes sur l’épissage de SFTPC faisant ainsi varier significativement l’expression de chacune des deux isoformes protéiques, sans qu’à l’heure actuelle nous ne connaissions le rôle de chacune dans la synthèse de la protéine SP-C mature. Notre projet, s’inscrivant dans la continuité de mon master 2, a pour but de mieux comprendre les mécanismes physiopathologiques pré et post-transcriptionnels associés aux variations de SFTPC et leurs conséquences sur le développement des pneumopathies interstitielles. Le premier axe de notre projet repose sur l’étude in vitro (lignées cellulaires) et in vivo (modèle murin, ARN des patients) des variations de chacun des isoformes. Dans un second axe, nous souhaitons poursuivre l'étude de facteurs pouvant influencer le phénotype des patients porteurs de mutations du gène SFTPC, qu'ils soient d'origine externes (infections virales et bactériennes ou environnementaux comme le tabac) ou génétique. Collectivement, ces études nous permettrons de fournir une signature moléculaire pour cette maladie et d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques afin d’en améliorer le pronostic mais également la prise en charge et la qualité de vie des patients. / Surfactant pathologies linked to mutations in the SFTPC gene, via autosomal dominant transmission, are most commonly associated with diffuse interstitial diseases in infants, children and adults, and may also be responsible for acute respiratory distress syndrome in newborns. They are most often accompanied by a high morbidity and mortality rate, thus rendering early diagnosis essential for ideal intervention and support. Mutations in the SFTPC gene lead to alveolar and intracellular accumulation of an abnormal form of the precursor protein SP-C (ProSP-C), which is responsible for the resulting tissue damage. However, the pathophysiological mechanisms are not yet completely deciphered. The gene encodes two isoforms of ProSP-C from three alternative transcripts. The expression level of each is currently unknown and the vast majority of studies evaluating the effect of mutations are performed on only one isoform. Incidentally, our preliminary results on the analysis of RNA extracted from bronchoalveolar washing, both from control subjects and patients harboring a mutation, show that the all three SFTPC transcripts are expressed and that the presence of a mutation is associated with a variation in the expression levels of the transcripts. The aim of my project is to study the expression level of SFTPC transcripts and ProSP-C isoforms from the heterologous expression of the SFTPC gene (exons and introns) in cell lines. I will beanalyzing the post-translational maturation profile of these pro-proteins and evaluating the effect of the mutations on their expression and maturation in both our cellular models and in vivo with two Knock-in mice models.A better understanding of the pathophysiology of genetic abnormalities associated with mutations in the SFTPC gene will not only greatly contribute to earlier management of patients, but also it will help in modifying the progression of lung injury and its prognosis.