Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Nous avons identifié le gène GPR84 comme étant exprimé par la microglie, c'est-à-dire les macrophages du système nerveux central. Il code pour un récepteur couplé aux protéines G dont le ligand endogène, la fonction et la régulation demeurent inconnus. Dans cette étude, nous avons testé l'hypothèse que l'augmentation de la transcription du gène GPR84, dans la microglie, soit associée à des processus inflammatoires. Pour ce faire, nous avons induit une réaction inflammatoire systémique à la lipopolysaccharide (LPS) chez des souris normales ou déficientes en l'une ou l'autre des cytokines IL-1 et TNF. Par la combinaison des techniques d'hybridation in situ et d'immunohistochimie, il a été montré que, suite à une injection systémique de LPS ou intraparenchymale de TNF, les cellules microgliales et les macrophages du cerveau expriment fortement l'ARNm du gène GPR84. Cette activation est quasi-absente chez les souris normales. Finalement, nous avons démontré que la production du GPR84 par la microglie se présentait non seulement durant la phase aigûe de l'endotoxémie, mais également durant l'encéphalomyélite auto-immune expérimentale (EAE), un modèle de la sclérose en plaques. Nos résultats illustrent donc que le GPR84, nouveau marqueur, sensible, de l'activation microgliale, pourrait jouer un rôle important dans la régulation des processus neuroinflammatoires.

Le néocortex déclenche des activités paroxystiques suite aux lésions cérébrales traumatiques. Avec des blessures cérébrales pénétrantes, la déafférentation s'accompagne d'une longue période silencieuse du cortex atteint, et d'une augmentation des périodes d'hyperpolarisation du néocortex entourant la lésion. L'activité synchrone du réseau neuronal après une période de latence conduirait à l'épileptogenèse. Des tentatives de modifier la nature des crises ont été effectuées à l'aide de modèles animaux. L'une des plus prometteuse étant la chimiogenèse par l'injection des vecteurs viraux afin d'anéantir la réponse de certains récepteurs couplés aux protéines G aux ligands habituels, alors qu'ils réagissent aux médicaments désirés, comme N-oxyde de clozapine. Ces récepteurs appelés « DREADDs » exclusivement activés par ces médicaments ont été étudiés pour réduire le nombre et la sévérité des crises. Selon les résultats non-publiés de notre laboratoire, l'utilisation d'un DREADD excitateur près de «undercut» serait antiépileptogène. Nous pensons qu'une excitation ciblée pourrait optimiser l'effet antiépileptogène. L'excitation est directement liée aux neurones transduits. Nous postulons qu'une transduction optimale des neurones pourrait être atteinte par un dosage optimisé du virus injecté, tant au titre viral qu'au volume injecté. Pour prouver notre hypothèse nous avons utilisé trois différentes titrations de AAV2/8 et injecté différents volumes de ces titrations aux souris. Le volume de transfection corticale et le nombre des neurones transduits ont été quantifiés. Avec la titration E11gc/ml aucune transfection n'a été observée. Avec la titration E12gc/ml une corrélation quasi-linéaire a été observée entre le volume viral injecté, et le volume cortical transfecté, ainsi que le nombre de neurones transduits. Avec la titration E13gc/ml, une meilleure corrélation a été observée à la transduction neuronale qu'à la transfection corticale, par rapport au volume viral injecté. En conclusion, la titration E12gc/ml paraît être un meilleur choix pour nos futures études, la fiabilité de la titration E13gc/ml n'ayant pas été démontrée. / The neocortex is the origin of paroxysmal activities that occur after traumatic brain injuries. In penetrating brain injuries, deafferentation causes long silent periods in affected cortex and increased hyperpolarization period in neocortical tissue around the injury. The synchronous neural network activity after a latent period may lead to epileptogenesis. Some attempts to alter seizures were done using animal models. One of the most promising involves chemogenetic tools via AAV viral vector injection to make some G protein-coupled receptors unresponsive to their natural ligands, and activated by the desired drug, such as clozapine-N-oxide. These designer receptors exclusively activated by designer drugs (DREADDs) have been studied in reducing the numbers and severity of seizures. According to unpublished works in our lab, using excitatory DREADDs in the vicinity of undercut was antiepileptogenic. We believe there could be an optimal level of excitation for yielding an optimal antiepileptogenic response. This excitation is in direct relation with neurons transfected. We hypothesize that the optimal neuronal transduction might be achieved with optimal dosage of virus delivered, in terms of viral titration and the volume of virus injected. To test this, we used three different titrations of AAV2/8 and we injected different volumes of these titrations in adult mice. Cortical transfection volume and number of neuronal transductions were estimated. With E11gc/ml titration, no transfection was visible. With E12gc/ml titration, an almost linear correlation was observed between the volume of virus injected and the number of neurons transduced and the cortical volume of transfection. With E13gc/ml titration the correlation between the injected AAV volume and the number of neuronal transductions was still good but there was a poor correlation between AAV volume and transfection volume. We concluded that E12gc/ml titration was a more reliable option for our further studies. The reliability of E13gc/ml titration needs to be proven.

Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal. / Les petites protéines G de la famille Rhô jouent un rôle primordial dans l'organisation de la morphologie cellulaire qu'elles accordent aux besoins de la cellule. Elles constituent également une voie importante de signalisation vers le noyau, participent à la régulation du cycle cellulaire et sont impliquées lors du phénomène apoptotique. Ces protéines oscillent entre un état inactif lié au G DP et un état actif lié au GTP. Le passage de l'un à l'autre est assisté par des protéines stimulant (GDS) ou inhibant (GDI) l'activité d'échange des nucléotides et par des protéines stimulant leur activité GTPasique (GAP) intrinsèquement faible. Ce cycle d'activation s'accompagne d'un cycle de localisation, les protéines Rhô étant actives à la membrane et inactives dans la fraction soluble. La protéine GDI, elle-même cytosolique, sert de navette aux protéines Rhô lors de leur transit cytoplasmique. Nous avons caractérisé l'activité de solubilisation des protéines Rhô par la protéine de fusion GST-GDI in vitro, utilisant comme modèle les membranes à bordure en brosse rénales. Deux petites protéines G de ta famille Rhô, RhoA et Cdc42, sont spécifiquement extraites en présence de GST-GDI. Cette activité d'extraction est cependant saturable. Une fraction importante (près de 50%) des protéines RhoA et Cdc42 ne peut être extraite suggérant la présence de sous-populations membranaires. L'activité de solubilisation des protéines Rhô par GST-GDI s'est avérée sensible à la force ionique et est complètement inhibée en conditions physiologiques de température et de sel. La présence de set n'empêche pas la liaison des protéines Rhô à GST-GDI puisque les complexes GST-GDI/Rho coprécipitent sur billes de glutathion-sépharose, en milieu de force ionique physiologique. D'autre part, un prélavage des membranes avec une solution saline inhibe l'extraction subséquente des Rhô par GDI, suggérant fortement qu'un facteur essentiel soit inhibé ou perdu lors du traitement. Ces faits suggèrent que la translocation des protéines Rhô par GDI soit normalement inhibée in vivo et nous amènent à proposer un modèle de régulation de leur cycle d'activation. Nos travaux ont également mis en évidence une protéolyse de GSTGDI au cours des essais d'extraction en présence de membranes à bordure en brosse rénales. Le phénomène est observé en présence de quelques autres tissus et dans tous les cas, un fragment protéolytique majeur de 17 kDa est généré, révélant la présence d'une zone de vulnérabilité protéotytique sur GDI. Le fragment ne peut extraire les Rhô des membranes, suggérant que l'activité GDI puisse être régulée par protéolyse. L'intégrité de GST-GDI est préservée en présence de Ac-YVAD-CHO, un inhibiteur spécifique de caspases. Le séquençage du fragment généré a cependant révélé que le site de coupure sur GST-GDI ne correspond pas à un site d'activité caspase. Ces faits suggèrent que l'activité des protéines Rhô puisse être régulée par une cascade protéolytique incluant une caspase endogène à la membrane à bordure en brosse rénale. D'autre part, notre étude de la stimulation par le GTPyS d'une activité de carboxyméthylation des protéines du rein a démontré que l'activité stimulée implique une isoaspartyle métyltransférase (PIMT). Cette enzyme catalyse le transfert de groupements méthyles provenant du S-adénosyl-Lméthionine, vers la fonction carboxylique portée par la chaîne latérale de résidus isoaspartyles. La PIMT est réputée participer à la réparation de protéines endommagées issues de modifications spontanées de résidus asparagines et aspartates. L'effet stimulateur du GTPyS sur l'activité PIMT est modulé par le vanadate et complètement inhibé par la génistéine et le tyrphostin. L'analyse des profils de méthylation sur gel révèle des modes d'action différents. La génistéine prévient l'accroissement du rythme des cycles de méthylation/déméthylation sur l'ensemble des substrats tel qu'observé habituellement en présence de GTPyS, tandis que le tyrphostin agit plutôt en bloquant une étape de déméthylation. Les résultats obtenus en présence de vanadate et de génistéine suggèrent fortement l'implication d'une activité tyrosine kinase lors de la stimulation de l'activité PIMT par le GTPyS au niveau du rein.

Les protéines-G hétérotrimériques, constituées des sous-unités α, β et γ, sont les premières actrices de la transduction du signal en interagissant directement avec les Récepteurs Couplés aux protéines-G (RCPG). Les protéines-G ont la capacité de lier soit une molécule de GDP lorsqu'elles sont inactives, soit une molécule de GTP quand elles sont activées par un RCPG. Cet échange de nucléotide va conduire à la dissociation de l'hétérotrimère avec d'une part la sous-unité α seule, et d'autre part le complexe βγ. Chacune de ces entités va ensuite propager le signal dans le compartiment intracellulaire. Les travaux effectués au cours de cette thèse ont pour but de mieux comprendre la dynamique des protéines-G hétérotrimériques et de leurs récepteurs par des techniques de mécanique moléculaire incluant la Dynamique Moléculaire (DM) et l'Analyse de Modes Normaux (AMN). Dans un premier temps une AMN nous a permis de décrire les possibles mouvements de larges amplitudes des protéine-G. Nous avons à l'occasion de cette étude mis au point une méthode de sélection de Modes Normaux (MN) pertinents que nous avons appelés modes représentatifs. Nous avons également développé une méthode d'extraction de ligand (ici le GDP) le long de ces MN. Ceci nous a permis de montrer qu'un mouvement concerté de toute la sous-unité α pouvait permettre l'ouverture de la poche et la sortie du GDP. Dans un deuxième temps, nous avons affiné nos résultats en reconstruisant des profils d'énergie libre le long de plusieurs chemins de sortie possibles pour le GDP. Ainsi nous avons pu proposer un mécanisme fin de sortie du ligand et plusieurs résidus clés impliqués dans cette sortie. Nous avons également étudié le processus de dissociation de l'hétérotrimère par la technique de la Dynamique Moléculaire Dirigée. Il a été possible, à l'issue de cette étude, de proposer un mécanisme à l'échelle moléculaire de la séparation des sous-unités α et βγ. Pour finir, nous avons également étudié le macro-complexe RCPG : protéine-G. Deux études traitent des mécanismes d'activation et de couplage des protéines-G à son récepteur. Nous avons notamment montré que l'hétérotrimère de protéine-G contraint très fortement les mouvements du récepteur. Un mouvement très largement retrouvé dans le complexe ainsi que dans plusieurs autres RCPGs dont les structures sont connues a été proposé comme étant le mouvement d'activation des RCPG une fois complexés à leurs protéines partenaires. / Heterotrimeric G-proteins, constituted of α, β and γ subunits are the first actresses of the intra-cellular signal transduction and interact directly with G-protein Coupled Receptors (GPCR). The heterotrimer is able to bind either a GDP molecule (inactive state) or a GTP molecule (active state). The nucleotide exchange is triggered by the interaction with an activated GPCR and leads to the dissociation of the whole heterotrimer into two independant entities : α and tightly bound βγ subunits. Both subunits further propagate the signal into the intracellular compartment. Goals of the present work were to better understand the mechanics of G-proteins and GPCR by combining several molecular mechanics techniques such as Molecular Dynamics (MD) and Normal Mode Analysis (NMA).Firstly, we described large amplitude motions of the whole G-protein heterotrimer. In this study we developped a method to select relevant Normal Modes (NM), we called representative NM. We also developped a method which consists to extract a ligand (in our case the GDP) out of its binding pocket along computed NM. With these two new methods, we showed that a concerted motion of the α subunit would promote the opening of the pocket and the release of the GDP.Secondly, to refine our results, we performed free energy profiles reconstructions along several putative exit pathways of the GDP. Thus, we proposed for the first time a fine-tuned mechanism of GDP exit at the molecular scale and putative key-residues. We proposed also a molecular scale mechanism for the dissociation of the heterotrimeric G-protein through the use of the Targeted Molecular Dynamics (TMD). Finally we were interested in the study of the GPCR:G-protein complex. We performed two studies related to the activation and to the coupling of the macro-complex. We showed that G-protein constrain drastically the GPCR motions. One over-represented motion in the complex that was also retrieved in other crystallized structures of several different GPCRs thus suggested that this motion could be the putative activation motion of a GPCR when complexed to its favorite protein partners.

Résumé : L’expression de surface des récepteurs couplés aux protéines G (GPCRs) est un processus hautement régulé et très important dans le maintien de l’homéostasie cellulaire. En effet, un déséquilibre dans leur niveau d’expression est souvent relié à différentes pathologies comme le cancer, le diabète, l’obésité, les maladies cardiovasculaires et les maladies neurodégénératives. C’est pourquoi la compréhension des mécanismes moléculaires influençant ce phénomène est si importante et nous permettra d’élaborer et/ou d’améliorer les médicaments ciblant la régulation de ce processus. Il est bien connu qu’un des acteurs importants dans le trafic vésiculaire des GPCRs est représenté par la famille des Rab GTPases. Effectivement plusieurs de ces dernières, soit les Rabs 1, 2, 4, 5, 6, 7, 8 et 11 pour ne nommer que les plus connues, modulent l’expression de surface des GPCRs. De plus, certaines études soulèvent la possibilité qu’un GPCR soit lui-même capable de réguler son propre trafic intracellulaire, et ce grâce à son interaction avec les Rab GTPases. Toutefois, le mécanisme emprunté par le GPCR pour atteindre cette fin reste à élucider. Dans le présent travail, je démontre que le GPCR, β2AR, module non seulement la maturation de la petite protéine G Rab11a grâce à son interaction avec la Rab GéranylGéranylTransférase (RGGT), mais influence également son activation en modulant son ubiquitination via son association avec la E3-ubiquitine ligase, HACE1. De plus, je révèle que la sous-unité alpha de la RGGT (RGGTA) accroît significativement la maturation et le transport antérograde du récepteur β2AR, ce qui souligne ainsi un nouveau rôle cellulaire pour cette protéine. L’ensemble des résultats générés appuie l’hypothèse qu’un GPCR puisse contrôler son propre routage intracellulaire, et éclaircit les mécanismes utilisés pour réguler l’activé de la Rab GTPase avec laquelle il interagit. // Abstract : Cell surface expression of G Protein-Coupled Receptors (GPCRs) is a highly regulated and very important phenomenon for keeping cellular homeostasis. In fact, dysregulation of their cell expression is related to many diseases like cancer, neurological disorders, obesity, diabetes and cardiovascular diseases. These facts illustrate how important understanding the molecular mechanisms involved in cell surface transport of those receptors is, which will help us in designing or improving drugs which actually target this pathway. Rab GTPases are proteins known for being essential regulators of GPCR vesicular trafficking. Indeed, an increasing number of studies report the implication of Rab1, 2, 4, 5, 6, 7, 8 and 11 (to cite the most frequently studied) cell surface transport of GPCRs. Moreover, some studies also put forward the possibility that a GPCR might be able to regulate its own cellular trafficking by interacting and controlling activation of Rab GTPases. However, the mechanism involved in this process remains to be clarified. In the present study, I demonstrate that the prototypic GPCR, β2AR, not only modulates prenylation/maturation of the small G protein Rab11a by interacting with Rab GeranylGeranylTransferase (RGGT), but also influences Rab11a activation by modulating its ubiquitination via its association with the E3-ubiquitin ligase, HACE1. Furthermore, I reveal that the α subunit of the RGGT (RGGTA) also promotes the maturation and anterograde transport of the receptor, which highlight a new cellular role for this protein. Altogether, those results support the hypothesis that GPCRs control their own trafficking, and shed light on some of the mechanisms that might be employed by those receptors in activation of Rab GTPases.

Les récepteurs couplés aux protéines G (GPCR) sont formés de sept domaines transmembranaires. Cette famille de récepteur fait l'objet d'études qui visent à comprendre leurs fonctions, leurs interactions avec leurs ligands, les changements de conformations produits suite à cette liaison ainsi que leur mécanisme d'activation. Notre hypothèse est que le récepteur humain de l'angiotensine II de type 1 (hAT1 ) possède des déterminants moléculaires responsables de sa liaison à l'angiotensine II (AngII). Nos objectifs sont d'identifier des déterminants moléculaires responsables de sa liaison à AngII, ainsi que d'identifier des changements de conformations générés suite à cette liaison. Dans un premier temps, les déterminants de la liaison de la position C-terminale de l'AngII ont été identifiés directement grâce à des études de photomarquage par affinité sur le récepteur hAT 1. Ces études nous ont permis d'observer que l'acide aminé photoactivable utilisé, le para -benzoyl- L -phénylalanine (Bpa), présentait une sélectivité prononcée pour la méthionine. Nous avons exploité cette sélectivité du Bpa pour mettre au point une nouvelle approche : l'essai de proximité aux méthionines (MPA). Afin de déterminer l'environnement tridimensionnel de la position C-terminale de l'AngII dans le récepteur hATI, nous avons dans un premier temps étudié les domaines transmembranaires (TMD) III, VI et VII en mutant individuellement chacune des positions par une méthionine. Cette étude a permis de déterminer l'orientation relative des résidus identifiés de chaque TMD formant la pochette de liaison. Nous avons fait une étude MPA comparative avec le mutant constitutivement actif N111G-hAT 1 , afin de pouvoir déterminer des changements de hAT1 qui surviennent lors de l'activation, sur les TMD III, VI et VII et avons trouvé qu'une seule différence. La conclusion de l'étude impliquait un mouvement du TMD VI lors de l'activation. Dans une autre étude, les 4 derniers TMD (I, II, IV, V) ont été étudiés à la fois à l'état basal et actif. Cette étude permit d'identifier que les TMD II et V participent à la formation de la pochette de liaison de l'AngII dans la forme active uniquement, impliquant des mouvements dans ces 2 TMD aussi. Suite à l'identification des résidus des TMD participant à la structure de la pochette de liaison, dans la forme active ou inactive, nous avons construit des modèles du récepteur hATI ligandé dans la forme inactive et de la forme constitutivement active et les avons comparés. L'ultime but de ce projet est de présenter un modèle d'activation général des GPCR mais plus concrètement une meilleure compréhension des bases moléculaires de la liaison, de l'activation et des changements conformationnels d'un GPCR.

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

En France la prise en charge des grandes douleurs fait toute sa place à la morphine. Cependant la prise prolongée de morphine entraîne la tolérance et la dépendance. Une stratégie de protéomique différentielle a été entreprise afin d'identifier les adaptations cellulaires à un traitement par la drogue dans des cellules SH-SY5Y. Nous avons montré, notamment, qu'un traitement chronique entraîne la dégradation par le protéasome des protéines Gbeta et Ggamma2. Aussi, le niveau de dégradation de Gbeta est corrélé avec le niveau de sensibilisation de l'adénylyl cyclase (AC), phénomène impliqué dans la dépendance à la morphine. Globalement, l'analyse protéomique a permis de détecter environ 50 protéines et une centaine de phosphoprotéines modulées par la drogue. Mes travaux ont permis de proposer un nouveau mécanisme moléculaire responsable de la sensibilisation de l'AC et surtout suggèrent pour la première fois que le protéasome est impliqué dans les effets chroniques de la morphine.