La voie de signalisation insuline/IGF-1 est l'un des déterminants du vieillissement et des maladies liées au vieillissement. IGF binding protéine 2 (IGFBP2) est sécrétée par les adipocytes blancs. De plus, la surexpression d'IGFBP2 chez la souris améliore la sensibilité à l'insuline, et une étude récente a montré que IGFBP2 contribue fortement à l'effet bénéfique de la leptine sur le métabolisme du glucose. Cependant, les niveaux d'expression d'IGFBP2 dans les conditions de résistance à l'insuline, et les facteurs physiologiques et moléculaires qui contrôlent les niveaux de IGFBP2 dans ce contexte ne sont pas bien établis. Le travail présenté dans cette thèse montre que dans le tissu adipeux blanc viscéral (vWAT), mais non le sous-cutané, les niveaux d'ARNm d'IGFBP2 étaient significativement plus faible chez les souris âgées ainsi que dans des modèles génétique (ob/ob, db/db) nutritionnels d'obésité comparés à ceux de leurs témoins jeunes et maigres. Chez la souris, l'expression d'IGFBP2 dans le vWAT était significativement associée au taux d'IGFBP2 circulants, ce qui suggère une contribution importante de ce tissu. L'effet négatif du vieillissement sur le taux d'ARNm d'IGFBP2 dans le vWAT a été confirmé chez les hommes obèses. Ces résultats démontrent que la transcription du gène IGFBP2 est modulée de façon dépôt spécifique chez les souris et les hommes. Nous avons également démontré que l'insuline augmente significativement l'expression d' IGFBP2 dans les adipocytes 3T3L1. Cet effet a été fortement réduit dans les adipocytes insulino-résistants. Le co-traitement avec la wortmannine et la rapamycine diminue les effets de l'insuline, ce qui suggère la contribution de la PI3K et de mTOR dans la stimulation d'IGFBP2 par l'insuline. En outre, les niveaux d'ARNm d'IGFBP2 étaient considérablement augmentés lorsque les adipocytes étaient invalidés pour les gènes TORC2 ou 4EBP1, qui sont les régulateurs en aval de la voie de signalisation de l'insuline. L'incubation des adipocytes avec de l'insuline a déclenché le recrutement de C/EBPa à la région proximale du promoteur IGFBP2, malgré l'absence d'impact notable sur les niveaux de C/EBPa per se. Ces résultats indiquent que la voie de signalisation de l'insuline régule la transcription d'IGFBP2. Puisque les niveaux d'IGFBP2 sont positivement corrélés avec la sensibilité à l'insuline, les méthodes pour accroître la production d'IGFBP2 par cette voie pourraient améliorer les caractéristiques associées au syndrome métabolique. Nous avons exploré cette possibilité dans un contexte clinique, dans lequel nous avons quantifié les taux d'IGFBP2 circulants par ELISA chez les patients obèses ayant perdu du poids et de la graisse corporelle, soit par une chirurgie de diversion biliopancréatique (DBP), ou par les changements de mode de vie (régime alimentaire et exercice physique modéré). Dans les deux cas, les niveaux circulants d'IGFBP2 ont été fortement augmenté par ces interventions. Par ailleurs, les niveaux d'IGFBP-2 étaient corrélés positivement avec la sensibilité à l'insuline et de cholestérol HDL. Ces résultats suggèrent l'implication d'IGFBP2 dans l'amélioration de la sensibilité à l'insuline et dans le métabolisme lipidique. Nous suggérons qu'IGFBP2 est un facteur critique qui est entre autre produit par le tissu adipeux en fonction de la résistance à l'insuline, et que la stimulation de son expression est associée à des effets favorables sur la sensibilité à l'insuline, le métabolisme du glucose et l'accumulation de masse grasse.

Des mutations dans plusieurs gènes ont été liés à la sclérose latérale amyotrophique (SLA),en particulier dans celui codant pour la protéine Fused in Sarcoma (FUS). Les mutations sont retrouvées dans la partie codant pour le signal de localisation nucléaire, rendant la protéine anormalement abondante dans le cytoplasme. Combiné à d’autres observations, ça suggère qu’un gain de fonction toxique de FUS dans le cytoplasme serait à l’origine de la neurodégénérescence. La SLA est une maladie neurodégénérative qui affecte les neurones moteurs et cause une paralysie progressive. Les mécanismes moléculaires causant la maladies ont toujours inconnus. Une des pistes serait la perturbation de la traduction locale desARNm, qui permet aux synapses de répondre rapidement et indépendamment du corps cellulaire. Une traduction locale insuffisante pour soutenir l’activité synaptique à long terme mènerait à la perte des synapses et à la neurodégénérescence. Mon objectif est donc de déterminer le rôle de FUS dans régulation de la traduction des ARNm en caractérisant son interaction avec les composantes traductionnelles et d’évaluer sa fonction dans une condition reproduisant les caractéristiques de la SLA. J’ai montré que FUS s’associe aux polyribosomes inactifs, ce qui suggère que FUS jouerait un rôle dans la régulation de la traduction des ARNm en interagissant avec le cœur de la traduction. Il est également possible d’observer une augmentation de la présence de FUS dans le cytoplasme et de son interaction avec les polyribosomes suite à une inhibition de la traduction par mTOR, suggérant son rôle de régulateur négatif. De plus, les mutations liées à la SLA amplifient la fonction inhibitrice de FUS en rendant FUS cytoplasmique et en réduisant la synthèse des protéines. Mes résultats montrent que la protéine FUS aurait un rôle d’inhibiteur de la traduction quand celle-ci est cytoplasmique. Par conséquent, l’augmentation de la présence de FUS dans le cytoplasme dans la SLA entrainerait une inhibition de la traduction importante, à un niveau insuffisant pour soutenir l’activité synaptique. / Mutations in several genes have been linked to amyotrophic lateral sclerosis (ALS),particularly in the gene coding for the Fused in Sarcoma protein (FUS). Those mutations are found in the part encoding for the nuclear localization signal, making the protein abnormallyabundant in the cytoplasm. Combined with other observations, it suggests that a toxic gainof function of FUS in the cytoplasm would be the cause of the neurodegeneration. ALS is a neurodegenerative disease that affects motor neurons and causes progressive paralysis. The molecular mechanisms causing the disease are still unknown. One of the hypotheses is the disruption of local translation of mRNAs, which allows synapses to respond quickly and independently from the cell body. Insufficient local translation to support long-term synapticactivity would lead to synaptic loss and neurodegeneration. Thereby, the objective of mystudy is to determine the role of FUS in the regulation of mRNA translation by characterizing its interaction with translational components and evaluate its function in an ALS-linked condition. I have shown that FUS is associated with stalled polyribosomes, which suggests that it plays a role in regulating mRNA translation by interacting with the core of translation.There is also an increase in the presence of FUS in the cytoplasm and in its interaction with polyribosomes following inhibition of translation through mTOR, suggesting its role as anegative regulator. In addition, ALS-related mutations amplify FUS inhibitory function bymaking FUS cytoplasmic and reducing protein synthesis. My results show that the FUSprotein would have a role as a translation inhibitor when it is cytoplasmic. There fore, increasing the presence of FUS in the cytoplasm in ALS would result in significant translation inhibition, at a level insufficient to support synaptic activity.

Tableau d'honneur de la Faculté des études supérieures et postdoctorales, 2011-2012 / Les suppresseurs de tumeurs Rb, p53, INK4a et ARF sont essentiels et ils sont partie intégrante d'un réseau complexe qui régule le cycle cellulaire ainsi que la réponse aux stress oncogéniques. La biogénèse des ribosomes, donc la synthèse et l'assemblage des ribosomes, est une activité essentielle pour la prolifération cellulaire et est fortement affectée par les changements environnementaux ainsi que différentes formes de stress. Il est donc peu surprenant d'apprendre que plusieurs suppresseurs de tumeurs et oncogenes, dont Rb, ARF, p53 et MDM2 travaillent de concert ou en opposition afin de maintenir le niveau de la production de ribosomes à un niveau optimal pour répondre à la demande cellulaire. ARF, un des produits du gène CDKN2A, est reconnu pour causer la stabilisation de p53 en inhibant son ubiquitine ligase MDM2 et ainsi induire l'arrêt du cycle cellulaire et/ou l'apoptose. ARF peut aussi être un suppresseur de tumeurs en l'absence de p53/TP53, car il peut causer un arrêt de prolifération en inhibant, en partie, la synthèse des ARN ribosomiques (ARNrs) dans des cellules p53-/-. ARF cause l'ubiquitination et la dégradation de la chaperonne NPM/B23 qui est impliquée dans la maturation de l'ARNr 28S, cependant ARF inhibe aussi la production de l'ARNr 18S ainsi que l'ARNr précurseur (47S). L'effet de ARF sur NPM n'explique pas l'ensemble des effets de ARF sur la production et la maturation des ARNrs. Nous avons démontré que ARF contrôle la localisation sub-nucléaire du Facteur de Terminaison de la Transcription de la Polymerase I, TTF-I. TTF-I est dynamique et se déplace entre le nucléoplasme et le nucléole avec l'aide de NPM et d'un signal de localisation nucléolaire dans son domaine de régulation en N-terminal. ARF inhibe la localisation nucléolaire de TTF-I en interagissant avec le signal de localisation nucléolaire causant son accumulation dans le nucléoplasme. La réduction de TTF-I récapitule les effets de ARF sur la synthèse et la maturation des ARNrs et le phénotype est récupéré par l'introduction d'un transgène de TTF-I. La surexpression de TTF-I affecte, de façon similaire à une réduction, la biogénèse des ribosomes et le niveau cellulaire de TTF-I est critique et régulé par l'ubiquitine ligase MDM2. ARF inhibe l'interaction de MDM2 avec TTF-I ainsi que son ubiquitination. De plus, ARF et Senp3 régulent la sumoylation de TTF-I. Nos résultats montrent comment ARF, NPM et MDM2 peuvent réguler et limiter la synthèse des ARNrs.

Tableau d’honneur de la Faculté des études supérieures et postdoctorales, 2012-2013. / L'anémie de Fanconi est une maladie génétique récessive rare, caractérisée par une défaillance de la moelle osseuse et une incidence accrue d'anomalies du développement et de cancer. Les protéines FANC sont impliquées dans la voie Fanconi pour réparer les pontages interbrins de l'ADN. En présence de dommages, la protéine FANCD2 est mono-ubiquitinée et s'accumule à la chromatine. Il est admis que FANCD2 occupe un rôle central dans la voie Fanconi, mais sa fonction biochimique exacte est inconnue. La purification de la protéine FANCD2 et de plusieurs fragments de la protéine, dans le but d'étudier leur capacité à lier l'ADN, a mené à l'identification de deux domaines de liaison à l'ADN. La perte de l'un ou l'autre de ces domaines empêche la localisation de la protéine FANCD2 aux foyers de réparation suite à l'induction de dommages, suggérant que ces domaines sont essentiels pour la fonction de FANCD2.

Chez les eucaryotes, les microARN sont de courts ARN non codants régulant les gènes essentiels pour le développement et la différenciation cellulaire. Parmi les facteurs cellulaires clés de cette voie métabolique, on retrouve les RNAses de type III Drosha et Dicer, ainsi que les protéines Argonautes ALG-1 et ALG-2 chez C. elegans. Dans le but de mieux caractériser l’implication des protéines Argonautes dans la voie des microARN, nous avons utilisé deux approches différentes. Premièrement, nous avons étudié la liaison de la protéine Argonaute ALG-1 aux microARN chez C. elegans en fonction du stade développemental, et ce par analyse par micropuce des microARN associés avec ALG-1. Cette étude nous a permis de remarquer que ALG-1 lie la majorité des microARN, mais non la totalité, et ce, de façon très importante aux stades développementaux tardifs. Deuxièmement, nous nous sommes intéressés à l’identification d’interacteurs génétiques d’alg-2. Nous avons donc réalisé un criblage génétique basé sur la létalité synthétique avec le gène alg-2. Ainsi, lorsque le gène synthétique létal est muté simultanément avec alg-2, tel qu’observé avec alg-1, la double lésion induit la mort de l’animal. De ce criblage, nous avons isolé 11 mutants, classés en 5 groupes de complémentation. Par l’utilisation de techniques de cartographie génétique, nous avons localisé la mutation chez le candidat sla-1 sur le chromosome V, entre les positions génétiques de -12.7 et -3.65. / In eukaryotes, microRNAs are small non-coding RNAs which have the role of regulating genes essential for development and cellular differentiation. Beside the RNAse III family members (Drosha and Dicer) and the Argonaute proteins ALG-1 and ALG-2 in C. elegans, essential components of this gene regulation pathway are still not uncovered. In order to characterize the implication of Argonaute proteins ALG-1 and ALG-2 in microRNA pathway, we used two approaches. First, we studied the interaction between microRNA and ALG-1 during worm development by microarray analysis of microRNA associated to ALG-1. From this analysis, we observed that the majority, but not the totality, of microRNA are associated to ALG-1, mostly at early developmental stages. Secondly, to identify new components of microRNA pathway, we conducted a genetic screen to identify new interactors of alg-2. Our screen is based on the synthetic lethality feature of alg-2 and alg-1 genes. In absence of both genes, the animal can not survive. With this synthetic lethal screen, we want to identify new genes that work in synergy with alg-2, like alg-1, interacting in the same genetic pathway. The worms have been mutagenized and 11 mutants, classified in 5 complementation groups, have been collected. By using various mapping techniques, we localized the mutation on mutant sla-1(qbc1) on chromosome V, between the genetic positions of -12.7 and -3.65.

Le contrôle post-transcriptionnel de l'expression des gènes représente un vaste ensemble de processus biologiques autour de la machinerie des ARNm, jouant un rôle majeur dans la création de la diversité du répertoire protéique. La dérégulation de ces processus, générant un phénotype altéré, pourrait contribuer à la progression tumorale dans les cancers du sein. Nos travaux se sont axés sur l'étude de l'épissage alternatif des pré-ARNm et la dérégulation de la machinerie de l'épissage dans la progression métastatique des cancers du sein. Dans un modèle murin de carcinome mammaire, nous avons identifié des variants d'épissage spécifiquement associés au potentiel métastatique. Dans une large cohorte de patientes, nous avons montré que l'expression de certains de ces variants dans des tumeurs est associée à un pronostic défavorable. Enfin, nous avons caractérisé le profil d'expression des protéines régulatrices de l'épissage dans plusieurs séries de cancer du sein. Cette étude offre de nouvelles connaissances et perspectives pour le développement de biomarqueurs de la progression tumorale. / Alternative RNA processing is a mechanism that plays a critical role for creation of protein diversity through selective inclusion or exclusion of RNA sequences during post-transcriptional control of gene expression. We hypothesized that alteration in this process might contribute greatly to tumour development and progression in breast cancer. The aim of our study was to identify and characterize defects in alternative splicing during breast tumour progression. In a murine model, we could identify specific mRNA splicing variants associated with metastatic development. In a large cohort of breast cancer patients, expression of a subset of these variants was correlated to poor prognosis. Finally, we characterised the expression profile of a large panel of proteins of the splicing machinery in breast cancer. Our study provides new insights in the understanding of mechanisms leading to tumour progression and perspectives for the development of new biomarkers and therapies.

Mes travaux ont porté sur l'étude de deux familles de protéines de liaison à l'ARN, la famille des ARE-BP (AU-rich elements binding protein) et la famille des PTB (Polypyrimidine tract binding protein) au cours du développement chez le xénope. L'étude de l'expression de cinq membres de la famille ARE-BP a mis en évidence une redondance d'expression tissulaire et temporelle entre quatre de ces ARE-BP (AUF1, KSRP, HuR et TIA1). A l'inverse, l'expression atypique de TTP a permis de suggérer son implication dans l'hématopoïèse. Mes travaux sur la famille PTB (PTBP1, PTBP2, PTBP3) ont montré que chacun des paralogues présente une expression spécifique ce qui suggère qu'elles aient des fonctions différentes lors du développement. Des résultats du laboratoire montraient que l'inactivation de PTBP1 ou de EXOSC9, un composant de l'exosome ARN, entraînait des défauts de morphogenèse de l'épiderme dorsal. Afin d'identifier l'origine moléculaire de ces défauts, j'ai réalisé l'analyse transcriptomique par séquençage à haut débit (RNA-Seq) des morphants PTBP1 et EXOSC9. J'ai produit des banques d'ADNc à partir des morphants ou d'embryons témoins et celles-ci ont été séquencées au Génoscope. L'analyse d'une cible connue de PTBP1 a montré que des modifications minoritaires de l'épissage étaient détectées à partir de ces données. De plus ces défauts d'épissage ne sont pas retrouvés dans les morphants EXOSC9, validant son utilisation comme crible additionnel permettant d'exclure les évènements d'épissage qui ne sont pas impliqués dans le défaut d'épiderme. Une approche gène candidat a été initiée afin de cibler l'analyse de transcrits impliqués dans la morphogenèse de l'épiderme dorsale.

La régulation post-transcriptionnelle de l’expression génique est basée sur un réseau complexe et dynamique d’interactions ARN-protéines. Un défi important est de comprendre les mécanismes par lesquels ces protéines de liaison à l’ARN (RBPs) influencent chaque étape du métabolisme des ARNm. Les travaux réalisés au cours de cette thèse ont permis de caractériser de nouvelles fonctions de la RBP virale EB2 qui est indispensable à la production du virus d’Epstein-Barr (EBV). Des travaux antérieurs ont montré qu’EB2 favorise l’accumulation cytoplasmique de la majorité des ARNm viraux, dont la caractéristique est d’être transcrit à partir de gènes sans intron. Nous montrons que le rôle d’EB2 ne se limite pas à celui de facteur d’export des ARNm car cette RBP stabilise aussi ses ARNm cibles dans le noyau en les protégeant de la dégradation par l’exosome. Nos résultats indiquent qu’en absence d’EB2 : (i) certains ARNm viraux sont instables car ils contiennent des sites cryptiques d’épissage ; (ii) le facteur d’épissage SRSF3 déstabilise ces ARNm en interagissant à la fois avec l’exosome et le complexe NEXT, un des cofacteurs nucléaires de l’exosome. Par ailleurs, nous montrons également qu’EB2 est associée aux polysomes et stimule efficacement la traduction de ses ARNm cibles, en interagissant avec les facteurs d’initiation de la traduction eIF4G et PABP. Le développement d’un nouveau système de traduction in vitro nous a permis de montrer que l’effet d’EB2 sur la traduction nécessite le passage nucléaire de ses ARNm cibles. Ainsi, l’ensemble de nos travaux démontre le rôle clé d’une RBP virale dans le couplage entre les étapes nucléaires et cytoplasmiques de la biogenèse des ARNm. / Post-transcriptional regulation of gene expression is based on a complex and dynamic network of RNA-proteins interactions. A major challenge is to understand the precise contribution of these RNA-binding proteins (RBPs) to each step of mRNA metabolism. During this thesis, we have characterized new functions of the EB2 viral RBP which is essential for the production of the Epstein-Barr virus (EBV). Previous works have shown that EB2 promotes cytoplasmic accumulation of most intronless viral mRNAs. Here, we show that EB2 is not just an mRNA export factor because this RBP also stabilizes its target mRNAs in the nucleus by protecting them from RNA exosome degradation. Our results indicate that in the absence of EB2 : (i) some viral mRNAs are unstable because they contain cryptic splice sites ; (ii) the splicing factor SRSF3 destabilizes these mRNAs by interacting with both the RNA exosome and the Nuclear EXosome Targeting (NEXT) complex. Moreover, we also show that EB2 is associated with polysomes and it strongly stimulates translation of its target mRNAs through interactions with the eIF4G and PABP initiation factors. Interestingly, the development of a new in vitro translational assay allowed us to show that EB2’s translation stimulation requires that EB2 binds its target mRNAs in the nucleus. Taken together, our works demonstrate the key function of a viral RBP in the coordination of the nuclear and cytoplasmic steps of mRNA biogenesis.

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Le silicium (Si) est ubiquiste dans les sols et plusieurs effets bénéfiques sont associés à son absorption par les plantes. En général, les monocotylédones, dont les graminées, se situent dans le spectre supérieur d'absorption tandis que les dicotylédones, incluant Arabidopsis thaliana, se situent dans le spectre inférieur et répondent faiblement à une supplementation en Si. Dans cette étude, nous avons voulu vérifier s'il était possible d'augmenter l'absorption de Si d'une plante faiblement accumulatrice par l'expression hétérologue de transporteurs d'influx de Si provenant du blé (TaLsil) ou du riz (OsLsil). Nos résultats ont ainsi démontré que la teneur en Si avait augmenté de 3 à 5 fois chez les plantes transformées en moins de 7 jours. Cet influx rapide pouvait toutefois causer des nécroses foliaires, et une distribution appropriée dans les feuilles semble être nécessaire afin de ne pas nuire au développement normal de la plante.