L’objectif de ce mémoire est de décrire un environnement de développement capable de supporter les besoins du bioinformaticien dans les différents contextes de développement de logiciels de bioinformatique. Ce mémoire présente un environnement de développement et en démontre l’utilisation soit par une conception logicielle, soit par une réalisation logicielle. Trois contextes de développement d’infrastructure logicielle et de logiciels bioinformatique ont été identifiés : • Développement dans le cadre de projets de recherche. Mise en place d’une base de données pour le projet d’étude du parasite Leishmania par biopuces d’ADN complémentaire (ADNc) et développement d’une application WEB permettant de mettre en évidence de façon graphique la transcription polycistronique chez ce parasite. Transcription de plusieurs gènes (cistrons) contigus en un seul ARN messager (ARNm). • Développement dans le cadre de plates-formes de recherche. Évaluation des aspects communs des plates-formes de recherche existantes dans le centre de recherche et conception d’un modèle générique d’application de gestion d’information de laboratoire (LIMS). Évaluation des aspects spécifiques des plates-formes de recherche et développement de logiciels de supports pour la configuration et la lecture de résultats spécifique à la plate-forme de qRT-PCR. • Développement dans le cadre de la plate-forme de bioinformatique. Le premier exemple est un logiciel pour une chaîne de traitement à haut débit de données issues de la plate-forme de biopuces. Le deuxième exemple est un logiciel effectuant des alignements locaux de séquences d’acides nucléiques. Ce logiciel, basé sur BLAST, présente des informations supplémentaires dans un format plus facilement utilisable par d’autres logiciels. / The aim of this essay is to describe a development environement which is able to support bioinformaticians in several contexts for bioinformatics software development. This essay presents a development environement and substantiate its use in each context identified either by a software design or by a complete software realisation. Three development context of software infrastructure and bioinformatic software are identified : • Research project development. Setting up database for Leishmania parasite research project with cDNA microarray and development of a WEB application shed on light the polycistronic transcription of this parasite in graphical way. • Research plateform development. Evaluation of common facets of research platforms and design of a generic model for a laboratory information management system (LIMS). Evaluation of spécific facets of research platforms and development of support software for the qRT-PCR plateform. • Bioinformatic platform development. The first sample is a utility software for a high troughput data flow coming from the microarray platform. The second sample is a software making local alignments of nucleic acid sequences. This software which is based on BLAST, presents additional information in a more usable format for other software.

L’immunosuppression a permis d’améliorer l’incidence du rejet aigu sans toutefois améliorer significativement le rejet chronique. Celui-ci est caractérisé par une vasculopathie du greffon (VG) similaire à une forme accélérée d’athérosclérose native accompagnée de fibrose. La pathophysiologie de la VG découle de l’hypothèse de réponse à l’insulte proposée par Russell Ross en 1977. Selon son postulat, l’endothélium stressé par des facteurs immunologiques et non immunologiques initie l’apoptose endothéliale suivi d’une réponse de réparation vasculaire via un épaississement myo-intimal aux sites d’insultes. Toutefois, lorsque les stress endothéliaux initiaux demeurent soutenus, l’apoptose endothéliale et la réponse de réparation perpétuent. Compte tenu que l’inhibition de l’apoptose endothéliale bloque le développement de la VG in vivo, notre hypothèse de travail reposait sur les répercussions paracrines de l’apoptose endothéliale sur les types cellulaires participant au remodelage vasculaire. Nous avons généré un système expérimental in vitro afin d’induire l’apoptose endothéliale en absence significative de nécrose cellulaire. À l’aide d’une approche protéomique multidimensionnelle et comparative, nous avons démontré que les cellules endothéliales apoptotiques exportent spécifiquement 27 signaux post mortem (SPM). Nous avons démontré que certains de ces SPM ont des propriétés anti-apoptotiques (TCTP et EGF), d’autre fibrogénique (CTGF), récapitulant ainsi certains phénotypes cellulaires associés au développement de la VG. Parmi les médiateurs identifiés, 16 n’avaient pas de signal de sécrétion, incluant TCTP, suggérant que des mécanismes de sécrétion non conventionnels soient favorisés durant l’apoptose. Nous avons démontré que la caspase-3 effectrice régule la voie de sécrétion non classique exosomiale associée à l’export extracellulaire de nanovésicules TCTP+VE, anti-apoptotiques et biochimiquement distinctes des corps apoptotiques. Finalement, l’ensemble des données protéomiques ont permis d’émettre l’hypothèse qu’en réponse à un stress apoptotique, la cellule exporte différents médiateurs (solubles et vésiculaires) de manière non conventionnelle nécessitant la fusion d’organelles de la voie endocytaire et autophagique avec la membrane plasmique. Ce mécanisme serait régulé durant la phase effectrice de l’apoptose permettant ainsi d’initier une réponse de réparation extracellulaire seulement lorsque le destin cellulaire a atteint un point de non retour. Ainsi, le testament protéique et nanovésiculaire légué durant l’apoptose endothéliale pourrait servir simultanément de biomarqueur de la VG et de cible thérapeutique afin de diminuer le remodelage vasculaire pathologique. / Immunosuppression regiments improved steadily the incidence of acute rejection with minimal positive effects on chronic rejection. The latter is characterized by a transplant vasculopathy (TV) similar to native atherosclerosis, accompanied with fibrosis throughout the vascular wall of the allograft. The pathophysiology associated to TV arose from pionnering work of Russell Ross in 1977. He proposed the 'Response to Injury' hypothesis revealing that endothelium injury initiated by immunological and non immunological factors favors a vascular repair response through neo-intima thickening at the sites of cellular injury. However, when endothelial insult is maintained, apoptosis ensues and the vascular repair process perpetuates. Since inhibition of endothelial apoptosis prevents TV development in vivo, we hypothesized that endothelial apoptosis regulates the vascular repair process through a paracrine program active on the cellular components of the vessel wall. We have generated an in vitro experimental system to induce endothelial apoptosis in absence of necrosis. Using a multifunctional and comparative proteomic approach, we have identified 27 post mortem signals (PMS) specifically exported by apoptotic endothelial cells. Some of these PMS display anti-apoptotic function (TCTP and EGF), whereas CTGF was identified as a fibrogenic factor, recapitulating the cellular events associated to the development of TV. Interestingly, 16 of these SPM did not contain a peptide signal, suggesting that non conventional secretion mechanisms could be favored during the effector phase of apoptosis. We demonstrated that activated caspase-3 regulates the exosomal secretion pathway associated to the export of nanovesicles TCTP +ve, anti-apoptotic and biochemically different from apoptotic blebs. Finally, the overall proteomic data generated a new hypothesis suggesting that in response to apoptotic stress, the cell exports different mediators (soluble and vesicular) by non conventional mechanism through the fusion of endocytic organelles and autophagic vacuoles with the plasma membrane, releasing their content into the extracellular milieu. This mechanism should be regulated during the effector phase of apoptosis favoring a vascular repair response only when cell’s demise reaches a point of no return. Therefore, these PMS could be used both as biomarkers of apoptosis or as biopharmaceutical targets to decrease the incidence of chronic vascular repair.

Les régions terminales (les télomères) des chromosomes de la plupart des organismes sont<br />essentielles au maintien de l'intégrité des chromosomes et sont impliquées dans la cancérogenèse et<br />le vieillissement cellulaire. Les télomères sont formés d'un brin riche en guanines et d'un brin<br />complémentaire riche en cytosines. In vitro, chaque brin s'organise en une structure repliée, le<br />quadruplexe de guanines pour l'un, le motif i pour l'autre, ce qui pose la question du rôle<br />biologique de ces structures. Plusieurs protéines s'associant au brin G et favorisant la formation de<br />quadruplexes de guanines sont connues. Deux protéines reconnaissant spécifiquement le brin C de<br />l'ADN télomérique humain viennent d'être identifiées (ASF/SF2 et hnRNP K).<br />Nous avons voulu contribuer à la compréhension des mécanismes de régulation des<br />télomères en recherchant une protéine se liant spécifiquement à une séquence d'ADN télomérique<br />riche en cytosines. Cette étude a été entreprise sur un organisme eucaryote, la levure<br />Saccharomyces cerevisiae.<br />Nous avons commencé par montrer que le fragment d'ADN télomérique de levure,<br />d[(CCCACA)3CCC], pouvait former un motif i in vitro. Nous avons observé par migration<br />électrophorétique non dénaturante, la formation d'un complexe ADN-protéine sur lequel nous<br />avons focalisé nos efforts. La masse moléculaire de cette protéine (~ 250 kDa) a été déterminée par<br />passage sur tamis moléculaire. L'association ADN-protéine a été observée pour une gamme de pH<br />allant de 6 à 8. Un duplexe d'ADN B d(CGCGATCGCG) ou une petite suite de cytosines d(CCC)<br />ne sont pas compétiteurs et le signal retardé est atténué de moitié pour un rapport monobrin<br />d(T14)/sonde de 4000. L'ADN d'E. coli, coupé en fragments de 10 à 1000 bases, est compétiteur<br />(50%) pour un rapport compétiteur/sonde égal à 1000. Mais toutes les séquences d'oligomères<br />testées formant in vitro un motif i monomérique (séquences comptant 4 répétitions de 2, 3, 4 ou 5<br />de désoxycytidines, dont des séquences télomériques ou centromériques naturelles), entrent en<br />compétition avec la séquence d[(CCCACA)3CCC], notamment dans des conditions (pH,<br />température, force ionique,..), où le motif i est observé in vitro.<br />Pour identifier les protéines impliquées dans l'association avec l'ADN télomérique, nous<br />avons utilisé des billes de streptavidine greffées ou non avec la séquence d'ADN. Nous avons<br />identifié les protéines liées à l'ADN par spectrométrie de masse MALDI-TOF et Q-TOF MS/MS. Il<br />s'agit de trois protéines Yhr216p, Ylr432p et Yml056p, dont les séquences sont très proches. Cette<br />identification a été confirmée par séquençage par dégradation d'Edman de peptides internes. Les<br />séquences de ces protéines sont similaires (~ 78 %) aux deux inosine 5'-monophosphate<br />déshydrogénases humaines (IMPDH 1 et 2 (masse de ~ 56 kDa)) connues pour leur implication<br />dans le métabolisme des purines. Celles-ci sont habituellement observées sous forme tétramérique<br />(masse > 200 kDa). Malgré la présence dans des extraits nucléaires humains HeLa d'une protéine<br />ayant des caractéristiques de migration natives identiques à celles observées chez la levure, et<br />différentes des protéines ASF/SF2 et hnRNP K déjà identifiées, nous avons montré que les<br />protéines IMPDH 1 et 2 purifiées ne sont pas capables de fixer seules l'ADN télomérique humain.<br />Nous montrons également que les protéines identifiées (Yhr216p, Ylr432p et Yml056p)<br />s'associent au brin complémentaire riche en G. Des migrations électrophorétiques en présence de<br />compétiteurs montrent que cette association est spécifique. A notre connaissance, il s'agit des<br />premières protéines de levures interagissant séparément avec chacun des deux brins télomériques<br />dans des conditions d'incubation où l'on observe la formation de quadruplexes de guanines et de<br />motif i.

Les maladies cardiovasculaires (CV) représentent la première cause de mortalité lors de l'insuffisance rénale chronique (IRC). Cette morbidité apparat précocement lors de l'IRC et ne peut être explique par les facteurs de risque traditionnels. Le stress oxydant (SO), composante du cortège métabolique de l'IRC, représente un facteur de risque non traditionnel intriqué avec l'inflammation et la malnutrition. Le but de ce travail a été d'étudier la place du SO dans la survenue des complications CV au cours de l'IRC sur modale animal, puis de comparer le profil protéomique et la fonctionnalité des HDL in vitro entre sujets hémodialysés (HD) et témoins. Le SO au niveau CV a été étudié dans un modèle animal (adénine) d'IRC associé à la malnutrition. L'activité de la NADPH oxydase cardiaque est triple, alors que les activités des complexes de la chaîne respiratoire mitochondriale et de la SOD sont normales. Cette surproduction d'anion super oxyde est associé à une surexpression de l'ostéopontine et du pro-collagène de type I. L'étude protéomique des HDL de sujets HD et témoins a permis de préciser les anomalies qualitatives associées à la baisse des HDL induite par l'IRC. Les propriétés anti-oxydantes des HDL de ces mêmes sujets ont été étudiées in vitro sur un modèle d'oxydation des LDL au cuivre et sur un modèle cellulaire d'activation de la NADPH oxydase. En comparaison aux témoins, les HDL des sujets HD perdent leur capacité de protection des LDL contre l'oxydation. Par contre, la modulation de la NADPH oxydase sur modèle cellulaire est conservée avec les HDL de sujets HD mais serait moindre en présence d'une forte inflammation systémique. Ces résultats suggèrent que le SO est au cœur des complications cardiaques au cours de l'IRC. Parmi les mécanismes de défense endogènes, les propriétés anti-oxydantes des HDL sont en partie altérées chez le sujet HD. / Cardiovascular (CV) diseases are the first cause of mortality during chronic kidney disease (CKD) and cannot only be explained by traditional risk factors (age, gender, dyslipidemia, hypertension). Oxidative stress, which has been associated with CKD, appears as a non-traditional risk factor closely interconnected with inflammation and malnutrition.This study aimed at investigating oxidative stress in CV complications in uremic rats. Then, HDL proteomic profile and in vitro functionality of HDL were compared between hemodialyzed (HD) patients and control subjects.First, an animal model of CKD associated with malnutrition, the adenine-fed rats, was set up in order to study CV oxidative stress. NADPH oxidase activity was increased three-fold, but the maximal activity of mitochondrial respiratory chain complexes and SOD were not different between groups. Superoxide anion output was associated with accumulation of osteopontin and of pro-collagen type I. In a second part, HDL proteomic study from HD and control subjects was performed to characterize qualitative modifications associated with the decrease in HDL observed in CKD. HDL anti-oxidative activities from these subjects were studied in vitro in a model of copper-induced LDL oxidation and in a cellular model of NADPH oxidase activation. Compared to control, HDL from HD patients failed to protect LDL oxidation. By contrast, HDL modulation of NADPH activity is maintained in HD patients but could be impaired by elevated inflammation.These results suggest that oxidative stress is a key event in cardiac complications during CKD. Among protective endogenous mechanisms, HDL anti-oxidative properties could be impaired in HD patients.

La phagocytose est un processus par lequel des cellules spécialisées du système immunitaire comme les macrophages ingèrent des microorganismes envahisseurs afin de les détruire. Les microbes phagocytés se retrouvent dans un compartiment intracellulaire nommé le phagosome, qui acquiert graduellement de nombreuses molécules lui permettant de se transformer en phagolysosome possédant la capacité de tuer et dégrader son contenu. L’utilisation de la protéomique a permis de mettre en évidence la présence de microdomaines (aussi nommés radeaux lipidiques ou radeaux membranaires) sur les phagosomes des macrophages. Notre équipe a démontré que ces radeaux exercent des fonctions cruciales au niveau de la membrane du phagosome. D’abord nous avons observé que la survie du parasite intracellulaire L. donovani est possible dans un phagosome dépourvu de radeaux lipidiques. Parallèlement nous avons constaté qu’un mutant de L. donovani n’exprimant pas de LPG à sa surface(LPG-) est rapidement tué dans un phagosome arborant des radeaux membranaires. Pour comprendre le mécanisme de perturbation des microdomaines du phagosome par la molécule LPG, nous avons provoqué la phagocytose de mutants LPG- du parasite et comparé par microscopie les différences avec le parasite de type sauvage. Nous avons ainsi démontré que le LPG de L. donovani est nécessaire et suffisant au parasite pour empêcher la maturation normale du phagosome. Nous avons également découvert que la molécule LPG permet d’empêcher la formation des radeaux lipidiques sur le phagosome et peut aussi désorganiser les radeaux lipidiques préexistants. Enfin, nous avons montré que l’action de LPG est proportionnelle au nombre d’unités répétitives de sucres (Gal(β1,4)-Manα1-PO4) qui composent cette molécule. Nos travaux ont démontré pour la première fois le rôle important de ces sous-domaines membranaires dans la maturation du phagosome. De plus, nos conclusions seront des pistes à suivre au cours des études cliniques ayant pour but d’enrayer la leishmaniose. Le second objectif de ce travail consistait à effectuer la caractérisation des radeaux lipidiques par une analyse protéomique et lipidomique à l’aide de la spectrométrie de masse. Nous avons ainsi entrepris l’identification systématique des protéines présentes dans les radeaux membranaires des phagosomes et ce, à trois moments clés de leurmaturation. Le traitement des phagosomes purifiés avec un détergent nous a permis d’isoler les «Detergent Resistent Membranes» (DRMs) des phagosomes, qui sont l’équivalent biochimique des radeaux membranaires. Nous avons ainsi établi une liste de 921 protéines associées au phagosome, dont 352 sont présentes dans les DRMs. Les protéines du phagosome sont partagées presque également entre trois tendances cinétiques (augmentation, diminution et présence transitoire). Cependant, une analyse plus spécifique des protéines des DRMs démontre qu’une majorité d’entre elles augmentent en fonction de la maturation. Cette observation ainsi que certains de nos résultats montrent que les radeaux lipidiques des phagosomes précoces sont soit très peu nombreux, soit pauvres en protéines, et qu’ils sont recrutés au cours de la maturation du phagosome. Nous avons aussi analysé les phospholipides du phagosome et constaté que la proportion entre chaque classe varie lors de la maturation. De plus, en regardant spécifiquement les différentes espèces de phospholipides nous avons constaté que ce ne sont pas uniquement les espèces majoritaires de la cellule qui dominent la composition de la membrane du phagosome. L’ensemble de nos résultats a permis de mettre en évidence plusieurs fonctions potentielles des radeaux lipidiques, lesquelles sont essentielles à la biogenèse des phagolysosomes (signalisation, fusion membranaire, action microbicide, transport transmembranaire, remodelage de l’actine). De plus, la cinétique d’acquisition des protéines de radeaux lipidiques indique que ceux-ci exerceraient leurs fonctions principalement au niveau des phagosomes ayant atteint un certain niveau de maturation. L’augmentation du nombre de protéines des radeaux membranaires qui s’effectue durant la maturation du phagosome s’accompagne d’une modulation des phospholipides, ce qui laisse penser que les radeaux membranaires se forment graduellement sur le phagosome et que ce ne sont pas seulement les protéines qui sont importées. / Macrophages are specialized cells of the immune system which mediate destruction and killing of invading micro-organisms. They do so by engulfing them by a process called phagocytosis. Microbes are then captured in an intracellular compartment, the phagosome, which gradually acquire molecules able to attack and degrade its cargo. Use of proteomics let us demonstrate the presence of flotillin-1 enriched microdomains (also called lipid rafts or membrane rafts) on the phagosomes. Our team demonstrated the crucial importance of these rafts in the phagocytosis process. Indeed, survival of L. donovani correlates with its presence in a ‘raftless’ phagosome while a mutated L. donovani without LPG is rapidly killed in a phagosome containing lipid rafts. To understand the membrane raft destabilisation mechanism mediated the LPG molecule, we induced phagocytosis of parasites devoid of LPG (LPG-) and compared it to the wild type parasite by microscopy. We first demonstrated that LPG alone is necessary to prevent normal maturation of the phagosome. Additionally, we discovered that the LPG molecule not only inhibits lipid rafts formation on the phagosome but also disorganise pre-existing lipid rafts. This effect of LPG is proportional to the number of repetitive sugar units (Gal( 1,4)-Man 1-PO4) which compose this molecule. Our work demonstrated for the first time an important role of the membrane rafts in the phagosome maturation. Moreover, our conclusions will give new interesting leads for clinical studies on leishmaniosis. The second goal of this work was to characterise them with proteomics and lipidomics tools. To do this, we undertook the systematic identification of proteins present on both subdomains of the phagosome (lipid rafts versus the rest of the phagosomal membrane). To achieve this, we purified phagosomes, from which we isolated lipid rafts by floating Triton X-100 insoluble membranes (DRMs for Detergent Insoluble Membranes). After that, we identified proteins by mass spectrometry.

Mémoire numérisé par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal.

L’entérotoxine B staphylococcique (SEB) est une toxine entérique hautement résistante à la chaleur et est responsable de plus de 50 % des cas d’intoxication d’origine alimentaire par une entérotoxine. L’objectif principal de ce projet de maîtrise est de développer et valider une méthode basée sur des nouvelles stratégies analytiques permettant la détection et la quantification de SEB dans les matrices alimentaires. Une carte de peptides tryptiques a été produite et 3 peptides tryptiques spécifiques ont été sélectionnés pour servir de peptides témoins à partir des 9 fragments protéolytiques identifiés (couverture de 35 % de la séquence). L’anhydride acétique et la forme deutérée furent utilisés afin de synthétiser des peptides standards marqués avec un isotope léger et lourd. La combinaison de mélanges des deux isotopes à des concentrations molaires différentes fut utilisée afin d’établir la linéarité et les résultats ont démontré que les mesures faites par dilution isotopique combinée au CL-SM/SM respectaient les critères généralement reconnus d’épreuves biologiques avec des valeurs de pente près de 1, des valeurs de R2 supérieure à 0,98 et des coefficients de variation (CV%) inférieurs à 8 %. La précision et l’exactitude de la méthode ont été évaluées à l’aide d’échantillons d’homogénat de viande de poulet dans lesquels SEB a été introduite. SEB a été enrichie à 0,2, 1 et 2 pmol/g. Les résultats analytiques révèlent que la méthode procure une plage d’exactitude de 84,9 à 91,1 %. Dans l’ensemble, les résultats présentés dans ce mémoire démontrent que les méthodes protéomiques peuvent être utilisées efficacement pour détecter et quantifier SEB dans les matrices alimentaires. Mots clés : spectrométrie de masse; marquage isotopique; protéomique quantitative; entérotoxines / Staphylococcal enterotoxin B is a highly heat-resistant enteric toxin and it is responsible for over 50% of enterotoxin food poisoning. It represents a particular challenge during food processing since, even if the bacteria have been destroyed, the biological activity of the toxin remains unchanged. The objective of this study was to develop and validate a new method based on a novel proteomic strategy to detect and quantify SEB in food matrices. Tryptic peptide map was generated and 3 specific tryptic peptides were selected and used as surrogate peptides from 9 identified proteolytic fragments (sequence coverage of 35%). Peptides were label with light and heavy form of acetic anhydride to create an isobaric tag that will allow quantification. The linearity was tested using mixtures of different molar ratios and the results showed that measurements by LC-MS/MS were within generally accepted criteria for bioassays with slope values near to 1, values of R2 above 0.98 and less than 8% coefficient of variation (%CV). The precision and accuracy of the method were assessed using chicken meat homogenate samples spiked with SEB at 0.2, 1 and 2 pmol/g. The results indicated that the method can provide accuracy within 84.9 – 91.1% range. Overall, the results presented in this thesis show that proteomics-based methods can be effectively used to detect, confirm and quantify SEB in food matrices. Keywords: mass spectrometry; stable isotope labeling; quantitative proteomics; enterotoxins

La tuberculose reste l'une des maladies les plus meurtrières dans le monde et de nouvelles stratégies sont urgemment demandées pour combattre Mycobacterium tuberculosis (Mtb), l'agent éthiologique de la maladie. Les lipides jouent un rôle important dans le cycle de vie de la bactérie et sont largement présents dans sa membrane et son cytoplasme, où ils peuvent servir en tant que sources de carbone et d'énergie pour favoriser la pathogénicité et la survie pendant les phases d'infection et de persistance. Dans ce contexte, les rôles des enzymes lipolytiques restent mal définis et demandent à être davantage caractérisés. La première partie de ce travail de thèse a été consacrée à l'étude des douze enzymes de Mtb homologues à la lipase hormono-sensible humaine. Les effets du MmPPOX, un composé oxadiazolone très sélectif de cette famille de protéines, ont été évalués sur les enzymes recombinantes et directement in vivo sur Mtb et M. bovis BCG. Cet inhibiteur a démontré une activité antimycobactérienne, suggérant des rôles métaboliques importants pour ces enzymes. La seconde partie de ce travail a été consacrée à l'étude des mécanismes physico-chimiques dont dépendent fortement les inhibitions des lipases et des carboxylestérases in vivo, comme la présence de substrats et/ou de détergents. La spectrométrie de masse a également été introduite en tant qu'outil rapide et puissant pour caractériser les adduits [enzyme-inhibiteur]. Enfin, nous avons développé une approche de chimie protéomique pour capturer sélectivement des hydrolases à sérine à partir de milieux biologiques complexes. / Tuberculosis remains one of the deadliest diseases in the world and new strategies are urgently needed to combat Mycobacterium tuberculosis (Mtb), its etiologic agent. Lipids play an important part in the lifetime of the bacterium, as they are widely present in the membrane and stored in the cytoplasm, where they could be used as carbon and energy sources to promote pathogenicity and survival during infection and persistence. In this context, roles of lipolytic enzymes are still poorly understood and remain to be characterized. The first part of my work was devoted to the study of twelve Mtb enzymes homologous to the human hormone-sensitive lipase. Effects of MmPPOX, an oxadiazolone compound highly selective for this family of proteins, were investigated using recombinant enzymes and directly tested in vivo using Mtb and M. bovis BCG. This inhibitor demonstrated antimycobacterial activities, suggesting important metabolic roles for these enzymes. The second part of this work was devoted to the study of physico-chemical mechanisms on which lipase and carboxylesterase inhibition could strongly depend in vivo, like presence of substrates and/or detergents. Mass spectrometry was also introduced as a direct and powerful tool to characterize [enzyme-inhibitor] adducts. Finally, we developed chemical proteomics approaches to specifically capture serine hydrolases from complex biological media. We aimed to synthesize a grafted alkylphosphonate inhibitor on a solid support by assaying several grafting strategies and matrices of various chemical natures.

Les objectifs de ce travail sont d'identifier les mécanismes biologiques impliqués dans le déterminisme de la variabilité de la fonte lipidique à la cuisson du foie gras de canard, et de définir des marqueurs de la fonte. Pour répondre à ces objectifs, nous avons choisi de conduire une caractérisation du tissu hépatique, selon son comportement ultérieur à la cuisson, basée sur une approche intégrée combinant de la biochimie, de la protéomique et de l'histologie. D'une part, l'expression différentielle des protéines hépatiques à l'abattage des animaux et au cours de la réfrigération, semble indiquer que le niveau de fonte pourrait être relié à des stades de développement de stéatose différents. Les animaux du groupe ‘Fonte faible' se distinguent de ceux du groupe ‘Fonte élevée' par un ‘profil d'accrétion' avec la surexpression de protéines du métabolisme énergétique par exemple, indiquant des mécanismes de synthèse et d'accumulation de lipides. A l'inverse, les animaux du groupe ‘Fonte élevée' présentent la surexpression de protéines de réponse au stress, ce qui pourrait indiquer un stade de stéatose plus avancé. Au cours de la réfrigération, la diminution globale de l'expression des protéines semble plus marquée dans le groupe ‘Fonte faible'. Dans le groupe ‘Fonte élevée', la surexpression de protéines du cytosquelette après réfrigération suggère un niveau de protéolyse plus important. D'autre part, les observations histologiques montrent des modifications de la morphologie des gouttelettes lipidiques dans le foie gras cru et au cours de la cuisson. Il semble que la fonte soit d'autant plus importante quand des fusions de gouttelettes lipidiques surviennent dans le produit cru. De plus, lors de la cuisson, les observations sur foies gras du groupe ‘Fonte élevée' révèlent une densification de la matrice non lipidique plus importante. Ces changements morphologiques et structuraux pourraient correspondre à un tissu plus fragile et donc plus sensible à la fonte lipidique. L'ensemble des résultats acquis dans ce projet permet de formuler une hypothèse sur le déterminisme biologique de la fonte lipidique même si certains mécanismes identifiés restent à confirmer. De plus, la relation entre l'aptitude à la stéatose et la qualité technologique du foie gras est une piste à explorer afin de mieux comprendre la variabilité de la fonte lipidique à la cuisson observée lors de la cuisson du foie gras de canard. / This work aims to identify the biological mechanisms involved in the determinism of variability of fat loss during cooking of duck ‘foie gras'. To achieve this objective, we carried out a characterization of liver tissue, according to its later behaviour during cooking, and based on an integrated approach combining biochemistry, proteomic and histology. On the one hand, the differential expressions of proteins early post mortem and during chilling indicate a different state of steatosis between the low and high fat loss groups. Livers with low fat loss during cooking were still in anabolic processes with regards to energy metabolism and protein synthesis, whereas livers with high fat loss during cooking developed cell protection mechanisms. The overall expression of proteins in the low ionic strength fraction was lower after chilling which revealed a down regulating effect of chilling on biological processes. In the high ionic strength fraction, the results showed an over expression after chilling of proteins from cytoskeleton and their associated proteins. This suggests that the variability of technological yield observed in processing plants could be explained by different state of ageing of fatty livers during chilling, most likely associated to different proteolytic pattern. On the other hand, the histological observations showed that, in raw livers, the lipid droplets were nearly spherical while after cooking, they were larger and lost their spherical shape. We also observed a decrease in the number of droplets after cooking, probably due to droplet fusion caused by the heat treatment. Fat loss during cooking was higher when there was more fusion of lipid droplets before cooking. Furthermore, it seemed that the effect of cooking on liver tissue was different between the two fat loss groups. These morphological modifications could mark a fragility of the tissue associated with a higher fat loss during cooking. All the results acquired in this work allowed us to draw a hypothesis on the biological determinism of cooking losses eventhough some of the identified mechanisms still need to be confirmed. The relationship between the potential to develop steatosis and the technological quality of ‘foie gras' deserves further studies in order to better understand the variability in fat loss during cooking observed in processing plants.

Les cellules épithéliales nasales humaines (CENH) sont des acteurs importants de la physiopathologie de la polypose naso-sinusienne (PNS), le plus souvent la PNS est primitive (étiologie inconnue), plus rarement, elle est secondaire à la mucoviscidose (PNS CF) ou la dyskinésie ciliaire primitive (PNS DCP). L'objectif de cette thèse est d'identifier des protéines différentiellement exprimées dans les PNS primitives et secondaires par approche protéomique puis de les caractériser par des techniques classiques. Dans cette étude, nous avons utilisé des cultures primaires (interface air/liquide) de CENH, dérivant de déchet per-opératoire (PNS) ou de brossages (muqueuse saine). Le marquage iTRAQ suivie d'une analyse par nano-LC-MALDI-TOF-TOF à en particulier montré : 1) une augmentation de six marqueurs du stress du réticulum endoplasmique (RE) dans la PNS primitive et la PNS CF, 2) une altération du métabolisme du glucose dans la PNS CF (sous-expression de 6 protéines dont la pyruvate kinase, enzyme clef de la glycolyse) et 3) une sous expression de 12 protéines des filaments acto-myosines dans la PNS DCP (dont 3 tropomyosines). Nous avons caractérisé le stress du RE dans la PNS primitive, montrant qu'il est induit par le biais d'une sensibilité des CENH à un stress oxydatif probablement d'origine mitochondrial et qu'il participe activement à l'inflammation (sécrétion d'IL-8 et de LTB4). Ces observations nous permettent de proposer que, dans la PNS primitive, il existe un cercle vicieux entre stress du RE, stress oxydatif et inflammation et que la sensibilité au stress oxydatif observée apparaît comme une nouvelle cible thérapeutique dans le traitement de la PNS. / Human nasal epithelial cells (HNEC) play an important role in nasal polyposis(NP). NP have generally an unknown etiology, less frequently, NP is secondary to cystic fibrosis (CF NP) or primary ciliary dyskinesia (PCD NP). The aim of this thesis is to identify differentially expressed proteins in NP, CF NP and PCD NP using proteomic approach then to characterize them by classical methodes. In this study, we used primary culture (air/liquid)of HNEC derived from NP patients (surgery waste) or healthy patients (brushing). The iTRAQ labeling folowing by nano-LC-MALDI-TOF-TOF analysis shown in particular :1)an increased expression of six endoplasmic reticulum (ER) stress markers in NP and CF NP, 2)an alteration of glucose metabolism (decreased expression of six proteins with in particular the pyruvate kinase, glycolysis key enzyme) and 3)an decreased expression of 12 acto-myosin filament proteins (in particular three tropomyosins). We caracterized the ER stress in NP showing that ER stress is activated by an oxydative stress susceptibility of NP HNEC probably of mitochondrial origin and that it directly participate to inflammation (IL-8 and LTB4 secretions). Altogether, our results underline a vicious circle that exists between oxidative stress, ER stress and inflammation.The oxydative stress susceptibility observed in NP may represent new therapeutic target in such a pathology.