Le paludisme est un problème de santé public dans de nombreux pays. Cinq espèces infectent l'homme : P. falciparum, responsable de la grande majorité des décès, et P. vivax, P. ovale, P. malariae et P. knowlesi qui provoquent des formes bénignes de la maladie. Le diagnostic qui fait partie des moyens de lutte, est une urgence médicale. Les tests de diagnostic rapides (TDRs) dont l'usage est recommandés par l'OMS, sont donc de plus en plus employés. Cependant, la détection et l'identification des espèces non P. falciparum par ces tests est insuffisante. Le besoin en nouveaux couples « antigènes-anticorps » est une nécessité pour améliorer les TDRs. Au cours de ce travail, de nouveaux anticorps anti LDH de P.malariae ont été produits.Une recherche de nouveaux antigènes a également été entreprise. Pour cela, certaines enzymes de la voie de la glycolyse ont été étudiées. Pour la première fois des séquences des enzymes de cette voie ont été obtenues pour P. ovale et P. malariae. Elles ont permis de déterminer de nombreux épitopes cibles potentiels spécifiques et ceux communs à toutes les espèces. Dans un deuxième temps, une recherche en protéomique a été menée pour identifier des biomarqueurs parasitaires. L'étude du culot globulaire et du plasma de patients infectés a permis la sélection de 8 protéines cibles originales. Ces travaux préparent la fabrication et la commercialisation par la société Whidiag d'une nouvelle génération de TDRs pour le paludisme. / Malaria is a public health problem in many countries. Five species infect humans: P. falciparum, responsible for the vast majority of deaths, and P. vivax, P. ovale, P. malariae and P. knowlesi causing mild forms of the disease. The diagnostic is a means of control and a medical emergency. The rapid diagnostic tests (RDT) whose are recommended by WHO, are increasingly used. However, the detection and identification of not P. falciparum species is insufficient. New "antigen-antibody" couples are a need to improve the RDTs performance. In this work, new anti LDH antibodies from P. malariae were produced. A search for new antigens was also undertaken. For this purpose, some enzyme of glycolysis pathway were studied. For the first time the sequences of the enzymes from this pathway were obtained for P. ovale and P. malariae. We identified many potential target epitopes specific and common to all those species. In a second step, a proteomics approches has been conducted to identify parasites biomarkers. The study of red blood cells and plasma of infected patients has led to the selection of 8 original target proteins. This work prepares the manufacturing and marketing of a new generation of RDTs for malaria by the company Whidiag

Bacillus cereus est une bactérie aéro-anaérobie facultative à Gram positif ubiquiste pouvant s’adapter à de nombreux environnements et s’y développer. C’est un agent pathogène de l’homme capable de produire tout un éventail de protéines extracellulaires et de toxines jouant un rôle majeur dans la pathogénicité de ce micro-organisme. B. cereus croit suivant un métabolisme de type respiratoire en aérobiose et fermentaire en anaérobiose en l’absence d’accepteur final d’électrons. En aérobiose, la chaine respiratoire est une source majeure des dérivés réactifs de l'oxygène (ROS) endogènes. En anaérobiose, les ROS endogènes sont générés en réponse au stress oxydant secondaire au stress nutritionnel et au stress réducteur, lorsque les cultures sont réalisées à bas potentiel d’oxydo-réduction (POR). Les résidus méthionines (Met) sont particulièrement sensibles à l’oxydation par les ROS. L’oxydation des Met conduit à la formation de méthionine sulfoxyde (Met(O)), un dérivé oxydé stable détectable par spectrométrie de masse (MS). L'oxydation des résidus Met est réversible : leur réduction est catalysée par des méthionines sulfoxyde réductases (Msr). Pour déterminer le rôle de l’oxydation des résidus Met, nous avons réalisé une étude exhaustive par MS de la dynamique de l’exoprotéome de la souche ATCC 14579 (pBClin 15) de B. cereus en aérobiose (pO2 = 100%) et en anaérobiose (pO2 = 0%) à haut (POR initial = +140 mV) et bas potentiel redox (PORi= -350 mV). Les résultats ont montré que la dynamique des toxines était représentative de la dynamique de l’exoprotéome à la fois en termes d’abondance relative de protéines et d’oxydation des Met dans les trois conditions testées. L’analyse des résultats suggèrent que (i) l’abondance des toxines et leur taux de méthionines oxydés reflètent le niveau d’oxydation cellulaire et (ii) la sécrétion de toxines au cours de la croissance cellulaire contribue au maintien de l'homéostasie redox intracellulaire en piégeant les ROS endogènes, en particulier en phase active de croissance en aérobiose et en fin de croissance en anaérobiose. Pour étayer l’hypothèse selon laquelle, les Met des protéines extracellulaires, et des toxines en particuliers sont des composants de la machinerie cellulaire antioxydante, nous avons construit une souche mutante ne synthétisant plus MsrAB et comparer le protéome et l’exoprotéome de cette souche mutante avec celle de la souche parentale en aérobiose et anaérobiose à haut POR. Cette étude a mis en évidence l’implication de MsrAB mais également du plasmide cryptique pBClin15 dans la sécrétion des toxines et le maintien de l'homéostasie redox intracellulaire / Bacillus cereus is a Gram-positive aerobic or facultative anaerobic worldwide-distributed bacterium. In addition, B. cereus is a human pathogen able to produce a range of extracellular enzymes and toxins playing a major role in the virulence of the bacteria. In presence of oxygen, B. cereus performs respiration. Without oxygen or other electron acceptors, it performs mixed-acid fermentation. Under aerobiosis, the respiratory electron transport chain is a major source of endogenous reactive oxygen species (ROS). Under anaerobiosis, endogenous ROS are generated in response to reductive stress (mainly under high-reductive anaerobiosis) and to starvation (nutrient stress), i.e. in response to secondary oxidative stresses. Methionine residues (Met) of proteins are vulnerable to oxidation by free radicals. Oxidation of Met leads to the formation of methionine sulfoxide (Met (O)), a stable by-product detectable by mass spectrometry (MS). Met(O) can be reduced back to Met by the action of methionine sulfoxide reductase (Msr). To determine the role of oxidation of Met residues, B. cereus exoproteome time courses were monitored by MS under low oxidation-reduction potential (ORP) anaerobiosis (initial ORP = +140 mV and pO2 = 0%), high-ORP anaerobiosis (iORP = -350 mV and pO2 = 0%), and aerobiosis (pO2 = 100%). The results indicated that toxin-related proteins were the most representative of the exoproteome changes, both in terms of protein abundance and their Met(O) content in the presence and in the absence of oxygen. The analysis results suggest that (i) the abundance of toxins and their oxidized methionines rates reflect the cellular oxidation level and (ii) the secretion of toxins during growth helps to maintain redox homeostasis by keeping endogenous ROS at bay, during the exponential growth phase under aerobic conditions and at the end of growth under anaerobiosis. To support our hypothesis that Met residues of extracellular proteins, particulars of toxins are components of the cellular machinery antioxidant, we constructed a mutant strain by deleting the gene of MsrAB and compare the cellular proteome and exoproteome of this mutant strain with the wild-type strain under aerobiosis and high-ORP anaerobiosis. This study highlighted the involvement of MsrAB but also pBClin15 plasmid in the secretion of toxins and maintain of the intracellular redox homeostasis.

La spectrométrie de masse apparaît au travers de la technologie SRM (Selected Reaction Monitoring) comme une alternative crédible aux tests immunologiques pour la quantification de biomarqueurs. Cependant, les limites de quantifications et de détections atteintes ne sont pas suffisantes pour réaliser des dosages cliniques. Afin d'améliorer les limites de détections, nous nous sommes intéressés au couplage de la spectroscopie optique avec la spectrométrie de masse pour le dosage de biomarqueurs. Ce couplage s'appelle la Photo-SRM. Je me suis donc appliqué, dans un premier temps, à étudier les propriétés optiques de biomolécules dans des domaines de longueurs d'ondes différents allant du VUV au visible. Par la suite, la preuve de concept de l'outil Photo-SRM a été réalisée. Suite à une modification instrumentale réalisée sur un spectromètre de masse de type triple quadripôle, un laser continu émettant des photons dans le domaine du visible, 532 nm, a été implémenté dans cet instrument. Cet outil a ensuite été appliqué pour un dosage multiplexé des protéines endogènes majoritaires du sérum humain. Ces protéines ont été dosées via des peptides protéotypiques contenant des cystéines. L'ensemble du sérum a donc été dérivé en amont de l'analyse. Nous avons souhaité appliquer la Photo-SRM au dosage des métabolites. En effet, dans de nombreuses pathologies, les métabolites et les protéines jouent un rôle important. Par exemple, les œstrogènes utilisés comme contraceptif ont un impact sur les concentrations des protéines de coagulation. Il semble donc intéressant de pouvoir étudier ces deux familles de biomolécules lors d'une même analyse. Enfin, avec l'avènement des instruments hybrides, tels que les Q-TOF et le Q-exactive, la quantification n'est plus réservée qu'à l'usage des instruments de type triple quadripôle. Ces instruments permettent de doser des biomolécules aux mêmes ordres de grandeur que les triples quadripôles en mode SRM. Ces instruments permettent également de réaliser des expériences de découvertes en protéomique. La modification instrumentale d'un Q-exactive, hybride quadripôle-Orbitrap, est présentée suivie d'expériences préliminaires. Ce couplage ouvre donc de nouvelles perspectives d'étude en quantification mais également en découverte protéomique / Targeted mass spectrometry using selected reaction monitoring (SRM) has emerged as an alternative to immunoassays for protein quantification owing to faster development time and higher multiplexing capability. However, the SRM strategy is faced with the high complexity of peptide mixtures after trypsin digestion of whole plasma or the cellular proteome that most of the time causes contamination, irremediably, by interfering compounds in the transition channels monitored. This problem becomes increasingly acute when the targeted protein is present at a low concentration. In this work, the merit of laser-induced photo-dissociation in the visible region at 473 nm implemented in an hybrid quadrupole linear ion-trap mass spectrometer (photo-SRM) was evaluated for detection specificity of cysteine-containing. Compared with conventional SRM, photo-SRM chromatograms have improved detection specificity for most of peptides monitored. Comparison of the signals obtained for the best proteotypic peptides in SRM mode and those recorded by photo-SRM of cysteine-containing peptides for the same proteins reveals either increased (up to 10-fold) or similar signal to photo-SRM detection. Finally, photo-SRM has extended response linearity across a calibration plot obtained by diluting human plasma in rat plasma, down to the lowest concentrations. Hence, photo-SRM may advantageously complement conventional SRM in assay of proteins in complex biological matrices

Le carisbamate est la 1ère molécule à avoir un effet modificateur de l’épileptogenèse, dont environ 50% des animaux traités développent des crises d’absence, au lieu des crises limbiques normalement observées dans le modèle de la pilocarpine. Le principal objectif de cette thèse a été celui d’étudier les altérations qui se produisent par le traitement par le carisbamate. Pour cela nous avons effectué une cartographie de l’activité cérébrale, avec un immunomarquage de la protéine c-Fos, et nous avons vérifié les concentrations des monoamines et acides aminés dans l’hippocampe, le thalamus et dans le cortex piriforme par HPLC, 4h après le début du status epilepticus (SE). Enfin, nous avons vérifié le profil d’expression protéique dans l’hippocampe, 2 mois après le SE par électrophorèse bidimensionnelle.Les résultats indiquent que le carisbamate augmente l’activité des noyaux MD et LD du thalamus. Les résultats suggèrent aussi que la dopamine, la noradrenaline, le GABA et la sérotonine peuvent participer à la significative neuroprotection et à l’effet modificateur de l’épileptogenèse du carisbamate. L’étude de protéomique suggère également une réduction globale du métabolisme énergétique cellulaire chez les rats traité par le carisbamate qui développent des crises d’absence. / The carisbamate is the 1st molecule showing an epileptogenesis modifying effect, that about 50% of treated animals develops absence instead limbic seizures, commonly seen in the pilocarpine model. The aim of this thesis was to study the changes that follows carisbamate treatment. Therefore, we made a brain activity cartography, by labelling c-Fos protein, and we quantified the concentrations of amino acids and monoamines in hippocampus, thalamus and piriform cortex, 4h after the status epilepticus (SE). Moreover, we studied the protein expression profile in the hippocampus, 2 month after SE, by two-dimensional electrophoresis.The results points towards an increased activity of MD and LD thalamic nuclei in carisbamate treated rats. Furthermore, dopamine, noradrenaline, GABA and serotonin appears to play a role in neuroprotection and in the epileptogenesis modifying effect of carisbamate. The proteomic study revealed a global reduction of cellular energetic metabolism of carisbamate treated rats that develops absence seizures.

Les ADN topoisomérases de type 2 (Top2) sont des protéines universelles et essentielles à la vie cellulaire. Elles ont pour fonction de réguler de manière fine l’équilibre topologique de l’ADN. Chez l’homme, les Top2 (HsTop2) sont des cibles thérapeutiques de première importance en oncologie. Des molécules telles que l’étoposide et la doxorubicine font partie des traitements anticancéreux les plus utilisés en clinique à l’heure actuelle, elles agissent en stabilisant les complexes Top2/ADN/inhibiteurs qui sont transformés en lésions permanentes dont l’accumulation entraîne la mort cellulaire. Mon travail de thèse porte sur la caractérisation fonctionnelle et structurale des isoformes des HsTop2 entières en complexe avec des composés thérapeutiques. Mon projet de thèse comporte trois axes principaux et complémentaires : (i) La production et la caractérisation fonctionnelle in vitro des isoformes recombinantes. Nous avons optimisé et simplifié les protocoles de surexpression des deux isoformes dans la levure et avons également mis au point leur expression dans les cellules de mammifère. (ii) une étude structurale par cryo-microscopie électronique sur les HsTop2 entières en complexe avec des composés thérapeutiques et des oligonucléotides. Ces premiers travaux ont permis l’obtention d’une carte tridimensionnelle de l’enzyme entière qui servira de base pour l’étude de l’architecture des HsTop2 au sein de complexes protéiques de plus grande taille. (iii) des expériences de protéomique chimique permettant de mettre à jour les cibles secondaires potentielles de l’étoposide et de la doxorubicine dans des extraits cellulaires de lignées cancéreuses. / The type 2 DNA topoisomerases are universal proteins essential for cell survival. These enzyme fine tune the topological equilibrium of the DNA in cells. The human proteins are major targets of therapeutics drugs used in oncology. Molecules like etoposide and doxorubicin are among the most effective anticancer drugs used in chemotherapy treatments; they form stable Top2/DNA/drugs complexes which are then transformed in permanent DNA damages. This thesis project focuses on the functional and structural characterization of these complexes using 3 main strategies:(i) the production and the in vitro functional characterization of the recombinant isoforms. We optimized and simplified the production and purification procedures and overexpressed both isoforms in mammalian cells. (ii) a structural study by cryoelectron microscopy on the full enzyme complex with DNA and therapeutic drugs. We obtained a 3D density map that will be used for further studies on the architecture of large HsTop2 associated complexes. (iii) ChemoProteomic experiments on cancer cell lines to highlight the potential etoposide and doxorubicin secondary targets.

L’objectif de cette thèse était de développer et d’optimiser de nouvelles méthodologies et approches analytiques afin d’améliorer le potentiel de l’analyse protéomique pour les études biologiques.La première partie de ce travail est consacrée à la détermination massive et exacte de la position N-Terminale des protéines (N-Terminome). Pour cela, nous avons utilisé et développé une approche basée sur une dérivation N-Terminale au TMPP. Cette méthodologie de marquage de la position N-Terminale a permis d’aborder l’étude des clivages protéolytiques des protéines exportées par le parasite P. falciparum (pathogène de la malaria) dans le globule rouge.Afin de permettre une exploitation automatique à haut débit des données de MS/MS, nous avons élaboré une nouvelle méthodologie (dénommée dN-TOP). Celle-Ci repose sur l’utilisation de TMPP portant des isotopes stables et permet ainsi d’accéder à la détermination des positions N-Terminales pour des études de N-Terminome à large échelle.La seconde partie est dédiée aux développements de différentes stratégies analytiques de quantification, aussi bien au niveau peptidique qu’au niveau protéique, appliquées à une série de problématiques biologiques. Ces optimisations ont été réalisées dans le contexte de l’étude des complexes protéiques, du dosage de prion par SRM, de quantification des glycations d’anticorps monoclonaux thérapeutiques et de l’hémoglobine HbA2 pour la standardisation des méthodes de référence. / The objective of this Ph.D. thesis was to develop and optimize new methodologies and analytical approaches to improve the potential of the mass spectrometry based proteomics.The first part of this work focused on the development of the N-Termini proteomics. This topic was addressed with a specific N-Termini chemical derivatization based on TMPP. We have shown that our method allowed both specific N-Terminomics and classical proteomics studies in the same experiment.This N-Terminus methodology was applied to study the proteolytic cleavages of the exported proteins in P. falciparum, a parasite responsible for the malaria.In order to automatize the complex and tedious informatics processsing of the MS/SM data of ourTMPP based N-Terminomics method, we have introduced a new approach (named dN-TOP), based on the use of a stable isotope labeled TMPP which made now N-Terminome proteomics compatible with high throughput studies.The second part addresses quantitative aspects of proteomics. It describes the optimization of quantitative methods at the peptide level or at the protein level for five different proteomic studies in the context of protein complex subunits, targeted SRM based prion, quantification of monoclonal antibodies glycation and hemoglobin HbA2 for reference measurement methods standardization.

L'Athérosclérose est la principale cause de décès et d'invalidité dans le monde. L'implication du système rénine-angiotensine-aldostérone (RAAS) dans le développement de la maladie est expérimentalement et cliniquement bien documentée. Toutefois, en raison de la complexité du système, ces études ne donnent pas de vision claire sur l'association entre le système et la maladie. À cet égard, nous avons étudié l'organisation fonctionnelle d'un ensemble de 37 gènes codant pour les composants classiques et nouvellement découverts du RAAS, y compris les substrats, les enzymes et les récepteurs. Cet ensemble a été appelé RAAS étendu (extRAAS). En utilisant une analyse statistique des données du transcriptome de l'athérome carotidien humain, nous avons révélé des caractéristiques spéciales de l'expression de l'extRAAS associées au remodelage athéromateux. Une caractéristique importante de ce modèle est la coordination de 2 groupes de gènes qui sont connus pour favoriser la formation de l'athérome. Le premier groupe est constitué de gènes codant pour les peptidases de l'angiotensine, y compris ACE, CTSG, CTSD et RNPEP. Le deuxième groupe est constitué des gènes codant pour les récepteurs AGTR1, MR, GR et LNPEP / Atherosclerosis remains and continues to be the leading cause of death and disability in the world. The implication of Renin-angiotensin-aldosterone system (RAAS) in the development of the disease is well experimentally and clinically documented. However, due to the complexity of the system, these studies remain dispersed and give no clear global view of the association between the system and the disease. In this regard, we studied the functional organization of a set of 37 genes encoding classical and newly discovered RAAS participants, including substrate, enzymes and receptors. This set was called extended RAAS (extRAAS). Using statistical analysis of human carotid atheroma transcriptome involving gene clustering, we revealed special features of extRAAS expression associated with atheromatous remodeling. An important feature of this pattern was the coordination of 2 clusters of genes that are known to favor atheroma formation. The first cluster constitutes genes that encode for angiotensin peptidases, including ACE, CTSG, CTSD and RNPEP. Whereas the second encode for receptors (AGTR1, MR, GR and LNPEP). We hypothesized that the local pattern of extRAAS gene expression plays a key role in the development of atherosclerosis by orienting the metabolism of active peptides

Ces dernières années, des progrès remarquables ont été accomplis afin d’élucider la biosynthèse des flavonoïdes. Cependant les dernières étapes menant à la formation des proanthocyanidines ou tannins condensés issus de la vigne, restent à ce jour inconnues. Dans le but de déterminer si une ou plusieurs enzyme(s) spécifique(s) sont impliquées dans cette voie de biosynthèse, nous avons développé une approche de protéomique chimique, impliquant des matrices d’affinité constituées de substrats de type flavanols greffés sur un support solide. La validation de ces outils à l’aide de LDOX, une enzyme issue de Vitis vinifera a pu être menée à bien dans le cadre de ces travaux de thèse. / Remarkable progress toward the complete elucidation of the biosynthesis of flavonoids has been accomplished during the last decade, but the final step leading to proanthocyanidins still remain to be elucidated, in particular, the exact nature of starter and extension units as well as the enzymatic or non enzymatic condensation process. In order to answer whether some specific enzymes are involved in the biosynthesis of grapevine proanthocyanidins, we have developped a chemical proteomics approach, with an affinity chromatography-based tool in which a flavanol type substrate is loaded on an appropriate solid support. The validation of these tools with the LDOX enzyme from Vitis vinifera was developped and performed in this Ph.D work.

La kinase Aurora A est une protéine essentielle au cycle cellulaire et plus particulièrement lors de la mitose. En effet, Aurora A est nécessaire à l'entrée en mitose et joue un rôle dans la maturation des centrosomes. Elle participe à l'assemblage du fuseau mitotique et est nécessaire à la réussite de la cytodiérèse. Elle est également nécessaire à l'égale répartition des mitochondries dans les cellules filles et joue un rôle dans l'épissage alternatif des ARNm de facteurs apoptotiques. Au-delà de ses fonctions mitotiques, plusieurs études récentes indiquent qu'Aurora A présente des fonctions supplémentaires dans les cellules en interphase. Elle est notamment essentielle au désassemblage du cil primaire et joue un rôle dans la dynamique des microtubules et la migration cellulaire. Enfin, une dérégulation de son expression, de sa stabilité et/ou de son activité perturbe le déroulement du cycle cellulaire ce qui conduit à la transformation des cellules et favorise l'apparition de cancers. Ses fonctions normales ainsi que ses fonctions lors de la carcinogenèse sont conduites à travers les nombreux partenaires protéiques qui entrent en interaction avec elle. Ils modulent son activité, sa localisation et sa stabilité. En retour Aurora A phosphoryle un bon nombre d'entre eux régulant ainsi leur activité, localisation et stabilité. Cependant, l'analyse des interactions déjà connues d'Aurora A ne permet pas d'expliquer tous les phénotypes observés lors de sa dérégulation. Afin de mieux comprendre les fonctions d'Aurora A, les mécanismes qui la régulent et mettre en évidence ses multiples rôles au sein de la cellule, j'ai construit puis analysé un interactome d'Aurora A généré à partir d'une méthode de purification d'affinité couplée à la spectrométrie de masse en tandem. J'ai identifié 477 partenaires potentiels dont 180 présentant une forte probabilité d'être des partenaires directs de la kinase. L'analyse bioinformatique approfondie de cet interactome a permis de révéler les partenaires associés à des mécanismes liés à la mitochondrie et l'épissage des ARN messagers mettant en évidence une implication potentielle d'Aurora A dans ces mécanismes. Pour valider cet interactome, j'ai choisi d'étudier plus précisément deux partenaires identifiés dans cette étude : les protéines WDR62 et CEP97. J'ai montré que ces deux partenaires co-localisent avec Aurora A et sont phosphorylés par la kinase. Ainsi, ce travail de thèse a permis de mettre en évidence un nombre important de nouveaux partenaires d'Aurora A associés à de nouvelles fonctions. L'étude de ces nouvelles fonctions liées aux mitochondries et à l'épissage des ARN, constitue deux nouveaux projets actuellement menés par des collaborateurs au sein de notre institut. / The kinase Aurora A is an essential mitotic cell cycle protein. Aurora A is necessary for mitotic entry and for the maturation and separation of centrosomes. It participates in mitotic spindle assembly and chromosome biorientation, and it is essential for the completion of cytokinesis. Furthermore, Aurora A activity is necessary for the equal distribution of mitochondria to daughter cells and, through its role in the alternative splicing of mRNA of apoptotic factors, it provides a link between cell cycle control and apoptosis. Beyond its mitotic functions, several recent studies suggest that Aurora A is also important during interphase. Notably, it influences microtubule dynamics, promotes cell migration and polarity control and is essential for primary cilia disassembly. Reflecting the fact that Aurora A is found to be up-regulated in many cancers, deregulation of Aurora A activity can result in an aberrant cell cycle, ultimately leading to malignant transformation of cells. The crucial regulation of Aurora A’s numerous functions is achieved through its interaction with several protein partners, which modulate its activity, localisation and stability. Aurora A in turn phosporylates a number of them, thus regulating their activity, localisation and stability. However, the known interactions of Aurora A cannot explain all the phenotypes that have been described of its deregulation.To better understand the functions of Aurora A, the regulation mechanisms governing it, and to expose its multiple roles in the cell, I have built and analysed an Aurora A interactome using tandem affinity purification coupled with mass spectrometry. This resulted in the identification of 477 potential interacting partners, of which, 180 were determined to have a high probability of interacting directly with the kinase.In-depth bioinformatic analysis of this interactome has revealed the associated partners to be related to mitochondria and mRNA splicing, highlighting the potential involvement of Aurora A in these mechanisms. To validate the interactome, two of the proteins identified in this study, WDR62 and CEP97, were examined in detail. Here I show that these two proteins colocalise with Aurora A, and are phosphorylated by the kinase.WDR62 is implicated in microcephaly and is deregulated in certain cancers. I have shown that Aurora A phosphorylates WDR62 during mitosis, and that this phosphorylation is necessary for its localisation to the centrosomes. CEP97 is a poorly charactarised protein of the primary cilium, abnormalities of which are associated with ciliopathies. I have shown that Aurora A phosphorylates CEP97 in vitro, and that the inhibition of Aurora A activity in vivo perturbs the localisation of CEP97 to cilia and centrosomes.This study has identified a number of new Aurora A-interacting proteins, implicating the kinase with novel functions. These functions, related to mitochondria and mRNA splicing have opened up a new area for further investigation.

Au regard des nombreux avantages en terme de rapidité, de coût, de sensibilité et de fiabilité de la spectrométrie de masse MALDI-TOF nous avons cru pouvoir l’appliquer à l’étude des cellules eucaryotes intactes, en particulier à l’étude des cellules immunitaires. Nous avons ainsi montré que cette approche était applicable à l'analyse globale des cellules eucaryotes y compris des cellules immunitaire circulantes. En outre, elle a permis de caractériser les multiples facettes d'activation des macrophages humain en analysant les données avec le logiciel R, la librairie « MALDIquant » et des algorithmes spécifiques. Les empreintes peptidiques/protéiques induites par les agonistes M1, IFN-γ, TNF, LPS et LPS + IFN-γ ou les agonistes M2, IL-4, TGF-β1 et IL-10, sont distinctes des macrophages non stimulés et spécifiques de chaque agoniste. La spectrométrie de masse MALDI -TOF peut ainsi être utilisée pour caractériser les sous-types de macrophages M1 et M2. En outre, les empreintes induites par des bactéries extracellulaires (streptocoque du groupe B, Staphylococcus aureus) sont spécifiques et similaires à celles induites par l'IL-4. Les réponses des macrophages à des bactéries intracellulaires (BCG, Orientia tsutsugamushi, Coxiella burnetii) sont également uniques. La spectrométrie de masse MALDI-TOF sur cellules entières a ainsi révélé donc les multiples facettes d'activation des macrophages humains. Enfin, des résultats préliminaires montrent que notre approche pourrait être utilisée en clinique en analysant les cellules circulantes de la réponse immune. / In view of the many advantages in terms of speed, cost , sensitivity and reliability of the MALDI -TOF mass, we thought we could apply it to the study of intact eukaryotic cells, in particular the study of cells immune . We have shown that this approach is applicable to the global analysis of eukaryotic cells including circulating immune cells. In addition, it allowed us to characterize the many faceted of human macrophage activation by analyzing the data with the R software library " MALDIquant " and specific algorithms. The protein/peptide fingerprint induced by the M1 agonists : IFN - γ , TNF , LPS and LPS + IFN - γ or M2 agonists : IL- 4 , TGF - β1 and IL- 10 are distinct to unstimulated macrophages and specific for each agonist. MALDI -TOF Mass spectrometry can then be used to characterize the subtypes M1 and M2 macrophages . In addition, fingerprints induced by extracellular bacteria ( group B streptococcus , Staphylococcus aureus ) are specific and closed to those induced by IL -4 . The responses of macrophages to intracellular bacteria (BCG, Orientia tsutsugamushi , Coxiella burnetii ) are also unique. Mass spectrometry MALDI -TOF of whole cell revealed therefore the multifaceted activation in human macrophages . Finally, preliminary results show that our approach could be used clinically for the analysis of circulating cells in the case of host-pathogen interaction.