O estudo do processo de tradução no metabolismo celular atrai o interesse de vários grupos, em particular, o estudo do 21o aminoácido, a selenocisteína. A incorporação da selecisteína foi descrita em Escherichia coli e recentemente em eucariotos. O primeiro passo desta via é iniciado pela Seril-tRNA Sintetase que aminoacila o Ser-tRNASec (SelC) com uma serina. Em E. coli, o segundo passo é realizado pela Sec-sintetase (SelA) que remove o grupo hidroxil da cadeia lateral da serina, formando um intermediário aminoacrilil. Este serve como aceptor de seleno-fosfato gerando a selenocisteína. Em eucariotos, o processo análogo é realizado pela PSTK e pela SepSecS, que fosforila e seleniza a serina respectivamente. Interessados nesta parte da via, iniciamos estudos moleculares das enzimas Fosfoseril-tRNA Kinase de Trypanosoma brucei e Leishmania major e Seril-tRNA Sintetase de Trypanosoma brucei. Para o gene da enzima Fosfoseril-tRNA Kinase de T. brucei não foi possível obter um clone sem mutação. Já o gene da enzima Fosfoseril-tRNA Kinase de L. major foi clonado em vetor pET28 e a enzima foi expressa em células de E. coli porém com baixo rendimento impedindo a continuidade dos experimentos planejados. Portanto passou-se a investigar a enzima envolvida no primeiro passo da via, no caso, a Seril-tRNA Sintetase de T. brucei. Esta já se encontrava clonada e expressando em E. coli na fração solúvel. A proteína recombinante foi purificada com precipitação com 60% de sulfato de amônio e resinas de hidrofobicidade e de afinidade por níquel. Experimentos de gel nativo, DLS e fluorescência de anisotropia revelaram que, após a purificação, a enzima permanece estável e livre de agregações, possuindo um raio hidrodinâmico de 4,32nm e massa molecular de 110kDa. Acima de 150nM de proteína, ela encontra-se inteiramente na forma dimérica. Estabelecidos estes parâmetros, informações sobre a ligação com o Ser-tRNASec poderão ser obtidos a partir da técnica de anisotropia de fluorescência visto que experimentos iniciais realizados com a SerRS adicionando-se o Ser-tRNASec mostraram-se promissores. / The translation process study is central role in the cellular metabolism and attracts the interest of several groups, in particular, the study of the 21º amino acid, the selenocystein. The selenocystein incorporation pathway was described in Escherichia coli and recently in eukaryotes. The first step of this pathway is initiated by Seryl-tRNA Synthetase that aminoacilates the Ser-tRNASec (SELC) with serine. In E. coli, the second step is performed by the Sec-synthase (SELA) that removes hydroxyl group of the serine side chain, forming an aminoacrylil intermediary. This serves as an acceptor of seleno phosphate generating the selenocystein. In eukaryotes, the similar process is performed by PSTK and SepSecS, which phosphorylate serine and adds the selenium, respectively. Interested in this pathway, we performed initial molecular studies of the Phosphoseryl-tRNA synthetase of Trypanosoma brucei and Leishmania major and Seryl-tRNA synthetase of Trypanosoma brucei. The gene that encodes T. brucei Phosphoseryl-tRNA synthetase was obtained with several mutations. However, the gene encoding the T. brucei Phosphoseryl-tRNA synthetase was cloned into pET28 vector and the enzyme was expressed in E. coli cells, however at low amounts hampering the intended experiments. Therefore we initiated the investigation of the enzyme involved in the first step of this pathway, the Seryl-tRNA Synthetase from T. brucei. The enzyme was already cloned and expressing in the soluble fraction of E. coli. The recombinant protein was purified using 60% ammonium sulfate precipitation, hydrophobic and nickel affinity chromatography. Native gel experiments, DLS and anisotropy fluorescence was performed and allowed to conclude that, after purification, the enzyme remains stable and free of aggregation, with a hydrodynamic radius of 4.32 nm, molecular weight of 110kDa. Above 150nM protein its entirely in the dimeric form. Information about Ser-tRNASec binding can now be obtained from the technique of anisotropy seen that initial experiments with SerRS add Ser-tRNASec be shown to be promising.

Resumo: O objetivo neste estudo foi analisar a utilização das proteínas de fase aguda (PFA) e perfil bioquímico-sérico como um método para realizar diagnóstico diferencial precoce de mucometra e piometra. Coletaram-se amostras do endométrio de fêmeas caninas hígidas na fase de diestro, sem qualquer alteração ou afecção no trato reprodutor ou em outros sistemas (Grupo diestro: Grupo 1, n=39) e amostras do endométrio de fêmeas caninas acometidas por mucometra (Grupo mucometra: Grupo 2, n=43), e fêmeas caninas acometidas por piometra (Grupo piometra, Grupo 3 ao 6, n=118), durante ovariohisterectomias (OH) eletivas ou terapêuticas. Os dados também foram comparados entre os grupos categorizados segundo a classificação ASA (American Society of Anesthesiologists). Realizou-se anamnese do histórico reprodutivo detalhado, exame físico, exame de macroscopia vulvar, citologia vaginal, exames hematológicos e bioquímicos, e dosagem sérica de progesterona e estradiol, exames de imagem (radiografia e ultrassonografia abdominal). A concentração de proteína total do soro sanguíneo foi determinada pelo método do biureto. As leituras das amostras foram realizadas em espectrofotômetro semi-automático (Labquest, Labtest, Belo Horizonte, Minas Gerais, Brasil), com comprimentos de onda específicos para o teste. Para o fracionamento proteico utilizou-se a técnica SDS-PAGE. Verificou-se que conforme a evolução do quadro inflamatório, os níveis séricos das proteínas de fase aguda, ceruloplasmina, transferrina... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: The objective of this study was to analyze the use of acute phase proteins (PFA) and biochemical-serum profile as a method to perform early differential diagnosis of mucometra and pyometra. Samples of the endometrium of healthy canine females were obtained in the right-handed stage, without any alteration or affection in the reproductive tract or in other systems (Group 1, n = 39) and endometrial samples of canine females affected by mucometra (Group 2, n = 43), and canine females affected by pyometra (Pyometra Group, Group 3 to 6, n = 118) during elective or therapeutic ovariohysterectomies (OH). The data were also compared among the groups classified according to the ASA (American Society of Anesthesiologists) classification. Anamnesis of the detailed reproductive history, physical examination, vulvar macroscopy examination, vaginal cytology, hematological and biochemical exams, and serum progesterone and estradiol dosage, imaging (radiography and abdominal ultrasonography) were performed. The total protein concentration of the blood serum was determined by the biuret method. The sample readings were performed in semi-automatic spectrophotometer (Labquest, Labtest, Belo Horizonte, Minas Gerais, Brazil), with specific wavelengths for the test. SDS-PAGE was used for protein fractionation. Serum levels of the acute phase proteins, ceruloplasmin, transferrin, albumin (p <0.0001), IgGCP (p <0.0001), haptoglobin (p <0.0001), alpha glycoprotein acid (p <0.0001), IgGCL (p <0.0001) ... (Complete abstract click electronic access below) / Doutor

Orientador: Antonio Ismael Inácio Cardoso / Banca: Fernando Ferrari Putti / Banca: Cristiaini Kano / Banca: Elizabeth Orika Ono / Banca: Fernando Cesar Sala / Resumo: Em pimentão a floração e a frutificação são contínuas, o que faz com que a planta tenha frutos e sementes em diferentes estádios de maturação. Dessa forma, identificar o estádio em que as sementes alcançam a maturidade fisiológica é fundamental para a determinação do momento ideal de colheita dos frutos. Diante do exposto, objetivou-se com este trabalho estudar o efeito do estádio de maturação e do repouso pós-colheita dos frutos na qualidade fisiológica, na resposta bioquímica e na composição química de sementes de pimentão. O trabalho foi dividido em dois capítulos, em ambos o delineamento experimental utilizado foi de blocos casualizados, com oito tratamentos, resultantes de um fatorial 4x2, com quatro repetições. O primeiro fator foi constituído de quatro estádios de maturação (35, 50, 65 e 80 dias após a antese (DAA)) e o segundo, sem e com o repouso dos frutos pós-colheita, por 7 dias. Foram avaliados dois genótipos que apresentam padrão de qualidade visual de sementes diferentes, ou seja, sem (1730) e com (190-2) o escurecimento do tegumento das sementes. No primeiro capítulo as características avaliadas nas sementes foram a determinação do teor de água, massa de mil sementes, germinação, vigor (primeira contagem do teste de germinação e índice de velocidade de germinação), atividade das enzimas superóxido dismutase (SOD), catalase (CAT) e peroxidase (POD), a peroxidação lipídica (LIP) e o teor de peróxido de hidrogênio (H2O2). No segundo capítulo foram avaliados nas s... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: In sweet pepper the flowering and the fruiting are continuous, which causes that the plant has fruits and seeds in different stages of maturation. Thus, to identify the stage in which the seeds reach the physiological maturity is fundamental to determine the ideal moment to harvest the fruits. In view of this, the objective of this work was to study the effect of maturation stage and post-harvest rest of the fruits in physiological quality, biochemical response and chemical composition in pepper seeds. The work was divided in two chapters, in both the experimental design was randomized blocks, with eight treatments, resulting from a 4x2 factorial, with four replications. The first factor consisted of four maturation stages (35, 50, 65 and 80 days after anthesis (DAA)) and the second, without and with the post-harvest rest, for 7 days. Two genotypes with different seed quality standards were evaluated, that is, without (1730) and with (190- 2) darkening of seed integument. In the first chapter the characteristics evaluated in the seeds were the determination of the content of moisture, weight of a thousand seeds, germination, vigor (first germination test count and germination velocity index), superoxide dismutase (SOD), catalase (CAT) and peroxidase (POD) enzyme activity, lipid peroxidation (LIP) and hydrogen peroxide content (H2O2).In the second chapter were evaluated the dry mass of one thousand seeds, the macronutrient and protein contents in the seeds.The fruit harvest time indicated for seeds of genotype 1730 without and with the rest of the fruits is around 80 DAA and for the 190-2 genotype without the rest of the fruits it is at 72 DAA and with rest at 58 DAA. In these stages of maturation, the seeds present maximum germination and vigor. The post-harvest rest of the fruits provided higher physiological quality for the two genotypes, as well as a higher weight of one thousand seeds... / Doutor

Neste trabalho serão apresentados resultados sobre três sistemas proteícos diferentes: Lisozima, Crioglobulina e Proteassomo, analisados a partir, principalmente, da técnica de espalhamento de Raios X a baixos ângulos. Técnicas como microscopia eletrônica de transmissão e espalhamento de luz dinâmico foram utilizadas como técnicas complementares. Os resultados apresentados demonstram o potencial único que a técnica de espalhamento a baixos ângulos possui no estudo de sistemas em solução. Os dados correspondem a um estudo em um grande intervalo de tamanhos para as proteínas estudadas (15kDa to 750 kDa), requerendo diferentes abordagens em cada caso. Como será mostrado, para casos onde se tem um meio monodisperso, diversas metodologias de modelagem podem ser utilizadas. Para o sistema composto de Lisozima, por se tratar de uma proteína amplamente estudada na literatura, é interesante poder comparar os resultados encontrados com os já publicados e observar sua estabilidade em solução. O peso molecular calculado a partir dos dados de espalhamento foi 15kDa, que está em bom acordo com a esperado para esta proteina (14,6 kDa). Além disso, ao variar-se a concentração da proteína em solução, é possível observar um fator de interação entre as partículas para maiores concentrações. Esse fator de interação pode ser considerado próximo ao de esferas rígidas. Para o sistema de Crioglobulinas, houve uma dificuldade na purificação da amostra, mas ainda assim apresentaremos alguns resultados interessantes, em que a técnica de SAXS fornece informações sobre a flexibilidade de proteínas e as análises para as amostras de um pool de imunoglobulinas indicou que com a diminuição da temperatura a dispersão de raios de giro aumenta, indicando a formação de agregados. Para o sistema do Proteassomo, diversas análises se mostraram possível e resultados novos puderam ser obtidos e publicados. Dos estudos utilizando MET,com as micrografias obtidas tem-se a indicação de diferenças na estrutura, quando a molécula está em condições diferentes. Das análises feitas por SAXS, é possível utilizar duas modelagens diferentes, uma simples, outra mais avançada, em que se pode concluir que a redução do Cys-PT glutatiolado induz mudanças conformacionais. Além disso, resultados de SAXS e MET estão em concordância e fornecem informações complementares. / In this work results will be presented on three different protein system: Lysozime, Cryoglobulin and Proteasome, analyzed mainly by Small Angle X-ray scattering technique. Techniques such as transmission electron microscopy and dynamic light scattering were used as complementary techniques. The results show that an unic potential Small Angle X-ray scattering technique around the study of systems in solution. The data correspond to a study of a wide range of sizes for the studied proteins (15kDa to 750 kDa), requiring different approaches in each case. As will be shown for cases where there is a monodisperse system, different modeling methodologies may be used. For the system composed of Lysozyme, because it is a protein widely studied in the literature, it is interesting to compare the results with those already published and observe its stability in solution. The molecular weight calculated from the scattering data was 15kDa, which is in good agreement with the expected for this protein (14.6kDa). Futhermore by varying the concentration of the protein in solution, it is possible to observe a factor of interaction between the particles for higher concentrations. This interaction factor can be considered close to the rigid spheres. For Cryoglobulins system, there was a difficulty in the sample purification, but still present some interesting results, where the SAXS technique provides information on the flexibility of proteins and the analysis for the samples from a pool of immunoglobulin indicated that with decreasing temperature, the dispersion of radius of gyration increases, indicating the formation of aggregates. For the proteasome system, various analyzes have proved possible and new results could be obtained and published. From studies using TEM, with the micrographs we have the indication of differences in the structure, when the molecule is in different conditions. From the analyzes made by SAXS, it is possible to use two different modeling, a simple one, and other more advanced, where it can be concluded that the reduction of the Cys-PT glutathiolated induces conformational changes. Moreover, SAXS and TEM results are in agreement and provide additional information.

Orientador: Luis Gustavo Gosuen Gonçalves Dias / Coorientador: Pedro Paulo Maia Teixeira / Banca: Annelise Carla Camplesi dos Santos / Banca: Felipe Farias Pereira da Câmara Barros / Resumo: O objetivo deste trabalho foi descrever e avaliar a aplicabilidade e exequibilidade da técnica de miniligadura pré-montada, passada por punção abdominal percutânea (Miniloop), para hemostasia preventiva do complexo arteriovenoso ovariano (CAVO) em ovariectomia laparoscópica em gatas. Comparou-se a técnica em tela frente à técnica aberta minimamente invasiva para hemostasia do CAVO. Foram utilizadas 20 gatas saudáveis distribuídas em dois grupos contendo 10 pacientes em cada um. No grupo controle (GC) a cirurgia foi realizada com auxílio do gancho de Snook e ligadura do CAVO com polidiaxanona 2-0. O grupo miniloop (GM) foi operado por técnica videolaparoscópica com dois portais e miniligadura pré-montada passada por punção percutânea de 2 mm, utilizando o mesmo fio. No transoperatório, frequência cardíaca (FC) e respiratória (FR), EtCO2 (gás carbônico expirado) e temperatura corporal foram monitorados constantemente com monitor multiparamétrico. Avaliou-se dor por meio de escalas de avaliação subjetiva nos períodos pré-operatório, 1, 12, 24, 48, 72 horas e 10 dias após o início do retorno anestésico. Por venopunção da jugular externa, amostra de sangue foi coletada para determinação de proteínas de fase aguda (APP) e leucograma no pré-operatório, 1, 12, 24, 48, 72 horas e 10 dias após o início do retorno anestésico e, para determinar inflamação pós-operatória e comparar as duas técnicas cirúrgicas. O tempo de cirurgia e anestesia foi maior no GM, já o tempo de recuperação foi... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: The aim of this study was to evaluate the applicability and feasibility of percutaneous pre-tied miniligature (miniloop) for ovarian vasculature hemostasis in laparoscopic ovariectomy in queens. It was compared to open minimally invasive technique on post-operative pain and inflammation. It was used 20 cats, female, health, distributed in two groups, each one containing 10 animals. On control group (GC) the surgery was performed by laparotomy with Snook hook aid and ovarian vasculature ligation using polidiaxianone, 2-0. On Miniloop Group (GM) was performed videolaparoscopy with two-portal access and percutaneous miniloop with same surgical wire. During the surgery, cardiac frequency (FC) and breath frequency (FR), etCO2 and temperature were monitored with multiparameter monitor. It was performed pain evaluation by subjective scales at preoperative, 1, 6, 24 and 48 hours after anestesic recuperation. Blood was taken in jugular to measure APPs and leucogram at preoperative, 1, 24, 48, 72 hours and 10 days after anesthetic return, to determine inflammation and compare two techniques. Duration of anesthesia and surgery was longer on GM, but recuperation time was similar in two groups. FR and etCO2 were taller on GM, except at incision moment, although FC and temperature were taller on GC during all surgery. No difference between groups or moments was observed in pain evaluation. Segmented neutrophil were similar at all times on GC, but on GM had a pic at 48 and 72 hours. To APP... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

Orientador: Daisy Maria Favero Salvadori / Resumo: O carcinoma urotelial representa um dos tipos mais comuns de neoplasias urinárias, apresentando altas taxas de recorrência, agressividade e progressão para doença músculo- invasiva. Devido à complexidade dos sistemas biológicos, pouco é conhecido sobre os mecanismos moleculares responsáveis pelos carcinomas uroteliais. Nos últimos anos, a introdução de novas ferramentas de bioinformática permitiu identificar novas moléculas e mecanismos implicados na carcinogenese. Neste estudo foram feitas duas abordagens com o objetivo de identificar novos potenciais biomarcadores para tumores uroteliais de baixo e alto graus. Inicialmente, a partir de dados de sequenciamento de RNA, foram avaliados os níveis de expressão gênica e o perfil de splicing do mRNA em amostras tumorais obtidas do biorrepositório da Faculdade de Medicina da USP (FMUSP). Os dados mostraram que os tumores de baixo e alto graus, comparados com tecido saudável de bexiga, apresentavam alteração na expressão em genes da via do TP53, e de splicing de mRNA de genes relacionados a ciclo celular, adesão, migração e processamento do RNA. Os tumores de alto grau, comparados aos de baixo grau, apresentavam aumento da expressão de genes relacionados à quimiotaxia (GREM1, S100A12, NR4A1, IL6, CCL20, CXCL8, S100A9, CXCL10, CXCL11 e CCL7) e a funções neuronais (EPHB2, CNTNAP2, KCNQ3, TENM2, RDH12, DPF1, SHISA9, SLC30A3, MME e MSI1). Além disso, foram identificadas, exclusivamente nos tumores de alto g... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Urothelial carcinoma represents one of the most common types of urinary neoplasms, with high rates of recurrence, aggressiveness and progression to invasive muscular disease. Due to the complexity of the biological systems, little is known about the molecular mechanisms responsible for urothelial carcinomas. In recent years, the increase of bioinformatics tools has enabled the identification of new molecules and molecular mechanisms involved in carcinogenesis. In this study, two approaches were conducted aiming to identify new potential biomarkers for low and high grades urothelial tumors. Initially, data from RNA sequencing showed the levels of gene expression and splicing profile for urothelial tumors (low and high grades) and normal bladder tissues obtained from the biorepository of the University of São Paulo Medical School (FMUSP), Brazil. The gene expression profiling demonstrated modulated expression in genes related to the TP53 pathway in both low and high grade tumors. In addition, the splicing data showed that the preferentially affected genes were those related to cell cycle, adhesion, migration and RNA processing. The high-grade tumors presented increased expression of genes related to chemotaxis (GREM1, S100A12, NR4A1, IL6, CCL20, CXCL8, S100A9, CXCL10, CXCL11 and CCL7) and neuronal functions (EPHB2, CNTNAP2, KCNQ3, TENM2, RDH12, DPF1, SHISA9, SLC30A3, MME and MSI1). Furthermore, splicing modification in transcriptional factors (GAS5, RPL10, RPL13A and RPL37A) wi... (Complete abstract click electronic access below) / Doutor

Orientador: Maria Célia Bertolini / Banca: Iran Malavazi / Banca: Sergio Akira Uyemura / Resumo: O fungo filamentoso Neurospora crassa é um organismo modelo utilizado na compreensão de diversos aspectos da biologia dos eucariotos, e tem sido usado, em nosso laboratório, para estudos celulares básicos, como os mecanismos bioquímicos e moleculares envolvidos na regulação do metabolismo de glicogênio. Uma análise sistemática realizada com uma coleção de linhagens mutantes em genes codificadores de fatores de transcrição permitiu identificar várias proteínas potencialmente envolvidas na regulação do metabolismo do glicogênio neste organismo. Algumas linhagens mutantes apresentaram alterações no perfil de acúmulo de glicogênio e na expressão dos genes que codificam as enzimas glicogênio sintase (gsn) e glicogênio fosforilase (gpn) quando comparadas à linhagem selvagem. Dentre estas, duas linhagens mutantes em genes que codificam para a proteína RCO-1 (regulator of conidiation-1) e para uma proteína hipotética foram selecionadas para o presente estudo, levando em consideração que ambas linhagens também apresentaram variações na progressão do ciclo celular quando analisadas por citometria de fluxo. Como a proteína RCO-1 é uma provável parceira da proteína RCM-1 (regulator of conidiation and morphology-1), então a linhagem mutante no gene codificador de RCM-1 foi incluída neste trabalho. Portanto, foi feita a caracterização de um fator de transcrição anotado como proteína hipotética e de dois cofatores transcricionais RCO-1 e RCM-1, ortólogos ao complexo corepressor Tup1-Ssn6 de Saccharomyces cerevisiae. As proteínas RCO-1, RCM-1 e a codificada pela ORF NCU09739 estão envolvidas na regulação do metabolismo do glicogênio, atuando na regulação da expressão dos genes gsn e/ou gpn. Estas mesmas proteínas também são necessárias para o crescimento e desenvolvimento normal do... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: The filamentous fungus Neurospora crassa is a model organism used to understand various aspects of eukaryotic biology. It has been used, in our laboratory, in basic cellular studies, such as the biochemical and molecular mechanisms involved in the regulation of glycogen metabolism. A systematic analysis performed with a collection of mutant strains in genes encoding transcription factors led to the identification of proteins likely involved in the regulation of glycogen metabolism in this organism. Some mutant strains showed changes in the glycogen accumulation profile and in the expression of the genes encoding the enzymes glycogen synthase (gsn) and glycogen phosphorylase (gpn) when compared to the wild-type strain. Among these, two mutant strains in the genes encoding RCO-1 (regulator of conidiation-1) and a hypothetical proteins were selected for the present study. Both strains presented variations in cell cycle progression when analyzed by flow cytometry. RCO-1 protein is likely a partner of RCM-1 (regulator of conidiation and morphology-1) protein, thus the mutant strain in the gene encoding RCM-1 was included in this work. Therefore, we performed the characterization of a transcription factor annotated as a hypothetical protein and the two transcriptional cofactors RCO-1 and RCM-1, orthologs of the Saccharomyces cerevisiae corepressor complex Tup1-Ssn6. RCO-1, RCM-1 and the product of the ORF NCU09739 are involved in the regulation of glycogen metabolism, acting in the regulation of gsn and/or gpn gene expression. The same proteins are necessary for growth and normal development of the fungus, since the mutant strains showed changes in hyphae length, pigmentation and conidiation. Gene expression analysis showed that the NCU09739 gene was highly expressed at the beginning of the conidia germination, showing the importance... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

Orientador: Maria Célia Bertolini / Co-orientador: Fernanda Zanolli Freitas / Banca: Cleslei Fernando Zanelli / Banca: Roberto do Nascimento Silva / Resumo: Neste trabalho, uma coleção de linhagens mutantes de N. crassa em proteínas quinases foi adquirida pelo nosso laboratório e estas linhagens foram utilizadas a fim de identificar as proteínas envolvidas no controle do metabolismo do glicogênio no fungo. Estas proteínas foram anotadas como pertencentes a diferentes classes de proteínas quinases devido às características dos seus domínios quinases. Inicialmente foram identificadas as quinases que estão envolvidas no controle do metabolismo do carboidrato através da quantificação do conteúdo de glicogênio, tanto em uma situação de crescimento vegetativo (30 °C), como sob a condição de estresse térmico (45 °C). Nesta parte, as linhagens mutantes que mostraram perfis de acúmulo de glicogênio diferente da linhagem selvagem, nas condições avaliadas foram selecionadas. Posteriormente, foram realizadas quantificações de atividade da enzima glicogênio sintase de N. crassa (GSN), sob as mesmas condições experimentais, na presença e ausência do modulador alostérico glicose-6-fosfato (G6P). Foi verificado que a enzima GSN presente em algumas linhagens mutantes provavelmente estaria diferentemente fosforilada, quando comparada à proteína presente na linhagem selvagem. Por este motivo, uma análise das diferentes isoformas de fosforilação foi realizada em algumas das linhagens mutantes combinando os ensaios 2D-PAGE e Western blot. Através destas análises foi possível verificar quais proteínas quinases estão envolvidas no controle do metabolismo do glicogênio e que atuam mais especificamente na regulação por fosforilação da enzima GSN. Das 55 linhagens inicialmente utilizadas, 6 linhagens apresentaram diferenças no acúmulo de glicogênio, na atividade GSN e no estado de fosforilação da enzima GSN, quando comparadas com a selvagem. Portanto, caracterizam proteínas... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: In this work, a collection of N. crassa strains mutated in genes encoding protein kinases was used to identify proteins involved in the control of glycogen metabolism in this fungus. These proteins were annotated as belonging to different classes of protein kinases due to their kinase domains. Initially, we identified the proteins involved in the metabolism control by quantifying the glycogen accumulated under vegetative growth (30 °C) and under a stress condition such as heat stress (45 °C). The mutant strains showing glycogen accumulation profiles different from the wild-type strain under the conditions evaluated were selected. The selected mutant strains were used to quantify glycogen synthase activity (GSN), under the same experimental conditions, in the presence and absence of the allosteric modulator glucose-6-phosphate (G6P). From this assays, it was observed that GSN in some mutant strains would be differently phosphorylated when compared to the enzyme present in the wild-type strain. Therefore, an analysis of the GSN phosphorylation isoforms was performed in such mutant strains by combining 2D-PAGE and Western blot. Through these analysis, it was possible to identify which protein kinases are involved in the control of glycogen metabolism and specifically act in the GSN phosphorylation. Of the 55 strains initially used six strains showed differences in the glycogen accumulation, in the GSN activity, and in the state of GSN phosphorylation, compared to the wild-type strain. Therefore, they characterize putative protein kinases that regulate glycogen metabolism by regulating the GSN enzyme. The strain knocked-out in the ORF encoding the protein PHO85-like (a cyclin-dependent protein kinase) showed differences in the glycogen content, increased -/+ G6P ratio, and changes in the GSN phosphorylation... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

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Acanthamoeba é uma ameba de vida livre, capaz de causar raras e graves infecções oportunistas em olhos, pele e sistema nervoso de humanos e animais. É um protozoário ubiquitário e frequentemente isolado do ambiente. Pode infectar humanos através do uso de lentes de contato, cortes ou feridas na pele assim como ser inalada e conduzida aos pulmões. Possui duas formas em seu ciclo de vida: trofozoíto móvel e infectiva capaz de causar ceratite assim como uma fatal encefalite e de cisto resistente ao ambiente e ao ataque do sistema imune, facilitando a ocorrência da infecção. Existem vários fatores que contribuem na patogênese de Acanthamoeba, sendo a proteína de união à Manose (MBP) a única proteína de superfície descrita como principal fator de patogenicidade. Não existem trabalhos sobre o papel funcional ou patogênico de outras proteínas de superfície que poderiam ser relevantes na invasão ou infecção do hospedeiro por esta ameba. O objetivo geral deste estudo é identificar e analisar uma proteína de superfície de Acanthamoeba castellanii e avaliar seu potencial para utilização em diagnóstico da ceratite amebiana ou encefalite granulomatosa. Predições in silico deste estudo demostram que a calreticulina é uma proteína de superfície. A clonagem da sequência codificadora da calreticulina por recombinação homóloga in vivo foi realizada no vetor pGEX4T1 para permitir a expressão em Escherichia coli BL21 pLysE da proteína recombinante em fusão com a Glutariona-STransferase nas condições de 14°C por 16 horas tendo um rendimento final de 3,64 mg/L de proteína purificada. O potencial imunodiagnóstico foi avaliado através de ELISA usando soros de pacientes com encefalite e soros de rato com ceratite e encefalite testando como antígeno a proteína recombinante. A proteína foi reconhecida pelos soros de pacientes infectados e saudáveis, diferentemente dos soros de ratos, em que só foi reconhecida pelos ratos infectados. Estes resultados preliminares apontam que a proteína calreticulina de A. castellanii poderia ser um candidato para imunodiagnóstico das doenças causadas pelo protozoário em ratos; no caso dos resultados em pacientes humanos ainda são necessárias maiores investigações. / Acanthamoeba is a microscopic free-living amoeba able to cause rare and serious opportunistic infections in eyes, skin and nervous system in humans and animals. It’s one of the most common protist widely distributed and it has been isolated from the environment, including water and soil. The amoeba can infect contact-lenses wearers through skin lesions or via the nasal route. Acanthamoeba exists in two distinct forms: an active-infective trophozoite form during which Acanthamoeba reproduces being capable of cause Acanthamoeba keratitis and a fatal granulomatous amoebic encephalitis, and a dormant cyst form resistant to immune system defense making easier the recurrence of these infections. Several factors contribute with the pathogenesis of Acanthamoeba. The mannose bindingprotein (MBP) is the only surface protein as a main pathogenicity factor in Acanthamoeba; however, there are no evidence of any scientific work that describes the functional nor pathogenic role of another surface protein that could be relevant in the host-parasite invasion or infection by this amoeba. The general objective of this study is identify and analyze an Acanthamoeba castellanii surface protein and test its potential for use in diagnosis of amoebic keratitis or granulomatous encephalitis. In silico predictions showed that, A. castellanii calreticulin is a surface protein. In vivo homologous recombination cloning of the coding sequence was performed using the pGEX4T1 vector for expressing the GST fusion recombinant protein using an Escherichia coli BL21 pLysE strain at 14°C for 16 hours obtaining a final efficiency of 3,64 mg/L of purified protein. The immunodiagnostic potential was tested with specific antibody responses in serum from patients with encephalitis and infected rats with keratitis and encephalitis against recombinant calreticulin by ELISA. The protein was recognized by both infected and healthy patients serum, whereas the infected rat serum was the only recognized by the recombinant protein. These results would conclude that A. castellanii calreticulin probably could be an immunodiagnostic prospect of Acanthamoeba diseases in animals but in human further immunoassays are required.