Orientadores: Sonia Maria Alves Bueno, Karsten Haupt / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia Quimica / Made available in DSpace on 2018-08-04T01:50:32Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Aquino_LucianaCristinaLinsde_D.pdf: 4837865 bytes, checksum: fcfed5fb5704a94ca51db595e4097e0f (MD5) Previous issue date: 2004 / Resumo: A cromatografia de afinidade com íons metálicos imobilizados (IMAC) tem sido uma técnica bastante utilizada para a purificação de proteínas recombinantes que possuem uma cauda de polihistidina acoplada na porção N ou C-terminal. Como alternativa aos géis de agarose (tradicionalmente empregados em IMAC) tem sido proposto o emprego de membranas, cuja vantagem principal é a transferência de massa ser governada principalmente por convecção. Este trabalho investigou o potencial de membranas de fibras ocas de álcool poli( etileno )vinílico (pEV A) com íons metálicos imobilizados para a purificação de pró-insulina recombinante com cauda de poli(histidina) (PIS) a partir de soluções não clarificada (PIS-NC) (obtida após solubilização dos corpos de inclusão e sulfitólise) e clarificada (PIS-C) (obtida após a centrifugação da solução não clarificada). Com este objetivo, experimentos de adsorção foram realizados com fibras finamente cortadas e em módulo de filtração. Inicialmente as membranas de PEV A cortadas foram ativadas e o agente quelante ácido iminodiacético (IDA) foi imobilizado, sendo estas membranas modificadas denominadas PEV A-IDA. A seguir, dentre as membranas PEV AIDA-Me2+ (Me2+ equivalente aos íons CU2+, Ni2+, Zn2+ ou Co2+), PEV A-IDA-Ni2+ e PEV AIDA-CU2+ foram as que apresentaram melhor eficiência para adsorção de pró-insulina (90 e 97% do total de proteína alimentada, respectivamente), sendo então selecionadas para a purificação de PIS a partir das soluções PIS-NC e PIS-C. As membranas PEV A-IDA-Ni2+ apresentaram melhor seletividade e capacidade de adsorção de PIS a partir de PIS-C e PISNC (29 e 26% de PIS adsorvida, respectivamente) do que as membranas PEV A-IDA-Cu2+ (7 e 0% de PIS adsorvida, respectivamente), sendo este adsorvente selecionado para a continuação do trabalho. A adsorção de PIS nas membranas cortadas foi avaliada através da cinética e isoterma de adsorção utilizando, respectivamente, a expressão da taxa de variação da concentração de proteína na fase líquida com o tempo e o modelo de Langmuir. A seguir, foi construído, um módulo de filtração, no qual as membranas foram ativadas e IDA foi imobilizado (protocolos equivalentes aos utilizados para as fibras cortadas). Através de experimentos de filtração, determinou-se curvas de ruptura e a capacidade dinâmica para a adsorção de PIS a partir das soluções PIS-NC e PIS-C. As capacidades de adsorção de próinsulina das fibras cortadas, módulo de filtração e gel foram comparadas. As membranas PEV A-IDA-Ni2+ cortadas e o módulo de filtração apresentaram menor capacidade de adsorção de PIS (4,0 e 4,62 mg/g seca, respectivamente) do que o gel Sepharose-IDA-Ni2+ (12,26 mg/g seco). Visando melhorar o desempenho das membranas de PEV A, estas foram ativadas e um método de polimerização foi utilizado para a imobilização do ligante ácido vinilbenziliminodiacético (VBIDA) nas membranas, sendo após este procedimento, denominadas PEV A-VBIDA As membranas PEV A-VBIDA-Ni2+, apesar de maior densidade de ligantes (148 J.1II1o1 de Ni2+/g seca), demonstraram capacidades de adsorção de PIS de 2,4 e 8,0 vezes menores, quai:1do alimentadas com, respectivamente, soluções PIS-C e PIS-NC, do que PEV A-IDA-Ni2+ (37 !lmol de Ne+/g seca). Contudo, apesar das membranas terem apresentado menor capacidade de adsorção de PIS em relação ao gel, a possibilidade de processar soluções contendo material particulado sem a necessidade de prévia clarificação, tomam este suporte vantajoso para a purificação de proteínas / Abstract: The Immobilized metal ion affinity ehromatography (IMAC) is a teehnique that has been used for the purifieation of reeombinant proteins that have a polyhistidine tag eoupled at the N or C-terminal portion. The use of membranes has been proposed as an altemative to the agarose gels traditionally employed in IMAC. The main advantange of membranes systems is that the mass transfer is mainly govemed by conveetion. In this work, we investigated the potential ofpoly(ethylene) vinyl aleohol (pEV A) hollow fibers membranes eontaining immobilized metal ions for the purifieation of reeombinant His-tag human proinsulin (PIS) from non-clarified (PIS-NC) (obtained afier inc1usion body solubilization and sulfonation reaetion) and clarified (PIS-C) (obtained afier eentrifugation of non clarified solution) solutions. Adsorption experiments were earried out using fixed bed (finelly eut fibers) eomposed of eolumn and filtration module. In the first part ofthis work, fixed bed experiments aimed to seleet a metal ion of high effieieney in adsorbing the proinsulin in terms of eapaeity, selectivity and kineties. Initially, finely eut PEV A hollow fiber membranes were aetivated and then iminodíaeetie aeid (IDA) was immobilized on them. These modífied membranes were named PEV A-IDA Then, among PEV A-IDA-Me2+ membranes (pEV A-IDA onto whieh different metal íons - CU2+, Ni2+, Zn2+ or C02+- were immobilized), PEV A-IDA-Ni2+ and PEV A-IDA-CU2+ showed higher effieieney for proinsulin adsorption (90 and 97% of total fed protein, respectively), and they were seleeted for PIS purification from PIS-NC and PIS-C solutions. The PEV A-IDA-Ni2+ membranes presented better PIS seleetivity and adsorption capaeity for the PIS-C and PISNC solutions (29 and 26% ofPIS adsorbed, respectively) than PEV A-IDA-CU2+ (7 and 0% ofPIS adsorbed, respeetively). In the seeond part ofthis work a filtration module was built, and their membranes were aetivated and IDA and the Ni2+ íon were immobílized using similar protoeols used for eut membranes. The breakthrough curves and the dynamie eapaeity of this module for the PIS adsorption from PIS-NC and PIS-C solutions were determined. The PIS adsorption eapaeities using eut fibers, filtration module and Sepharose-IDA-Ni2+ were compared. The PEV A-IDA-Ni2+ finely eut membranes and the filtration module presented lower adsorption eapaeity (4.00 and 4.62 mg/g dry, respectively) than Sepharose-IDA-Ni2+ (12.26 mg/g dry). Aimíng to improve the perfonnance of PEV A membranes, they were activated and the iminodiacetic vinylbenzyl acid (VBIDA) was immobilized to them. After this procedure the membranes were named PEV A-VBIDA. The PEV A-VBIDA-Ni2+ membranes, in spite of the high ligand density (148 _mol of Ni2+/g dry), demonstrated lower adsorption capacities for proinsulin when PIS-C and PIS-NC solutions were used as feed (2.4 and 8.0-fold, respectively) than those obtained in PEV A-IDA-Ni2+ (37 _mol of Ni2+/g dry). However, even through PEV A membranes presented a lower PIS adsorption capacity than Sepharose gel, the possibility of processing solutions containing particulate material without prior clarification, makes this support advantageous for protein purification / Doutorado / Desenvolvimento de Processos Biotecnologicos / Doutor em Engenharia Química

Orientador: Raghuvir Krishnaswamy Arni / Banca: Patrick Spencer / Banca: Jose Ramon Beltran Abrego / Resumo: Os venenos de serpentes são constituídos por uma complexa mistura de substâncias que apresentam características e proporções variáveis de acordo com as diferentes espécies, distribuição geográfica dos indivíduos, variação ontogenética e sexual e alimentação. Essa variabilidade na composição dos venenos é de grande interesse na pesquisa e desenvolvimento de novos fármacos, pois um elevado grau de variação aumenta o número de seus potenciais usos. De acordo com essas propriedades dos venenos de serpentes, no presente estudo procurou-se comparar algumas variações existentes nas frações do veneno de Bothrops leucurus, uma serpente da família Viperidae que se caracteriza por produzir um veneno com toxicidade variável devido a diferentes fatores. A toxicidade do veneno deve-se principalmente à sua fração proteica, constituída em sua maior parte por proteinases (metalo proteinases e serino proteinases), fosfolipases e L-aminoácido oxidases que apresentam efeitos potenciais no sistema homeostático, além de possuírem ação citotóxica, antimicrobiana e inflamatória. Neste estudo foram realizados ensaios cromatográficos para a purificação de algumas dessas enzimas e a caracterização das mesmas para a verificação de suas propriedades proteolíticas e fibrinogenolíticas, além do potencial antimicrobiano do veneno bruto. Foram purificadas duas metalo proteinases de 28 e 65 kDa, respectivamente, uma serino protease de 35 kDa, uma LAAO de 66 kDa e duas fosfolipases com 14 e 15kDa. Constatou-se que a metalo protease de 65 kDa apresentou a maior atividade fibrinogenolítica. Além disso, foi realizado o teste da mínima concentração inibitória com o veneno bruto para verificar seu efeito antimicrobiano contra uma bactéria gram-negativa e outra gram-positiva, sendo que nesta última, apresentou atividade inibitória / Abstract: The snake's venoms are constituted by a mixture of substances that exhibit character and variable proportion according to different species, geographic distribution of individuals, ontogenetic and sexual and feed variability. That variability on poisons compositions is of great interest on research and development of new drugs, because a high degree of variation increases the number of potential use. According to those properties of snake's poisons in the actual study it was sought to compare some variations existents on fractions of Bothrops leucurus venom, a snake of family Viperidae that is characterized by production of poison with variable toxicity due different factors. The poison toxicity should principally its protein fraction consisting mostly by proteinases (metalloproteinases and serine protease), phospholipases and L-aminoacid oxidases showing potential effects on homeostatic system, beyond having cytotoxic action, bactericidal and inflammatory. This study describe chromatographic separation of some enzymes and characterization of it and to verification of its proteolytic and fibrinogenolytic properties further the bactericidal potential of crude venom. Was purified two metalloproteinases of 28 and 65 kDa respectively, a serine protease of 35 kDa, a LAAO of 66 kDa and two phospholipases of 14 and 15kDa. It was found metalloproteinase of 65 kDa show a higher fibrinogenolytic activity. Futhermore crude venom was carried out the test of minimum inhibitory concentration with crude venom to check its antimicrobial effect against a gram-negative bacterium and other gram-positive, whereas in the latter showed inhibitory effect / Mestre

Made available in DSpace on 2016-06-02T20:21:34Z (GMT). No. of bitstreams: 1 DissJUR.pdf: 1290933 bytes, checksum: 72ad2925663cff469dc6dc50316dbf22 (MD5) Previous issue date: 2005-02-17 / Universidade Federal de Minas Gerais / Disintegrins are snake venom proteins used in the study of integrin-mediated cellular adhesion through integrins. Recombinant disintegrin production may notable supply faster, larger and most homogeneous protein samples than bruit venom processing. This work describes optimization of the recombinant ACLD-C expression technique. ACLD-C is a disintegrin-like protein from Agkistrodon contortrix laticinctus, that have a disintegrin-like domain with DCD motif, and a cysteine-rich domain. This protein was subcloned from the ACLD clone (GenBank U86634), a metallopeptidase. A protocol of expression was established in our laboratory, where recombinant ACLD-C is produced in E. coli, using the expression vector pMal-p. This allows protein target expression in form of N-terminal fusion with MBP (maltose-binding protein), that facilitate purification, correct folding and production of disintegrin in soluble form. In fact, MBP/ACLD-C was was expressed in soluble form and purified in two stages: affinity comatography in amilose resin and cromatography of gel-filtration in superdex-200 resin. Modifications in expression protocol optimized MBP/ACLD-C expression in culture of 0,4 mg/L of culture of 1,2 mg/L (12,6% total of protein in periplasmic space of E.coli). MBP/ACLD-C imobilizated in amilose resin was subjected to digestion with enzyme factor Xa to separate ACLD-C of MBP. The separation was confirmed through positive reaction with anti-ALT-C antibody. ALT-C is a disintegrin-like protein from Bothrops alternatus. ALT-C induced both expression of VEGF in human fibroblasts and proliferation of endothelial cells and angiogenesis. In second part of this work, we investigated if MBP/ACLD-C was also able to induce the expression of this growth factor in this cells. MBP/ACLD-C and two other disintegrins, echistatina, a disintegrin-RGD, and EC6, a heterodimeric disintegrin, were incubated with fibroblasts. The influency of these proteins in VEGF expression was evaluated by ELISA. MBP/ACLD-C was able to strongly induce the expression of VEGF until 4 hours, when the level decreased until 24 hours. Experiment in period of 24 48 hours was not done due to problems of contaminations. Echistatin did not induced VEGF expression, but induced fibroblasts dettachment from plastic. The latter event was not observed in MBP/ACLD-C or EC6 incubated cells. / As desintegrinas são proteínas de veneno de serpente usadas no estudo de processos biológicos envolvendo a adesão celular mediada por integrinas. A produção de desintegrinas recombinantes é de grande importância para tais estudos, pois podem ser obtidas de forma mais rápida, com maior rendimento e qualidade mais constante quando comparada com a obtenção a partir de veneno bruto. Esta dissertação descreve a otimização da expressão da ACLD-C recombinante. ACLD-C é uma proteína tipo desintegrina da serpente Agkistrodon contortrix laticinctus, que possui um domínio desintegrina-like com um motivo DCD e um domínio rico em cisteína. Esta proteína foi subclonada a partir do clone da ACLD (GenBank U86634), uma metalopeptidase. Um protocolo de expressão foi estabelecido em nosso laboratório, onde ACLD-C recombinante é produzida em E. coli, utilizando-se o vetor de expressão pMal-p. Este vetor possibilita a expressão da proteína-alvo na forma de fusão Nterminal com a proteína MBP (maltose-binding protein), a qual facilita a purificação, o enovelamento correto e a produção da desintegrina na forma solúvel. De fato, MBP/ACLD-C foi expressa na forma solúvel e purificada em duas etapas: cromatografia de afinidade em resina de amilose e cromatografia de gel-filtração em resina superdex-200. Modificações no protocolo de expressão permitiram a otimização da expressão da MBP/ACLD-C de 0,4mg/L de cultura para 1,2mg/L de cultura O rendimento final da MBP/ACLD-C foi de 1,2mg/L de cultura (12,6% do total de proteínas no espaço periplásmico de E. coli). MBP/ACLD-C imobilizada em resina de amilose foi submetida à reação de clivagem com a enzima fator Xa para separar ACLD-C da MBP. A separação foi confirmada através da reação positiva ao anticorpo anti-ALT-C, uma desintegrina-like de Bothrops alternatus. Estudos com ALT-C mostraram que ela foi capaz de induzir a expressão de VEGF (vascular endothelial growth factor) em fibroblastos humanos e induzir a proliferação de células endoteliais e a angiogênese. Assim, resolveu-se investigar se MBP/ACLD-C também é capaz de induzir a expressão deste fator de crescimento nestas células, o que constitui a segunda parte deste trabalho. MBP/ACLD-C e outras duas desintegrinas, echistatina, uma desintegrina-RGD, e EC6, uma desintegrina heterodimérica, foram incubadas com os fibroblastos para verificar a influência dessas proteínas na expressão de VEGF através de ensaios de ELISA. MBP/ACLD-C foi capaz de induzir fortemente a expressão de VEGF até 4h, quando o nível da citocina decresceu até 24 e novamente aumentou até 48h. EC6 também foi capaz de induzir a expressão do fator de crescimento até 4h, quando o nível também decresceu até 24h. O experimento no período de 24h-48h não foi realizado devido a problemas de contaminação. Echistatina, por sua vez, não apresentou indução de VEGF em relação ao controle, e as células incubadas com essa desintegrina desaderiram do plástico, o que não ocorreu com as outras duas proteínas.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:27:21Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2013-03-22Bitstream added on 2014-06-13T20:16:36Z : No. of bitstreams: 1 wilson_c_me_sjrp.pdf: 535059 bytes, checksum: 514dc7e27d5f6dc577b4bea8fe8ef6de (MD5) / Os venenos de serpentes são constituídos por uma complexa mistura de substâncias que apresentam características e proporções variáveis de acordo com as diferentes espécies, distribuição geográfica dos indivíduos, variação ontogenética e sexual e alimentação. Essa variabilidade na composição dos venenos é de grande interesse na pesquisa e desenvolvimento de novos fármacos, pois um elevado grau de variação aumenta o número de seus potenciais usos. De acordo com essas propriedades dos venenos de serpentes, no presente estudo procurou-se comparar algumas variações existentes nas frações do veneno de Bothrops leucurus, uma serpente da família Viperidae que se caracteriza por produzir um veneno com toxicidade variável devido a diferentes fatores. A toxicidade do veneno deve-se principalmente à sua fração proteica, constituída em sua maior parte por proteinases (metalo proteinases e serino proteinases), fosfolipases e L-aminoácido oxidases que apresentam efeitos potenciais no sistema homeostático, além de possuírem ação citotóxica, antimicrobiana e inflamatória. Neste estudo foram realizados ensaios cromatográficos para a purificação de algumas dessas enzimas e a caracterização das mesmas para a verificação de suas propriedades proteolíticas e fibrinogenolíticas, além do potencial antimicrobiano do veneno bruto. Foram purificadas duas metalo proteinases de 28 e 65 kDa, respectivamente, uma serino protease de 35 kDa, uma LAAO de 66 kDa e duas fosfolipases com 14 e 15kDa. Constatou-se que a metalo protease de 65 kDa apresentou a maior atividade fibrinogenolítica. Além disso, foi realizado o teste da mínima concentração inibitória com o veneno bruto para verificar seu efeito antimicrobiano contra uma bactéria gram-negativa e outra gram-positiva, sendo que nesta última, apresentou atividade inibitória / The snake’s venoms are constituted by a mixture of substances that exhibit character and variable proportion according to different species, geographic distribution of individuals, ontogenetic and sexual and feed variability. That variability on poisons compositions is of great interest on research and development of new drugs, because a high degree of variation increases the number of potential use. According to those properties of snake’s poisons in the actual study it was sought to compare some variations existents on fractions of Bothrops leucurus venom, a snake of family Viperidae that is characterized by production of poison with variable toxicity due different factors. The poison toxicity should principally its protein fraction consisting mostly by proteinases (metalloproteinases and serine protease), phospholipases and L-aminoacid oxidases showing potential effects on homeostatic system, beyond having cytotoxic action, bactericidal and inflammatory. This study describe chromatographic separation of some enzymes and characterization of it and to verification of its proteolytic and fibrinogenolytic properties further the bactericidal potential of crude venom. Was purified two metalloproteinases of 28 and 65 kDa respectively, a serine protease of 35 kDa, a LAAO of 66 kDa and two phospholipases of 14 and 15kDa. It was found metalloproteinase of 65 kDa show a higher fibrinogenolytic activity. Futhermore crude venom was carried out the test of minimum inhibitory concentration with crude venom to check its antimicrobial effect against a gram-negative bacterium and other gram-positive, whereas in the latter showed inhibitory effect

Orientador: Cesar Costapinto Santana / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia Quimica / Made available in DSpace on 2018-07-27T02:38:10Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Veredas_Vinicius_M.pdf: 4752847 bytes, checksum: f01c509a2798835914e0489d2f75baac (MD5) Previous issue date: 2000 / Resumo: O crescente interesse e aplicações dos produtos biotecnológicos vem aumentando o desenvolvimento de novos processos de recuperação e purificação de proteínas. O soro de leite bovino, obtido da manufatura da caseína para a produção de queijo, é em sua maioria descartado em mananciais de água, causando sérios problemas ambientais devido a sua alta demanda biológica de oxigênio (DBO). As proteínas presentes no lactosoro apresentam um excelente valor nutritivo e farmacológico, porém, o seu uso no enriquecimento de produtos alimentícios é limitado devido a baixa concentração destas proteínas. As principais proteínas do lactosoro são: ~-Iactoglobulinas, a-Iactalbumina, albuminas de soro bovino, imunoglobulinas, lactoperoxidase, lactoferrina, lisozima e outras proteínas de menor proporção, que apresentam um alto valor agregado. A a-Iactalbumina atua no organismo estimulando os agentes do sistema imunológico por proporcionar a elevação de glutationa em vários órgãos e no sangue, resultando em benefícios para pacientes portadores de doenças degenerativas como os males de Parkinson e Alzheimer, câncer e AIDS. Neste trabalho foi estudado o processo de separação da a-Iactalbumina, através de técnicas cromatográficas empregando a metodologia de leito fixo e expandido. O leito expandido possibilita a redução nos custos do processo de purificação, eliminando etapas de separação necessárias quando o extrato apresenta material em suspensão, que é o caso dos lactosoros. Nos ensaios realizados foram estudados as melhores condições de adsorção da a-Iactalbumina visando a sua purificação empregando adsorventes de troca iônica e de interação hidrofóbica. Também foram realizados ensaios em sistemas de tanque agitados para a determinação das isotermas e cinéticas de adsorção. Neste trabalho obteve-se a a-Iactalbumina com uma pureza acima de 80% e apresentando um fator de purificação de 5 vezes utilizando as resinas de interação hidrofóbica com única etapa de purificação / Abstract: The interest and applications of biotechnology products has been increasing the development of new recovery and purification processes for proteins. The bovine milk serum, obtained from casein manufacture for cheese production, is mostly rejected into watercourse, causing problems to the environment due to its high biological oxygen demand (BOD). The proteins of milk serum have excellent nutritious and pharmaceutical value, h oweve r, its application for protein enrichment of food products is limited due to its low content in the milk serum. The main proteins of milk serum are: ~-Iactoglobulins, a-Iactalbumine, bovine serum albumine, immunoglobulins, lactoperoxidase, lactoferrin, lisozime and other lower content proteins which have a high aggregate value. The a-Iactalbumine acts in the human organism by stimulating the agents of the immunologycal system due to increasing on glutathione levei in several organs and blood, resulting in benefits for patients of some diseases like Parkinson and Alzheimer's iII, cancer and AIDS. It was studied in this work the separation processes of a-Iactalbumine, by chromatographic techniques making use of fixed and expanded bed methods. The expanded bed enables cost reduction on purification process by reducing separation steps used for removing suspended solids, as in case of milk serum extracts. In our experiments were studied the adsorption conditions of alactalbumine aiming at its purification by using ionic exchange and hydrophobic interaction adsorbents. Other experiments were accomplished at stirred tank systems for the determination of isotherms and adsorption kinetics. It was obtained, in this work, an a-Iactalbumine purity higher than 80%, with a five fold purification factor by using the hydrophobic interaction resins in a single purification ste / Mestrado / Desenvolvimento de Processos Biotecnologicos / Mestre em Engenharia Química

Orientador: Sonia Maria Alves Bueno / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia Química / Made available in DSpace on 2018-08-09T16:21:01Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Silva_PaulaTimoteoda_D.pdf: 1311022 bytes, checksum: 1652a409f13e2bb4e1a18a9dcb28d2fa (MD5) Previous issue date: 2007 / Resumo: Raiva ou hidrofobia é uma infecção viral que atinge o sistema nervoso central, ocorrendo em animais e humanos. As proteínas principais encontradas no vírus da raiva que atuam ativando o sistema imune são a nucleoproteína N (NPV) e a glicoproteína G, uma proteína transmembrana que forma o envelope viral e induz a produção de anticorpos neutralizantes que protegem contra o ataque viral. Este trabalho visou a purificação da glicoproteína G do vírus da raiva com cauda de polihistidina (GPV) a partir do lisado e do sobrenadante da cultura de células de inseto Drosophila melanogaster Schneider 2 (S2AcGPV2), transfectadas com o vetor pAc 5.1/V5-His A contendo o gene da GPV, empregando cromatografia de afinidade por íons metálicos imobilizados (IMAC). Os aspectos abordados neste trabalho foram a derivatização do gel de agarose com o agente quelante ácido iminodiacético (agarose-IDA) e a avaliação da seletividade, capacidade e reprodutibilidade do gel de agarose-IDA-Ni2+ na adsorção da GPV em função de diferentes sistemas tamponantes e de diferentes estratégias de dessorção de GPV (abaixamento de pH ou aumento da concentração de agente competitivo). A seletividade em cada sistema tamponante foi determinada por eletroforese SDSPAGE das frações dos picos de proteína obtidos nas cromatografias e a quantificação de GPV presente nas frações cromatográficas foi realizada através de ensaios do tipo ELISA. A melhor condição utilizada para a purificação da glicoproteína G foi a alimentação de lisado de células em coluna contendo agarose-IDA-Ni2+ equilibrada com tampão fosfato de sódio 20 mM, cloreto de sódio 500 mM, imidazol 2 mM pH 7,0. A lavagem foi realizada com tampão fosfato de sódio 20 mM, cloreto de sódio 500 mM, imidazol 2 mM pH 6,0 e a eluição por aumento de concentração de imidazol para 200 e 500 mM. Os resultados demonstraram a potencialidade de utilização do método de IMAC para a purificação da glicoproteína G do vírus da raiva / Abstract: Rabies or hydrophobia is a viral infection that affects the central nervous system, occuring in animals and humans. The main proteins found in rabies virus that activates the immunological system are the N nucleoprotein (NPV) and the G glycoprotein, a transmembrane protein that forms the spikes of the virus and induces virus-neutralizing antibodies that protect against infection. This research aimed at the purification of the rabies virus glycoprotein containing a polyhistidine tag (GPV) from lisate and supernatant of Drosophila melanogaster Schneider 2 (S2AcGPV2) cells culture, transfected with the vector pAc 5.1/V5-His A containing the GPV gene, using immobilized metal íon affinity chromatography (IMAC). The aspects developed in this project were the agarose gel derivatization with the chelating agent iminodiacetic acid (IDA) and the evaluation of the agarose-IDA-Ni2+ gel seletivity, capacity and reproductibility at the GPV adsorption, regarding different buffer systems and different GPV's desorption strategies (lowering the pH of the buffer or increasing the concentration of a competitive agent in the buffer). The seletivity in each buffer system was determined by performing SDS-PAGE electrophoresis on the chromatographic samples with the larger concentration of proteins, and the GPV quantification in these samples was determined by ELISA assays. The best results of purification were found when lisate was fed into an agarose-IDA-Ni2+ column equilibrated with 20 mM sodium phosphate buffer containing 500 mM sodium chloride and 2 mM imidazole pH 7,0. The washing step was proceeded with 20 mM sodium phosphate buffer containing 500 mM sodium chloride and 2 mM imidazole pH 6,0 and the elution proceeded by raising the imidazole concentration at the wash buffer to 200 e 500 mM. The results demonstrated the potencial of using IMAC to purify rabies virus G glycoprotein / Doutorado / Desenvolvimento de Processos Biotecnologicos / Mestre em Engenharia Química

Orientador: Elias Basile Tambourgi / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia Quimica / Made available in DSpace on 2018-08-15T00:12:34Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Elias_MoacyrJorge_D.pdf: 3281919 bytes, checksum: a06d734eab8439e1da9e683c7b3eb667 (MD5) Previous issue date: 2010 / Resumo: A bromelina, enzima presente no abacaxi, hidrolisa ligações peptídicas das proteínas; tem aplicação em diversas áreas envolvendo alimentos, medicina e nutrição animal. No abacaxi a bromelina está presente no talo, na polpa e na casca do fruto. Visando avaliar a bromelina presente no fruto brasileiro Ananás comosus L. Merril, variedade pérola, enfocando seu aproveitamento quando recuperada a partir dos resíduos da industrialização, foram pesquisadas, em comparação com a bromelina pura, condições de pH e temperatura para maior atividade, estabilidade térmica ao longo do tempo em várias temperaturas e a cinética da sua atividade catalítica, empregando caseína como substrato. O extrato foi obtido pela trituração da casca e do talo interno do fruto e a reação de hidrólise, com pH controlado, efetuada em reator com 75 mL de volume útil sob constante agitação. Após a reação foi retirada amostra, adicionada em tubo contendo ácido tricloroacético e centrifugado, analisando a absorbância do sobrenadante. Atividade e a cinética foram expressas em mmol tirosina / L.minuto pela absorbância a 280 nm dos aminoácidos aromáticos gerados na hidrólise da caseína. Foram empregadas três relações enzima / substrato (em massa): 1 / 25, 1 / 50 e 1 / 125 para os ensaios relativos ao planejamento experimental em estrela tendo como ponto central pH em 7,0 e temperatura de 35 °C, os resultados foram tratados fornecendo as equações do modelo e as superfícies de resposta; as equações foram tratadas matematicamente fornecendo gráficos da melhor atividade em função da temperatura; os resultados do planejamento experimental mostraram similaridade entre a bromelina dos resíduos do fruto e a bromelina pura tomada como padrão. Para a estabilidade térmica os ensaios foram efetuados determinando a atividade para a relação 1 / 25 sob temperaturas variando entre 25 °C e 62 °C ao longo de 180 minutos com duas faixas de pH: a de melhor atividade definida no planejamento experimental (5,5 a 6,5) e entre 3,3 e 3,5; os resultados foram tratados analisando o gráfico da atividade em função do tempo mostrando que o modelo de ordem um é adequado para descrever a inativação térmica da enzima e que ela ocorre de maneira mais acentuada na faixa de pH 3,3 a 3,5 com valor do fator de freqüência k0 (minuto-1) 2,5 x1032 vezes maior para o extrato. Os ensaios para determinar a cinética da atividade catalítica da bromelina sobre a caseína foram efetuados a temperatura constante de 35 °C e pH de máxima atividade definido no planejamento experimental para cada uma das três relações enzima / substrato estudadas; foram elaboradas as curvas da concentração de aminoácidos formados ao longo do tempo (zero a 15 minutos) e os resultados tratados calculando a derivada das curvas no tempo zero (velocidade inicial); o modelo de Michaelis - Menten mostrou ser adequado para descrever o mecanismo de hidrólise da caseína pela bromelina e os resultados indicam que os valores da velocidade máxima (Vmax) e da constante de Michaelis (Km) são maiores para o extrato dos resíduos do fruto do que para a bromelina pura. / Abstract: The bromelain, enzyme found in pineapple, hydrolyses peptide protein bonds; there is application in several areas involving food, medicine and animal nutrition. In pineapple the bromelain is present in the flesh, skin and core of the fruit. Aiming to evaluate the bromelain present in Brazilian fruit Ananas comosus L. Merril, pérola type, focusing its use from industrialization residues recovering, it was searched, comparing with pure bromelain, pH conditions and temperature for higher activity, thermal stability along the time under several temperatures and the kinetics of its catalytic activity, using casein as a substrate. The extract was obtained crushing the skin and core of the fruit and the hydrolysis reaction, with controlled pH, done in a 75 mL net volume reactor under constant stirring. After reaction a sample was taken, added to a tube with tri chloroacetic acid and centrifuged, analyzing the supernatant absorbance. Activity and kinetics were expressed as mmol of tyrosine / L.min from absorbance at 280 nm of aromatic amino acids generated by casein hydrolysis. Three enzyme / substrate ratio were employed (weight basis):1 / 25, 1 / 50 and 1 / 125 for star type experimental design assays with central point at 7.0 for pH and at 35 °C for temperature, the results were processed giving the model equation and surface responses, the equations were mathematically treated giving graphics of best activity as a function of temperature; the experimental design results showed similarity between bromelain from fruit residues and pure bromelain taken as reference. The assays for thermal stability were carried out by activity determination for 1 / 25 ratio under temperatures varying from 25 °C and 62 °C during 180 minutes for two pH ranges: that for best activity defined from experimental design (5.5 to 6.5) and between 3.3 to 3.5; the results were treated by the analysis of the graphics of activity as a function of time showing that the order one model is adequate to describe the enzyme thermal inactivation and that it is stronger at pH range of 3.3 to 3.5 with values of frequency factor k0 (minute-1) 2.5 x1032 times bigger for the extract.The assays to determine the kinetics of bromelain catalytic activity on casein were carried out at constant temperature of 35 °C and pH of maximum activity defined by experimental design for each one of the three studied enzyme / substrate ratio; curves were built for the concentration of formed amino acids along the time (from zero to 15 minutes) and the results treated calculating the curves derivative at time zero (initial rate); the Michaelis - Menten model showed to be adequate to describe the casein hydrolysis mechanism of casein by bromelain and the results indicate that the maximum reaction rate (Vmax) values and the Michaelis constant (Km) values are bigger for the fruit residues extract than that for pure bromelain. / Doutorado / Sistemas de Processos Quimicos e Informatica / Doutor em Engenharia Química

Orientador: Elias Basile Tambourgi / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia Quimica / Made available in DSpace on 2018-08-15T00:05:27Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Barros_KleberVanioGomes_M.pdf: 726082 bytes, checksum: f7ee21d9c4e2a18b7c38d3e3a1baccd2 (MD5) Previous issue date: 2009 / Resumo: O curauá (Ananas erectifolius) é uma planta fibrosa proveniente da Amazônia brasileira, pertencente à família Bromeliaceae e ao gênero Ananas. A bromelina é uma protease de origem vegetal, obtida de diversas espécies da família Bromeliaceae. A bromelina tem utilização bastante difundida em processos industriais nas áreas alimentícia e farmacêutica. Efeitos antiinflamatórios da enzima, como também, o seu uso no tratamento da angina, na indigestão entre outros, estão documentados na literatura científica. Estudos de métodos para purificação de biomoléculas que viabilizem a sua obtenção em larga escala com custo reduzido são importantes áreas de pesquisa na biotecnologia. A extração líquido-líquido através de sistemas bifásicos aquosos (SBA) pode ser usada como técnica de pré-purificação de bioprodutos. Estes sistemas formam duas fases aquosas imiscíveis ou parcialmente miscíveis entre si. Podem ser formados a partir da mistura de dois polímeros ou de um polímero e um sal, a exemplo do sistema PEG (polietilenoglicol)/fosfato de potássio. Foi estudada a enzima bromelina derivada das folhas de ambas as variedades: curauá branco e curauá roxo. Pesquisou-se também a recuperação da enzima por extração líquido-líquido em sistemas de duas fases aquosas PEG/fosfato. Realizou-se ensaios em batelada para a extração e recuperação da enzima, utilizando como indicador o coeficiente de partição. Obteve-se fatores de purificação da enzima bromelina para o sistema fosfato de potássio e polietileno glicol 4000 e 6000, nos pH de 7,0; 8,0 e 9,0 a 25 °C. Estudou-se a partição em três diferentes "tie-lines". Analisou-se a influência do pH e do comprimento das linhas de amarração no coeficiente de partição da enzima. Na purificação da bromelina derivada das folhas do curauá branco, observou-se os melhores resultados no sistema bifásico aquoso PEG 4000/Fosfato em pH 7,0. Observou-se que o sistema PEG 6000/Fosfato em pH 7,0 apresentou os melhores resultados em relação à purificação da enzima bromelina derivada das folhas do curauá roxo. / Abstract: The curauá (Ananas erectifolius) is a fibrous plant from brazilian Amazon, belonging to the Bromeliaceae family and Ananas genus. Bromelain is a protease from vegetable origin, obtained from several species of this family. The bromelain has widespread use in industries process, such as in food and pharmaceutical areas. Antiinflammatory effects enzyme and also it uses in angina treatment, indigestion among others are documented in scientific literature. Methods' studies to purification of biomolecules that allow their achievement in large scale with low cost are important research's areas in biotechnology. The liquid-liquid extraction through aqueous twophase system (ATPS) can be used as technical of pre-purification of bioproduct. These systems form aqueous two-phase immiscible or partially miscible within themselves. They can be obtained by the addition of two polymers or one polymer and a salt, such as the PEG - poly(ethyleneglycol) - and potassium phosphate salt system. In the present report we characterized the bromelain enzyme that comes from the leaves of white curauá and purple curauá, and also investigated the recuperation of the enzyme by liquid-liquid extraction in aqueous two-phases PEG-phosphate systems (ATPS). The assays to extraction and recovery of the enzyme were carried out in batch mode, using the partition coefficient as indicator. Getting to factors purification of the enzyme bromelin to PEG 4000 and 6000 and potassium phosphate salt in ATPS, at pH 7.0, 8.0 and 9.0 at 25 ºC. We studied the partition through three different tie-lines. The influences of pH and tie-line length in partition coefficient of enzyme were analyzed. In the purification of bromelain derived from the leaves of white curauá, we observed the best results in PEG 4000/phosphate ATPS at pH 7.0. Furthermore, the system PEG 6000/phosphate at pH 7.0 showed the best results in relation to the purification of the enzyme bromelain derived from the leaves of purple curauá. / Mestrado / Sistemas de Processos Quimicos e Informatica / Mestre em Engenharia Química

Orientador: Celso Eduardo Benedetti / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-24T14:13:17Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Lira_NayaraPatriciaVieirade_M.pdf: 3098417 bytes, checksum: 6441392e6b6c275daba6bd89e88cbaf8 (MD5) Previous issue date: 2014 / Resumo: Xylella fastidiosa e Agrobacterium tumefaciens são bactérias fitopatogênicas que infectam, respectivamente, o interior do xilema e de tecidos vasculares de raiz, ambientes cuja tensão de oxigênio é relativamente baixa. Uma vez que Xylella e Agrobacterium são bactérias estritamente aeróbicas, elas apresentam o operon bigR, responsável pela detoxificação do sulfeto de hidrogênio ou gás sulfídrico, um potente inibidor do citocromo c oxidase e respiração aeróbica. O operon bigR codifica cinco proteínas denominadas Blh (Beta-lactamase-like hydrolase), BigR (biofilm growth-associated repressor), um repressor transcricional e regulador do operon, e MP1-3, proteínas que compõem um transportador de membrana. Em trabalho anterior, foi demonstrado que mutantes de Agrobacterium deficientes na produção de Blh acumulavam gás sulfídrico, enquanto mutantes no repressor BigR secretavam mais sulfito, indicando que a proteína Blh convertia gás sulfídrico em sulfito e que este, que também é tóxico, seria exportado pelo complexo MP1-3. Além disso, dados de modelagem molecular indicaram que Blh poderia desempenhar funções de sulfotransferase e dioxigenase de enxofre, uma vez que apresenta os domínios DUF442 (rodanase) e ETHE1 (dioxigenase). A fim de testar tais hipóteses, este trabalho teve como principais objetivos a caracterização enzimática dos domínios DUF442 e ETHE1 da Blh de Xylella e Agrobacterium, como também confirmar interações proteína-proteína entre os componentes do operon bigR. Ensaios de atividade enzimática usando-se proteínas recombinantes purificadas confirmaram a função de dioxigenase de enxofre e de rodanase dos domínios ETHE1 e DUF442, respectivamente. Além disso, verificou-se que ambos os domínios produzem sulfito como produto final da reação, embora atuando em substratos diferentes. Ainda, ensaios de duplo híbrido de levedura mostraram haver inúmeras interações entre as proteínas do operon bigR, mas não entre os dois domínios DUF442 e ETHE1 de Blh que, de acordo com os ensaios enzimáticos, atuam de forma independente. / Abstract: Xylella fastidiosa and Agrobacterium tumefaciens are phytopathogenic bacteria that infect, respectively, the xylem vessels and root vascular tissues, where the oxygen tension is relatively lower. Since Xylella and Agrobacterium are strict aerobic organisms, they use the bigR operon for the detoxification of hydrogen sulfide, a potent inhibitor of cytochrome c oxidase and aerobic respiration. The bigR operon encodes five proteins designated Blh (Beta-lactamase-like hydrolase), BigR (biofilm growth-associated repressor), a transcriptional repressor that regulates the operon, and MP1-3, proteins that act as a membrane transporter. In a previous work, it was shown that Agrobacterium mutants deficient in Blh production accumulated hydrogen sulfide, whereas BigR-deficient mutants secreted sulfite at higher levels than the wild type bacteria, indicating that Blh converted hydrogen sulfide into sulfite, which would be exported by the MP1-3 complex. In addition, molecular modeling indicated that Blh could function as a sulfur transferase and sulfur dioxigenase, since it carries a DUF442 (rhodanese) and ETHE1 (dioxygenase) domains. To test such hypothesis, this work aimed to demonstrate the enzymatic activities of the DUF442 and ETHE1 domains of Blh from Xylella and Agrobacterium, as well as to confirm protein-protein interactions between components of the bigR operon. Enzyme activity assays using the purified proteins confirmed the sulfur dioxygenase and rhodanese activities of the ETHE1 and DUF442 domains, respectively. In addition, it was found that both domains produce sulfite as a final product, although having different substrates. Furthermore, yeast two-hybrid assays showed that many of the bigR operon proteins interact with each other, suggesting the formation of a protein complex. However, no physical interactions were detected between DUF442 and ETHE1 domains, which, according to the enzyme activity assays, act independently. / Mestrado / Microbiologia / Mestra em Genética e Biologia Molecular

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:27:20Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2008-02-25Bitstream added on 2014-06-13T19:14:40Z : No. of bitstreams: 1 santos_kf_me_sjrp.pdf: 789178 bytes, checksum: c9d3ae49b4891343eda0dc12453c315f (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Angiotensina II, um peptídeo hipertensivo, e bradicinina, um peptídeo hipotensivo, são fatores humorais cruciais para a regulação da pressão sanguínea. A enzima chave desse sistema é a enzima conversora de angiotensina que produz angiotensina II a partir de angiotensina I e degrada bradicinina. A descoberta dos primeiros inibidores naturais dessa enzima, os peptídeos potenciadores de bradicinina (BPPs), tornou possível o desenvolvimento dos primeiros medicamentos utilizados no controle da pressão arterial humana. Caracteristicamente, os BPPs contêm de 5 a 13 resíduos de aminoácidos apresentando um resíduo de piroglutâmico no N-terminal e um resíduo de prolina no Cterminal. O precursor de BPPs encontrado na glândula de veneno de Bothrops jararaca contém 256 resíduos de aminoácidos e codifica para sete BPPs alinhados em tandem seguidos pelo peptídeo natriurético tipo-C. Até o momento, não se conhecem os mecanismos envolvidos para a liberação desses peptídeos da proteína precursora. Dessa forma, a resolução da estrutura dessa proteína pode contribuir para a elucidação do mecanismo evolvido no processamento do precursor para a liberação dos BPPs. Duas construções da proteína precursora de BPPs (domínio BPP e domínios BPP+CNP) da glândula de veneno de B. jararaca foram expressas, purificadas e suas identidades confirmadas por experimentos de western blotting. A pureza das amostras foi avaliada por SDS-PAGE e a presença de enovelamento após expressão heteróloga foi observada por experimentos de dicroísmo circular e fluorescência. Os ensaios de cristalização não foram promissores. Isso pode ser explicado pela baixa concentração da proteína usada no experimento. Assim, devido ao baixo nível de expressão de ambas as proteínas, métodos para maximização da expressão foram empregados resultando em significante... / Angiotensin II, a hypertensive peptide, and bradykinin, a hipotensive peptide, are crucial humoral factors for the regulation of blood pressure. The key enzyme for this system is the angiotensin-converting enzyme that produces angiotensin II from angiotensin I and degrades bradykinin. The discovery of the first natural inhibitors for this enzyme, the bradykinin potentiating peptides (BPPs), made it possible to develop the early drugs aimed at controlling unbalanced cardiovascular functions. Characteristically, BPPs contain 5 to 13 amino acid residues that have a pyroglutamyl residue at the N-terminus and a praline residue at the C-terminus. The BPP precursor protein contains 256 amino acid residues coding for seven BPPs aligned in tandem followed by the C-type natriuretic peptide. At present, there are no suggested mechanisms for understanding the release of BPPs from the precursor protein. Two constructs of the BPP precursor protein (BPP domain and BPP+CNP domains) from the venom gland of Bothrops jararaca were over-expressed, purified and the identity of both recombinant proteins confirmed by western blotting experiments. The purity of the samples was assessed by SDS-PAGE and the protein fold after expression was observed by circular dichroism and fluorescence experiments. Crystallization assays were not successful, probably due to the low protein concentration used for the experiment. Considering the low expression level observed for both recombinant proteins, the experimental methods were optimized to maximize the yield and resulted in high protein amounts in inclusion bodies. Methods were applied aiming at the solubilization of the proteins from the insoluble fraction and protein purification under denaturing conditions was carried out yielding high amounts of pure protein. Until this moment, none of the procedures were successful in producing refolded proteins. Work ...(Complete abstract click electronic access below)