O fator de indução de proteólise (proteolysis-inducing factor) ou PIF é uma glicoproteína de 24 kDa encontrada no plasma de pacientes com câncer e responsável pelo catabolismo de proteínas musculares associado a caquexia neoplásica. O presente trabalho investigou pelas técnicas de RT-PCR, RACE-PCR e Real-time PCR a presença de formas de expressão de mensagens do PIF em vários tipos celulares derivados de tecido normal e tumoral. A expressão de mRNA do gene foi testada em 37 amostras de tumores e 4 tecidos normais, sendo detectada em 7 de 20 linhagens tumorais de mama, uma linhagem tumoral de cólon e no tecido normal da mama, placenta e testículo. A expressão significativa do gene PIF entre as linhagens metastáticas da mama foi confirmada pela técnica de Real-time PCR. Uma nova variante da mensagem (PIF-SV), contendo um novo éxon de 64 bp, inserido entre os éxons 4 e 5, foi identificada em tecido normal de mama pela técnica de RACE-PCR. Esta forma variante de PIF é expressa concomitante com a forma principal de PIF em tumores primários da mama, linhagens tumorais de mama e nos tecidos normais da mama e placenta. Parece que o PIF exerce funções fisiológicas nos tecidos normais. / Proteolysis-inducing factor (PIF) is a 24 kDa glycoprotein identified in plasma of cancer patients and responsible for muscle catabolism associated with the process of cancer cachexia. The present study has investigated, using the RT-PCR, RACE-PCR and Real-time PCR techniques, the presence of PIF messages in different cell types derived from normal and tumor tissues. The PIF mRNA expression was examined in 37 tumor and 4 normal tissue samples and detected in 7 of 20 breast tumor cell lines, one colon tumor cell line and in normal breast, placenta and testis tissues. The differential expression of PIF message in metastatic breast cell lines was confirmed by the Real-time PCR technique. A new splicing form of the message, containing one new exon of 64bp, inserted between the exons 4 and 5, was identified in normal breast tissue. This splicing form of PIF is expressed concomitantly with a main form of PIF in breast tumor cell lines and also in normal breast and placenta tissue. These data suggest that PIF exhibits physiological functions in normal tissues. An over-expression and a production of a new splicing form (PIF-SV), seem to contribute in some event leading normal cell to a malignant phenotype.

O Brasil dedica-se em grande parte à criação de animais Bos indicus, principalmente da raça Nelore e seus cruzamentos, já que são animais resistentes a doenças e adaptados ao clima tropical. Entretanto, em relação à característica de maciez da carne, restrições têm sido atribuídas a este tipo de animal. Particularmente neste aspecto, existe grande interesse pela seleção de animais cuja genética seja favorável à carne mais macia e com redução na variação da maciez da carne. Durante o período de maturação da carne, a proteólise é o fator que mais contribui com o aumento da maciez. As proteases neutras ativadas por íons de cálcio, denominadas calpaínas, são parcialmente responsáveis pela proteólise post mortem, conduzindo ao aumento progressivo da maciez da carne. Entretanto, existe dificuldade em obter dados fenotípicos relacionados à maciez. Assim, a Seleção Assistida por Marcadores (MAS) pode ter grande impacto para melhorar estas características de difíc il mensuração. Marcadores do gene da calpaína (CAPN) e da calpastatina (CAST), denominados SNPs (Single Nucleotide Polymorphisms), já foram analisados e polimorfismos foram associados favoravelmente com maciez da carne bovina. Entretanto, pouco se conhece sobre a expressão gênica da calpaína e da calpastatina, particularmente em bovinos castrados da raça Nelore com diferentes combinações genotípicas para os marcadores moleculares SNP associados a essas proteases. Assim, este estudo teve como objetivo avaliar a expressão gênica da calpaína e da calpastatina em animais castrados da raça Nelore, com genótipos contrastantes identificados previamente por marcadores SNPs para um, sete e 14 dias de maturação. Foram genotipados 16 animais castrados da raça Nelore e dois marcadores foram utilizados, sendo um associado ao gene da µ-calpaína e outro associado à calpastatina (CAPN4751 e UOGCAST). Através da eletroforese bidimensional (2DE) as intensidades de expressão dos spots foram determinadas. As análises estatística s foram realizadas com auxílio do programa Statistical Analysis System (SAS), utilizando o procedimento PROC MIXED. A proteólise post mortem entre os tempos determinados de maturação foi avaliada e foram observados que 41 spots apresentaram efeitos significativos entre os tempos de maturação. Seis spots explicaram 57% da variabilidade da maciez aos 14 dias de maturação. Com o objetivo de verificar a existência de possíveis diferenças de expressão gênica entre amostras com genótipos distintos, avaliações proteômicas foram realizadas visando avaliar as diferenças no perfil proteico e foram baseadas no estudo comparativo (match) dos géis inter e intra combinações genotípicas. Dois spots explicaram 69% da variabilidade da maciez aos sete dias de maturação. Para o período de 14 dias de maturação 19 spots apresentaram efeito principal significativo para a fonte de variação de interação CAPN4751(UOGCAST) e, neste caso, a análise de regressão apresentou um spot que explica 70% da variabilidade da maciez aos 14 dias de maturação. / Brazil is largely devoted to the breeding of Bos indicus, especially Nellore and their intersections, because these animals are resist ant to diseases and adapted to tropical climate. However, in relation to beef tenderness, restrictions have been assigned to this breed. Particularly in this respect, there is great interest in the genetic selection of animals with more tender beef and reduced variation in meat tenderness. During the aging of the meat, proteolysis is the major factor that contributes to the increased tenderness. The neutral proteases activated by calcium ions, called calpains, are partially responsible for postmortem proteolysis, leading to a progressive increase in meat tenderness. However, there is difficulty in obtaining phenotypic data related to tenderness, in this way, Marker Assisted Selection (MAS) may have great impact to improve these characteristics. Gene markers of calpain (Capn) and calpastatin (CAST), called SNPs (single nucleotide polymorphisms) have been studied and polymorphisms were associated positively with beef tenderness. However, not much is known about the gene expression of calpain and calpastatin, particularly in Nellore steers with different genotype combinations for the SNP markers associated with these proteases. This study aimed to evaluate the gene expression of calpain and calpastatin in castrated Nellore, with contrasting genotypes previously identified by SNPs marker for one, seven and 14 days of aging. We genotyped 16 castrated Nellore, and two markers were used, one being associated with the µ-calpain gene and the other associated with calpastatin (CAPN4751 and UOGCAST). Through two-dimensional electrophoresis (2DE) the intensities of the spots were determined. Statistical analyzes were performed using the Statistical Analysis System (SAS) using the PROC MIXED. The postmortem proteolysis among the times of aging was evaluated and it was observed that 41 spots showed significant effects between different times of aging. Six spots explained up to 57% of the variability of tenderness at 14 days of aging. In order to verify the existence of possible differences in expression among samples with different genotypes, proteomics aimed to evaluate the differences in protein profile, based on comparative study (match) of the gels inter and intra genotype combinations. Two spots explained up to 69% of the variability of tenderness to seven days of maturation. For the period of 14 days of aging 19 spots showed significant main effect for interaction CAPN4751(UOGCAST), in this case regression analysis showed a spot that explains 70% of the variability of tenderness to 14 days of aging.

A hidrólise enzimática de penas residuais da indústria avícola constitui uma alternativa ao descarte irregular e uma fonte rica em aminoácidos para a produção de rações animais. A presença de queratinases em linhagens bacterianas probióticas, pode, concomitantemente, permitir um melhor aproveitamento de rações contendo queratina, devido a possibilidade de suplementação da dieta de animais monogástricos com tais microrganismos. Igualmente, proteases queratinolíticas possuem ampla utilização na indústria. Neste contexto, uma protease queratinolítica da linhagem probiótica FTC01PR01 de Bacillus subtilis foi purificada através de cromatografia líquida (Sephadex G-75 e DEAE Sepharose) e caracterizada por ensaio de proteólise em azocaseína com diversos interferentes, revelando uma serinoprotease com, aproximadamente, 31 kDa e atividade ótima a 60 °C em pH neutro e alcalino. Embora a enzima não seja termoestável, constatou-se que sua atividade é alterada na presença de íons manganês, apresentando estimulação em temperatura de 37 °C e aumento da termotolerância à 55°C. O crescimento do microrganismo em substratos queratinosos demonstrou eficiência para degradação de farinha de pena e penas brancas seguido por menor degradação de penas melânicas. Sendo constituído exclusivamente de α-queratina, o cabelo humano não sofreu proteólise. A enzima pode ser aplicada na indústria para a degradação de materiais recalcitrantes bem como a produção de ração animal. A efetividade do microrganismo in vivo para aumentar a digestibilidade da farinha de pena aliada a função probiótica, demanda mais estudos. / Enzymatic hydrolysis of waste feathers constitute an alternative to irregular disposal and a rich source of aminoacids for animal feed production. The presence of keratinases in probiotic bacterial strains may, concomitantly, allow better use of keratin-based feeds, due to the possibility of diet supplementation with beneficial microorganisms. In this context, a keratinolytic protease of Bacillus subtilis FTC01PR01 was purified by liquid chromatography (Sephadex G-75 and DEAE Sepharose) and characterized by azocasein proteolysis assay, revealing a serine protease with, approximately 31 kDa, and optimal activity at 60 ° C on neutral and alkaline pH. Although the enzyme was not thermostable, it’s activity was altered in presence of manganese ions, with stimulation at temperature of 37 °C and increased thermal tolerance at 55 °C. Microorganism growth on keratin substrates demonstrated efficiency for feather meal and white feathers degradation, followed by less degradation of melanized feathers. As a source of pure α-keratin, human hair was not degraded. The enzyme may be applied in industry for recalcitrant materials degradation and animal feed production. The effectiveness of the microorganism to increase the feather meal digestibility; ally to the probiotic function, demand further studies.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:32:58Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2007-08-09Bitstream added on 2014-06-13T20:04:46Z : No. of bitstreams: 1 hadlich_jc_dr_botfmvz.pdf: 425826 bytes, checksum: 851cc90401c88b4b9f86ddc4b378c705 (MD5) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Universidade Estadual Paulista (UNESP) / Este trabalho foi conduzido com o objetivo de estudar o padrão de crescimento do tecido muscular por caracterização das fibras musculares durante o desenvolvimento animal e suas conseqüências na maciez final da carne de bovinos da raça Nelore. Foram utilizados 20 animais da raça Nelore criados no modelo biológico superprecoce. Durante o crescimento foi realizada biopsia nos animais para analisar a composição do tecido muscular no animal in vivo e sua influência na qualidade da carne postmortem. A área e diâmetro das fibras SO, FOG e FG (fibras oxidativas, oxidativas-glicolíticas e glicolíticas) apresentaram correlações (P<0,01) entre elas demonstrando que o crescimento é um evento que ocorre concomitantemente para os diferentes tipos de fibras. Com relação aos parâmetros de qualidade de carne foi encontrada correlação positiva entre a área e diâmetro das fibras FG e valores de força de cisalhamento (rp=0,68, P<0,05; rp=0,81, P<0,01 respectivamente) e correlações negativas entre área e diâmetros das fibras FG e índice de fragmentação miofibrilar, ambos medidos na carne com 48 horas de resfriamento (rp= -0,75, P<0,01; rp= -0,58, P>0,05 respectivamente). Desta maneira podemos inferir que o tamanho da fibra muscular pode influenciar negativamente nas características de qualidade de carne, em especial a maciez. / The present work was lead with objective to study the standard of growth of the tissue muscular by characterization of the muscular fibers during the animal development and the consequences in the final meat tenderness of bovines of Nellore breed. Twenty animals of Nellore breed had been feedlot in the superprecoce' biological model. During the growth samples were collected by biopsy in animals to analyze the composition of muscular tissue in living animal and the influence in the meat quality on the postmortem. The area and diameter of fibers SO, FOG and FG (slow oxidative, fast oxidative-glicolitic and fast glicolitic), had showed correlations (P<0,01) between them demonstrating that growth is an event which occurs concomitantly for different types of fibers. In relation to the characteristics of meat quality it was found a positive correlation between the area and diameter of fibers FG and shear force values (rp=0,68, P<0,05; rp=0,81, P<0,01 respectively) and negative correlations between FG area and diameters of fibers and myofibrilar fragmentation index, both measured in the meat with 48 hours of cooling (rp= -0,75, P<0,01; rp= -0,58, P>0,05 respectively). In this way we can infer which size of muscular fiber can influence negatively in meat quality characteristics of, tenderness especially.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:27:43Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2004-02-19Bitstream added on 2014-06-13T19:15:07Z : No. of bitstreams: 1 hadlich_jc_me_botfmvz.pdf: 277198 bytes, checksum: 032e9607da08d48a7163bb8934baa7d2 (MD5) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / O experimento foi realizado no Setor de Confinamento de Gado de Corte da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia e no Laboratório de Bioquímica de Proteínas do Instituto de Biociências. Foram utilizados animais da raça Nelore, mestiços u Aberdeen X Nelore e mestiços u Simental X Nelore, abatidos com idade entre 12 e 15 meses conforme estabelecido pelo modelo biológico superprecoce. O experimento foi conduzido em um delineamento inteiramente casualizado. O objetivo do presente estudo foi análise de componentes da maciez de novilhos superprecoces de grupos genéticos distintos. Não foi verificada diferença estatística (p>0,01) entre os grupos genéticos para a força de cisalhamento, Índice de Fragmentação Miofibrilar (MFI) e frações do colágeno, entretanto houve influência (p<0,01) do período postmortem, exceto para o colágeno. A carne de animais abatidos entre 12 e 15 meses de idade apresenta atributos de qualidade independente do grupo genético utilizado e com sete dias de maturação todos os animais apresentaram carne com grau de maciez desejável. / The experiment was accomplished in the Section of Feedlot of cattle of Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia and in the Laboratório de Bioquímica de Proteínas do Instituito de Biociências. Nelore breed, u Aberdeen X Nelore crossbreed and u Simental X Nelore crossbreed were used and slaughtered accordingly with the brazilian system called superprecoce. The experiment was accomplished in a completely randomized design. The objective of the present study was the evaluation of tenderness components of superprecoce of different genetic groups. There was no statistics difference (p>0,01) between genetic groups for the shear force values, Myofibrillar Fragmentation Index (MFI) and collagen, however there was influence (p<0,01) of the ageing, except for the collagen. The meat of animals slaughtered between 12 and 15 months of age showed attributes of quality independent of the genetic group and with seven days of ageing all animals had a desirable tenderness.

Made available in DSpace on 2016-06-02T19:55:22Z (GMT). No. of bitstreams: 1 1651.pdf: 3101567 bytes, checksum: 399a65fa1b493a7477de38b37956b87e (MD5) Previous issue date: 2007-12-07 / Universidade Federal de Sao Carlos / Enzymatic hydrolyzed proteins present some advantages over the pool of amino acids obtained after a chemical hydrolysis: lower osmolality (easier absorption by the organism) and better sensorial characteristics. The removal of phenylalanine (Phe) from these hydrolysates allows their use in the diet of phenylktonuria (PKU) patients. This Thesis studies the sequential hydrolysis of cheese whey proteins. This process aims at producing a protein hydrolysate with low contents of Phe, after two reaction stages: in the first one, concentrated cheese whey proteins are hydrolyzed by the endoprotease chymotrypsin, immobilized on agarose gel. The substrate of the second stage is the product of the first one. This reaction is the central focus of this Thesis, and consists in a hydrolysis using the exoprotease carboxipeptidase A (CPA), immobilized on the same matrix. Since the scope of this work was a process for obtaining a protein hydrolysate with low contents of Phe for phenylketonurics, another stage had to be incorporated: ultrafiltration, to separate the amino acids released by the action of CPA, mainly Phe (and other amino acids that inhibit the reaction). With this purpose, an enzymatic membrane reactor (EMR) is proposed. It should be noticed that, to the best of our knowledge, the reactor design presented here has not been published yet. The EMR had spherical agarose particles within the reaction space, retained by a stainless steel mesh (400 Tyler). Hence, the ultrafiltration membrane was in charge only of the separation of the amino acids in the hydrolysate, which was continuously recycled to the flask containing the immobilized enzyme. Assays to characterize the membranes were performed. These membranes were then used in the integrated process (reaction with immobilized enzyme coupled to the ultrafiltration), for different experimental conditions. The substrates where Prato and Minas Frescal cheese whey. Two set-ups of the ultrafiltration unit were tested: flat plate and hollow fiber, both with 1 kDa cut-off. The reactor volume/membrane area ratios were 7.5×10-2 cm and 76.9×10-2 cm, respectively. Finally, the performance of three systems was compared: EMR with flat plane and hollow fiber and a batch reactor, followed by diafiltration. The hollow fiber EMR showed the best performance (85% conversion, productivity of 275.2×10-7 ghidrolisado/mgPhe/UH-PHE/h and only 1% retention of Phe in the membrane, after assays of 10 h). The resulting product was appropriate for phenylketonurics, with high protein contents (53.4 g/L), mainly constituted by small peptides (&#8804; 5.8 kDa) and with 19.9 mgPhe/gProteína, within the admissible range for PKU / Os hidrolisados protéicos via enzimática apresentam algumas vantagens, em relação à mistura de aminoácidos livres obtida pela hidrólise química: menor osmolalidade (e, portanto, maior facilidade de absorção pelo organismo) e características sensoriais mais agradáveis. Por sua vez, a remoção da fenilalanina (Phe) desses hidrolisados permite a utilização dos hidrolisados na dieta de fenilcetonúricos. Nesta Tese foi estudada a hidrólise enzimática seqüencial de proteínas de soro de queijo, processo proposto para obtenção de um hidrolisado protéico, com reduzido teor de Phe, e constituído de duas etapas reacionais: na primeira, as proteínas do soro de queijo concentrado são hidrolisadas pela endoprotease quimotripsina, imobilizada em gel de agarose. A segunda etapa, cujo substrato é o produto da primeira proteólise, é o foco central desta Tese, e consiste na hidrólise do substrato prehidrolisado utilizando-se a exoprotease carboxipeptidase A (CPA), imobilizada na mesma matriz. Como o escopo do trabalho era o processo para obtenção de um hidrolisado protéico com baixo teor de Phe para pacientes fenilcetonúricos foi necessário incorporar outra etapa: ultrafiltração, para separar os aminoácidos liberados por ação da CPA, principalmente Phe (além de outros aminoácidos inibidores da reação). Para isso, propõe-se trabalhar com reator enzimático de membrana (REM). Destaque-se que a concepção de reator aqui apresentada é, até onde vai nosso conhecimento, inédita. Estudou-se um reator de membrana com a enzima imobilizada em partículas esféricas de gel de agarose, retidas no volume reacional propriamente dito por meio de um filtro de aço (400 Tyler). Assim, a membrana de ultrafiltração ficou a cargo apenas da separação dos aminoácidos presentes no hidrolisado, que era reciclado continuamente para o frasco contendo a enzima imobilizada. Foram realizados ensaios para caracterização das membranas utilizadas, para posteriormente serem realizados ensaios em diferentes condições experimentais no processo integrado (reação com enzima imobilizada acoplada à ultrafiltração), utilizando como substratos soro de queijo tipo Prato e Minas Frescal. Foram testadas duas configurações de unidades de ultrafiltração: placa plana e fibra oca, ambas com corte de 1 kDa As razões volume de reator/área de membrana testadas foram de 7,5×10-2 e 76,9×10-2 cm, rescpectivamente. Foi desenvolvido um modelo matemático do REM, e suas predições foram comparados com dados experimentais de hidrólise com CPA para ambos os sistemas. Finalmente, foi comparado o desempenho de três sistemas: reator com membrana de placa plana, reator com membrana de fibra oca e reator em batelada, seguido por diafiltração com membrana de fibra oca. O REM tipo fibra oca apresentou o melhor desempenho (85% de conversão, uma produtividade de 275,2×10-7 ghidrolisado/mgPhe/UH-Phe/h e apenas 1% de retenção de Phe na membrana, em ensaios de 10 h. O produto resultante desse sistema apresentou características próprias para ser utilizado como complemento protéico para pacientes fenilcetonúricos, com um alto conteúdo protéico (53,4 g/L) constituído majoritariamente por pequenos peptídeos (&#8804; 5,8 kDa) e com 19,9 mgPhe/gProteína valor que se encontra dentro da faixa tolerada para pacientes de fenilcetonúria

Made available in DSpace on 2015-03-26T13:51:55Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 1046907 bytes, checksum: 3e2156440d7134bf2b8e8f5a387cc61a (MD5) Previous issue date: 2011-07-15 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / Among the psychrotrophic micro-organisms that are able to grow during refrigeration, some of them produce thermostable proteases which can cause many technological problems in the dairy industry. The food industries need to high throughput methods for the quality control raw of milk, thus, fast and sensitive methods for psychrotrophic detection, specially Pseudomonas fluorescens, predominant specie, are economically interesting to the dairy industry. In order to establish a protocol for the detection of P. fluorescens by using the polymerase chain reaction (PCR), five DNA extraction methods for milk samples, two target genes for the PCR amplification and the detection limit in raw milk and sterilized milk inoculated with P. fluorescens were evaluated. A commercial DNA extraction kit and a modified filtration method were the most appropriate for successfully bacterial DNA extraction from milk samples. These methods were selected and used for the detection of the target genes. Nevertheless, the modified filtration method was more efficient showing a lower detection limit in raw milk and sterilized milk inoculated with P. fluorescens. By means of PCR amplification of the 16S rRNA target gene, an 850 bp amplicon was observed and it was possible to detect as few as 102 UFC/ml of P. fluorescens from inoculated milk. In raw milk samples, Pseudomonas and psychrotrophic bacteria were detected at 106 UFC/mL and 107 to 109 UFC/mL, respectively. The relationship between the psychrotrophic population and the degradation of milk proteins was evaluated by sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). The results showed the proteolysis degree in raw milk doesn t depend just on the psychrotrophic bacteria count. / Entre os micro-organismos psicrotróficos que são capazes de crescer durante a refrigeração, alguns produzem proteases termorresistentes relacionadas com problemas tecnológicos nos derivados lácteos. Visto que a demanda por métodos que permitem alta taxa de processamento exigida em indústrias de alimentos para controle da qualidade de leite cru é crescente, a avaliação de métodos mais sensíveis e mais rápidos para detecção de psicrotróficos, especialmente Pseudomonas fluorescens, espécie predominante, é de grande importância. Com a finalidade de estabelecer um protocolo para detecção de P. fluorescens pela reação em cadeia da polimerase (PCR), foram avaliados cinco métodos de extração de DNA total do leite, dois genes alvos na PCR e o limite de detecção dos métodos para análise de leite cru e leite esterilizado e inoculado com P. fluorescens. O kit comercial e o método de filtração modificado foram os métodos mais adequados para extração de DNA total de amostras de leite, por isso, foram utilizados nas análises seguintes para detecção dos genes alvos. No entanto, a utilização do método de filtração modificado para análise de leite inoculado com P. fluorescens e leite cru resultou em um menor limite de detecção quando comparado com o kit comercial. Por meio da amplificação do gene alvo rDNA 16S, foi possível observar um amplificado de 850 pb quando a população do leite inoculado com P. fluorescens era da ordem de 102 UFC/ml. Em amostras de leite cru, foi possível detectar o produto quando a contagem de Pseudomonas era da ordem de 106 UFC/ml e a população de psicrotróficos estava entre 107 e 109 UFC/ml. A análise do grau de proteólise das amostras de leite cru por eletroforese em gel de poliacrilamida demonstrou que a relação entre a população de psicrotróficos e a degradação das proteínas do leite depende de outros fatores além da contagem de psicrotróficos.

A hidrólise enzimática de penas residuais da indústria avícola constitui uma alternativa ao descarte irregular e uma fonte rica em aminoácidos para a produção de rações animais. A presença de queratinases em linhagens bacterianas probióticas, pode, concomitantemente, permitir um melhor aproveitamento de rações contendo queratina, devido a possibilidade de suplementação da dieta de animais monogástricos com tais microrganismos. Igualmente, proteases queratinolíticas possuem ampla utilização na indústria. Neste contexto, uma protease queratinolítica da linhagem probiótica FTC01PR01 de Bacillus subtilis foi purificada através de cromatografia líquida (Sephadex G-75 e DEAE Sepharose) e caracterizada por ensaio de proteólise em azocaseína com diversos interferentes, revelando uma serinoprotease com, aproximadamente, 31 kDa e atividade ótima a 60 °C em pH neutro e alcalino. Embora a enzima não seja termoestável, constatou-se que sua atividade é alterada na presença de íons manganês, apresentando estimulação em temperatura de 37 °C e aumento da termotolerância à 55°C. O crescimento do microrganismo em substratos queratinosos demonstrou eficiência para degradação de farinha de pena e penas brancas seguido por menor degradação de penas melânicas. Sendo constituído exclusivamente de α-queratina, o cabelo humano não sofreu proteólise. A enzima pode ser aplicada na indústria para a degradação de materiais recalcitrantes bem como a produção de ração animal. A efetividade do microrganismo in vivo para aumentar a digestibilidade da farinha de pena aliada a função probiótica, demanda mais estudos. / Enzymatic hydrolysis of waste feathers constitute an alternative to irregular disposal and a rich source of aminoacids for animal feed production. The presence of keratinases in probiotic bacterial strains may, concomitantly, allow better use of keratin-based feeds, due to the possibility of diet supplementation with beneficial microorganisms. In this context, a keratinolytic protease of Bacillus subtilis FTC01PR01 was purified by liquid chromatography (Sephadex G-75 and DEAE Sepharose) and characterized by azocasein proteolysis assay, revealing a serine protease with, approximately 31 kDa, and optimal activity at 60 ° C on neutral and alkaline pH. Although the enzyme was not thermostable, it’s activity was altered in presence of manganese ions, with stimulation at temperature of 37 °C and increased thermal tolerance at 55 °C. Microorganism growth on keratin substrates demonstrated efficiency for feather meal and white feathers degradation, followed by less degradation of melanized feathers. As a source of pure α-keratin, human hair was not degraded. The enzyme may be applied in industry for recalcitrant materials degradation and animal feed production. The effectiveness of the microorganism to increase the feather meal digestibility; ally to the probiotic function, demand further studies.

O objetivo deste estudo foi investigar os efeitos do T3 e do seu análogo GC-24, agonista TR<font face=\"symbol\">b seletivo, na proteólise muscular mediada pela via ubiquitina-proteassoma. Avaliamos o efeito do T3 e GC-24 no trofismo radial de fibras musculares, no nível de ubiquitinação e na expressão de genes envolvidos na via ubiquitina-proteassoma. Para tanto foram utilizados, ratos Wistar divididos em 4 grupos (Controle, 12 horas, 1 e 7 dias) e tratados com T3 e GC-24. Determinou-se a área de secção transversa dos cortes histológicos através do programa \"Image Pro-Plus\". O nível de ubiquitinação foi determinado através de Western Blot para proteína ubiquitinada e a expressão gênica por PCR em Tempo real. T3 e GC-24 promoveram redução do diâmetro das fibras musculares e aumentaram o nível de proteínas ubiquitinadas em ambos os músculos. Com relação à expressão gênica, T3 e GC-24 modularam a expressão dos genes analisados de maneira diferenciada, demonstrando que GC-24 é capaz de modular genes pouco ou não responsivos ao T3. / Triiodothyronine (T3) is known to play a key role in the function of several tissues/organs via the thyroid hormone receptor isoforms a/pha (TRa) and beta (TRI3). Abnormalities in skeletal muscle function have been associated with increased leveis of T3, which is a major sarcopenia (Ioss of sarcomeres). Although the phenomenon of sarcopenia induced by T3 has been widely reported, little is known about the molecular mechanisms invo/ved in proteolysis induced by T3. In this study we have investigated the effects of T3 and GC-24, a novel synthetic TRI3¬selective compound, on the ubiquitin proteasome pathway. We analyzed the effect of T3 and GC-24 on the radial trophism, ubiquitination leveis and gene expression of the ubiquitin-proteasome pathway, which are important regulators of muscle proteolysis in the skeletal muscle. We have addressed the ubiquitin ligases (Atrogin¬1, MuRF-1 and E3a) and the deubiquitinating enzymes (UBP45, UBP69 and USP28). Wistar male rats (170-200g) were divided in 4 groups (Control, 12, 1 and 7 days). Rats received T3 (30l-\'g/100g) and GC-24 (16 I-\'g/1 OOg). After decapitation, EDL and soleus muscles were removed for histological ana/ysis, protein expression and gene expression. Cross sectional area was determined in histological sections through the software \"Image-Pro Plus. The ubiquitination leveis was determined by Western Blot and gene expression determined by Real Time PCR analysis. T3 and GC-24 reduced the diameter of the muscle fibers vs control group. Both T3 and GC-24 incresed the ubiquitination leveis, in the soleus and EDL. Regarding gene expression analysis, T3 and GC-24 modulate the gene expression in a differential manner. In the soleus, T3 increased Atrogin-1 and E3 alpha gene expression, while did not alter Murf-1 gene expression. On the other hand, in EDL Atrogin-1 gene expression is not altered, while E3 alpha and Murf-1 are elevated by T3. In the soleus and EDL deubiquitinating gene expression is mostly not altered, exception made for UBP 45, which is reduced by T3 in soleus muscle. GC-24, increased gene expression of E3a and MuRF-1 in the soleus, while did not alter Atrogin-1 gene expression. However, in EDL muscle, GC-24 increased Atrogin-1 and E3a mRNA, while did not alter MuRF-1. Finally, GC-24 decreased UBP 45 gene expression in EDL muscle and USP 28 gene expression was robustly elevated by GC-24 in both muscles analyzed. This data shows that GC-24 is able to strongly modulate genes that are less responsive or even unresponsive to T3, pointing that the GC-24-TRb complex might trans-activate differently target genes. However, both T3 and GC-24 are able to modulate the muscle proteolysis.

O fator de indução de proteólise (proteolysis-inducing factor) ou PIF é uma glicoproteína de 24 kDa encontrada no plasma de pacientes com câncer e responsável pelo catabolismo de proteínas musculares associado a caquexia neoplásica. O presente trabalho investigou pelas técnicas de RT-PCR, RACE-PCR e Real-time PCR a presença de formas de expressão de mensagens do PIF em vários tipos celulares derivados de tecido normal e tumoral. A expressão de mRNA do gene foi testada em 37 amostras de tumores e 4 tecidos normais, sendo detectada em 7 de 20 linhagens tumorais de mama, uma linhagem tumoral de cólon e no tecido normal da mama, placenta e testículo. A expressão significativa do gene PIF entre as linhagens metastáticas da mama foi confirmada pela técnica de Real-time PCR. Uma nova variante da mensagem (PIF-SV), contendo um novo éxon de 64 bp, inserido entre os éxons 4 e 5, foi identificada em tecido normal de mama pela técnica de RACE-PCR. Esta forma variante de PIF é expressa concomitante com a forma principal de PIF em tumores primários da mama, linhagens tumorais de mama e nos tecidos normais da mama e placenta. Parece que o PIF exerce funções fisiológicas nos tecidos normais. / Proteolysis-inducing factor (PIF) is a 24 kDa glycoprotein identified in plasma of cancer patients and responsible for muscle catabolism associated with the process of cancer cachexia. The present study has investigated, using the RT-PCR, RACE-PCR and Real-time PCR techniques, the presence of PIF messages in different cell types derived from normal and tumor tissues. The PIF mRNA expression was examined in 37 tumor and 4 normal tissue samples and detected in 7 of 20 breast tumor cell lines, one colon tumor cell line and in normal breast, placenta and testis tissues. The differential expression of PIF message in metastatic breast cell lines was confirmed by the Real-time PCR technique. A new splicing form of the message, containing one new exon of 64bp, inserted between the exons 4 and 5, was identified in normal breast tissue. This splicing form of PIF is expressed concomitantly with a main form of PIF in breast tumor cell lines and also in normal breast and placenta tissue. These data suggest that PIF exhibits physiological functions in normal tissues. An over-expression and a production of a new splicing form (PIF-SV), seem to contribute in some event leading normal cell to a malignant phenotype.