Submitted by Amauri Alves (amauri.alves@ufv.br) on 2015-11-23T15:39:38Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 1177179 bytes, checksum: dec9ea9972e24062fd20a5915e37c787 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-11-23T15:39:38Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 1177179 bytes, checksum: dec9ea9972e24062fd20a5915e37c787 (MD5) Previous issue date: 2015-07-17 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / A estocagem de leite cru sob temperatura de refrigeração não impede o crescimento de bactérias psicrotróficas produtoras de proteases termorresistentes que comprometem a qualidade e reduzem a vida de prateleira de produtos lácteos. Para minimizar os problemas tecnológicos resultantes da atividade proteolítica, é desejável que proteases sejam detectadas e quantificadas em leite cru por um método rápido. No entanto, não existe um método eficiente para este fim. Este trabalho teve como objetivos identificar as espécies psicrotróficas com potencial de deterioração predominantes em leite cru brasileiro; identificar e caracterizar as proteases resistentes ao calor produzidas por esta microbiota e desenvolver um método rápido para detectar estas proteases em amostras de leite. As condições de armazenamento sob refrigeração foram simuladas e as bactérias psicrotróficas proteolíticas foram isoladas. As bactérias produtoras de proteases termorresistentes foram agrupadas após análise por Rep-PCR. Os testes bioquímicos e o sequenciamento dos genes rDNA 16S e rpoB foram utilizados para identificar representantes de cada grupo. Uma protease termorresistente produzida por Serratia liquefaciens foi caracterizada e o gene que codifica esta enzima foi identificado após análise dos peptídeos trípticos da protease por espectrometria de massa. Placas de microtitulação revestidas com caseína marcada com biotina foram utilizadas para quantificar a atividade proteolítica de amostras de leite e de proteases diluídas em solução tampão. Os isolados bacterianos altamente proteolíticos foram separados em oito grupos diferentes e quatro padrões únicos. Os isolados com potencial proteolítico são correspondentes à espécie Serratia liquefaciens e ao gênero Pseudomonas. Isolados de S. liquefaciens podem produzir uma metaloprotease termorresistente ao tratamento de 95 °C por 8,45 min, identificada como Ser2, com massa molar de, aproximadamente, 52 kDa e semelhante à protease AprX de Pseudomonas spp. Embora sequências de nucleotídeos do gene ser2 sejam conservadas entre os isolados de S. liquefaciens, o potencial de deterioração das estirpes é heterogêneo indicando diferenças nos níveis de expressão gênica, enzima viii ou modificações pós-transcricionais. O imunoensaio desenvolvido neste estudo foi eficiente para a quantificação da atividade de tripsina, papaína, pepsina, termolisina e protease de pâncreas bovino. No entanto, novas pesquisas devem ser realizadas para minimizar a influência dos componentes da amostra de leite nesta técnica para permitir a detecção acurada de proteases. Este trabalho destaca o elevado potencial de deterioração da microbiota encontrada em amostras de leite cru, além do desenvolvimento de um ensaio promissor, útil para a indústria de lacticínios, para detecção e quantificação de atividade proteolítica resultante das práticas agrícolas inadequadas nas propriedades produtoras de leite. / The storage of raw milk at cold temperatures does not prevent growth of psychrotrophic bacteria, which can produce heat-resistant proteases that compromise the quality and reduce the shelf life of dairy products. To minimize the technological problems resulting from proteolytic activity, these enzymes should be detected and quantified in raw milk before processing by a rapid method. However, there is no efficient method for this purpose. This work aimed to identify the predominant psychrotrophic species with spoilage potential in Brazilian raw milk, to identify and characterize the heat-resistant proteases produced by this microbiota and to developed a rapid method to detect these proteases in raw milk samples. The cold storage conditions were simulated and the psychrotrophic proteolytic bacteria isolated. The heat-resistant protease-producing bacteria were typing by Rep-PCR and clustered. Biochemical tests, 16S rDNA and rpoB gene sequencing were used for identifying one representative isolate from each cluster. The heat-resistant protease produced by Serratia liquefaciens was characterized. The encoding gene was identified after mass spectrometry analysis of tryptic peptides from the heat-resistant protease. The biotinylated casein was coated on microtiter plates and used as substrate to quantify proteolytic activity in solution and milk samples. Highly proteolytic strains were identified and characterized. The isolates were separated into eight different clusters and four solitary fingerprints. The most proteolytic isolates belonged to Serratia liquefaciens and Pseudomonas species. The S. liquefaciens isolates may produce Ser2, which is a a metalloprotease resistant to the heat treatment of 95 °C for 8.45 min. This metalloprotease showed a molecular weight of approximately, 52 kDa and a heat- resistance similar to AprX from Pseudomonas spp. Although nucleotide sequences of ser2 gene were conserved among S. liquefaciens isolates, the spoilage potential among them was heterogeneous indicating differences in enzyme expression levels or post-transcriptional modifications. The developed immunoassay was efficient for quantification of trypsin, papain, pepsin, thermolysin and protease from bovine x pancreas activity. However, further research should be performed to minimize the influence of milk components on the developed assay for detecting proteases in milk samples. This work highlighted the poor conditions of hygiene in milk farms and the high spoilage potential of the microbiota found in raw milk samples besides the development of a promising assay for detection and quantification of proteolytic activity useful for dairy industry.

O proteassomo é o componente do sistema Ubiquitina-Proteassomo (UPS), responsável pela degradação de proteínas intracelulares marcadas com cauda de ubiquitina. No entanto, a unidade catalítica do proteassomo (20SPT), destituída de unidades regulatórias, é capaz de degradar proteínas de maneira ubiquitina-independente. Diversas modificações pós-traducionais já foram descritas para o 20SPT, incluindo a S-glutatiolação. De acordo com Demasi e col., (2003) o 20SPT da levedura Saccharomyces cerevisiae possui a atividade tipo-quimiotripsina modulada por glutationa e o mecanismo de glutatiolação implica na formação do intermediário ácido sulfênico. No presente trabalho, identificamos por espectrometria de massas (MS/MS) um total de sete resíduos diferentes de cisteína glutatiolados no 20SPT, sendo seis in vitro por incubação com GSH e três in vivo, extraído de células crescidas até atingir fase estacionária tardia em meio rico. Analisando a estrutura 3D do 20SPT, observou-se que os resíduos de cisteína glutatiolados não estão localizados na entrada da câmara catalítica nem próximos aos sítios-ativos, indicando um mecanismo alostérico da modulação da atividade proteassomal. O proteassomo glutatiolado extraído de leveduras é capaz de degradar proteínas oxidadas de maneira mais eficiente que o proteassomo reduzido por DTT, e ainda, esta degradação gera perfis peptídicos diferenciados por utilizar distintamente as atividades sítio-especificas, como visualizado por análises de HPLC e MS/MS. Por microscopia eletrônica verificamos a conformação aberta da câmara catalítica do proteassomo glutatiolado, sendo esta imediatamente fechada pela remoção da glutationa do 20SPT na presença de DTT. Caracterizamos ainda, enzimas reponsáveis pela desglutatiolação do 20SPT, capazes de recuperar as atividades proteassomais que haviam sido diminuídas pela glutatiolação: as oxidoredutases glutarredoxina 2 e as tiorredoxinas citosólicas. O mecanismo ainda inclui a hidrólise dessas oxidorredutases, fenômeno também verificado para diversas proteínas da suprafamília tiorredoxina, provavelmente devido a propriedades estruturais desta família. A glutatiolação do proteassomo apresenta-se como uma nova modificação pós-traducional de ocorrência fisiológica dependente do estado redox celular. Esta modificação promove aumento da atividade proteolítica, sugerindo uma função antioxidante atuante na remoção de proteínas oxidadas durante desafios oxidativos / The proteasome is the protease of the Ubiquitin-Proteasome System (UPS) responsible for the breakdown of intracellular ubiquitin-tagged proteins. However, the catalytic particle of the proteasome (20SPT) is capable of hydrolyzing some substrates in an ubiquitin-independent fashion. The S-glutathiolation of the 20SPT was described among several post-translational modifications and according to Demasi et. al. (2003), the chymotrypsin-like activity of proteasome from yeast Saccharomyces cerevisiae is regulated by glutathione. The mechanism of S-glutathiolation is dependent on the formation of the sulfenic acid intermediate in the cisteine residues of the 20SPT. In this present work, we identified in vitro and in vivo, a total of seven different S-glutathiolated proteasomal cysteine residues by mass spectrometry studies (MS/MS) and, by analyzing the 3D structure of the 20SPT, the modified cysteine residues are not located either on the entrance of the catalytic core or near to the active sites, indicating an allosteric mechanism of proteasomal modulation. During protein degradation, the natively S-glutathiolated 20SPT produces different patterns of peptide products when compared to the DTT-reduced particle through distinct site-specific cleavage of the protein substrates, as herein demonstrated by HPLC and MS/MS analyses. Furthermore, by electron microscopy, we showed that the entrance of the natively glutathiolated 20SPT is in the open conformation that immediately shifts to the closed conformation in the presence of DTT. We have also characterized the deglutathiolase role of the oxidoreductases Glutaredoxin 2 and Citosolic Thioredoxins 1 and 2 which recover the partially inhibited 20SPT activities. The deglutathiolation mechanism also includes the oxidoreductase degradation dependent on the 20SPT activation. The proteasome Sglutathiolation emerges as a new physiological post-translational modification correlated to the cellular redox state. Moreover, the S-glutathiolation of the 20SPT increases its proteolytic activity suggesting an antioxidant role by removing oxidized proteins generated during oxidative challenges.

Ensiling high moisture grain often increases starch and protein digestibilities due proteolysis during storage. However, the length of storage is fundamental to allow great protein matrix break down. The central objective of this work was to evaluate the effect of length of storage of reconstituted sorghum grain silage (RSGS) on dairy cows performance. Simultaneously it was evaluated the effect of sodium benzoate on silage nutritive value and its impact on animal performance. The hypothesis was that sodium benzoate reduces proteolitic activity due its antimicrobial properties. Two sequential experiments with mid-lactation Holstein dairy cows were set. The first experiment evaluated the effect of different length of storages on RSGS treated or not with sodium benzoate (0.2% as fed). Silages treated with additive (Benzoate) and non-treated (Control) were stored for 30 or 90 days prior feeding. Twenty mid-lactation dairy cows with 168 ± 87 days in milk (DIM) were used in 5 replicated 4 × 4 Latin square design with a 2 × 2 factorial arrangement. Dry ground sorghum grain was reconstituted to 35% moisture and ensiled in 200-L plastic drums. Treatments were: RSGS stored for 30 days without additive (30 CON), RSGS stored for 30 days with sodium benzoate (30 BEN), RSGS stored for 90 days without additive (90 CON) and RSGS stored for 90 days with sodium benzoate (90 BEN). Lengthening silage storage increased 1,2-propanediol concentration and protein solubility of silages. Milk yield was greater in favor of cows fed silage stored for 90 days compared to 30 days (31.2 vs. 30.0 kg/d). Starch (89.3 vs. 86.9%) and protein (57.1 vs. 54.0%) digestibility was also greater for silages stored for 90 days compared to 30 days. Sodium benzoate reduced silage ethanol concentration (0.20 vs. 0.08% of DM), but did not altered statistically protein solubility (CON = 18.9 vs. BEN = 15.6% of CP) or ammonium-N (CON = 4.38 vs. BEN = 3.94 % of N). The second trial were conducted with 12 mid-lactation dairy cows (170 ± 47 DIM) to evaluated the effect of sodium benzoate on nutritive value and dairy cows performance fed RSGS stored for 150 days, treated (Benzoate) or not (Control) with sodium benzoate. Cows received a standard diet containing dry ground sorghum for 14 days. At the end of adaptation period, cows were paired blocked and randomly assigned to one of two treatments (Control or Benzoate) for 28 experimental days. During experimental period cows received the same diet with the exception of dry ground sorghum, which was totally replaced with RSGS. Silages treated with sodium benzoate had low ethanol (0.84 vs. 0.18 % of DM) and ethyl-lactate (388 vs. 157 mg/kg of DM) concentration as a consequence of low yeast population (4.73 vs. 2.52 log cfu/g). Soluble protein was reduced on treated silages (26.2 vs. 20.6 % of CP). Aerobic stability was higher for treated silages (51 vs. 146 h). Dairy cow performance was not altered by treating silages with sodium benzoate. In conclusion, extending the length of storage of RSGS increased dairy cows use feed efficient and nitrogen use efficiency due higher starch and protein digestibility. Sodium benzoate promoted typical response on silage fermentation and did not alter animal performance. / A ensilagem de grãos úmidos geralmente aumenta a digestão do amido e da proteína devido a proteólise durante o armazenamento. Porém, o tempo de armazenamento é fundamental para permitir que a matriz proteica seja degradada. O objetivo central desse trabalho foi avaliar o efeito do tempo de estocagem em silagens de sorgo grão reconstituído (SSGR) no desempenho de vacas leiteiras. De forma simultânea foi avaliado o efeito do benzoato de sódio no valor nutritivo de silagens de sorgo grão reconstituído. A hipótese foi que o uso de benzoato de sódio em SSGR reduz a atividade proteolítica devido suas propriedades antimicrobianas impactando no desempenho animal. Uma sequência de dois experimentos com vacas leiteiras da raça Holandesa foram formatados. O primeiro experimento avaliou o efeito de diferentes tempos de estocagem em SSGR tratadas ou não com benzoato de sódio (0.2 % base na matéria natural). Silagens não tratadas (Controle) e tratadas com aditivo (Benzoato) foram armazenadas por 30 ou 90 dias antes do fornecimento. Vinte vacas leiteiras (168 ± 87 dias em lactação) foram usadas em cinco quadrados latinos replicados 4 × 4 em arranjo fatorial 2 × 2. Sorgo grão foi reconstituído para 35 % de umidade em ambos os experimentos e ensilados em tambores plásticos com capacidade de 200-L. Os tratamentos foram: SSGR armazenados por 30 dias sem aditivo (30 CON), SSGR armazenados por 30 dias com benzoato de sódio (30 BEN), SSGR armazenados por 90 dias sem aditivo (90 BEN) ou SSGR armazenados por 90 dias com benzoato de sódio (90 BEN). Prolongando o tempo de armazenamento a concentração de 1,2-propanodiol e proteína solúvel aumentaram. A produção de leite foi maior em favor das vacas alimentadas com silagens armazenadas por 90 dias comparadas à 30 dias (31.2 vs. 30.0 kg/d). A digestibilidade do amido (89.3 vs. 86.9%) e da proteína (57.1 vs. 54.0%) foi maior para silagens armazenadas por 90 dias. O benzoato de sódio reduziu a concentração de etanol (0.20 vs. 0.08% of DM), porém não alterou ao nível de significância estatística adotada nesse trabalho a proteína solúvel (CON = 18.9 vs. BEN = 15.6% of PB) e o N-amoniacal (CON = 4.38 vs. BEN = 3.94 % of N). O segundo experimento foi conduzido com 12 vacas leiteiras (170 ± 47 DEL) para avaliar o efeito do benzoato de sódio no valor nutritivo e desempenho de vacas leiteiras alimentadas com SSGR estocadas por 150 dias, tratadas (Benzoato) ou não (Controle) com benzoato de sódio. Uma dieta padrão contendo sorgo grão seco moído foi fornecida por 14 dias. No final do período de adaptação, os animais foram pareados dois a dois e distribuídos aleatoriamente a um de dois tratamentos (Controle ou Benzoato) fornecidos por 28 dias. Durante o período experimental as vacas receberam a mesma dieta sendo o sorgo seco totalmente substituído por SSGR. Silagens tradadas com benzoato de sódio tiveram menor concentração de etanol (0.84 vs. 0.18 % de MS) e etil lactato (388 vs. 157 mg/kg de MS) como consequência de uma menor população de leveduras (4.73 vs. 2.52 log ufc/g). A proteína solúvel foi reduzida nas silagens tratadas (26.2 vs. 20.6 % da PB). A estabilidade aeróbia foi mais alta nas silagens tratadas (51 vs. 146 h). Em conclusão, estender o tempo de estocagem em SSGR aumentou a eficiência alimentar e do uso do nitrogênio devido ao aumento na digestibilidade do amido e da proteína. O benzoato de sódio promoveu respostas típicas na fermentação de silagens, e não alterou o desempenho animal.

Orientador: Elisa Maria Aparecida Giro / Resumo: O objetivo deste trabalho foi avaliar o perfil proteômico e a proteólise da histatina 1 e da histatina 5 na saliva total estimulada de indivíduos com síndrome de Down (SD) e não-sindrômicos (NS) na presença e na ausência da doença periodontal (DP). Foram selecionados 24 indivíduos, os quais foram divididos em 4 grupos experimentais (n=6): SD com DP (SDcDP), SD sem DP (SDsDP), não sindrômicos com DP (NScDP) e não sindrômicos sem DP (NSsDP - controle). Inicialmente, os participantes passaram por exame clínico intra-bucal para avaliação da condição periodontal e determinação do índice CPO-D. Foi realizada a coleta da saliva estimulada até a obtenção de 3,0 mL. Parte da saliva foi utilizada para a análise microbiológica e parte foi centrifugada para obtenção do sobrenadante da saliva total (SST), aliquotada e armazenada em freezer -80ºC para as análises proteômica e de degradação. Os níveis salivares de Aggregatibacter actinomycetemcomitans e Porphyromonas gingivalis foram quantificados pela Reação em Cadeia da Polimerase em Tempo Real (qPCR). A análise espectrométrica foi realizada com os pools de saliva de cada um dos quatro grupos, os quais foram submetidos a nLC-ESI-MS/MS (Cromatografia Líquida por ionização electrospray Tandem Espectrometria de Massas). A degradação proteica foi realizada pela adição de histatina 1 e histatina 5 sintéticas ao SST diluído (1:10) e incubação à 37ºC pelos tempos 0, 0,5, 1,5, 4, 6, 8, 24 e 48 horas. Em seguida, foram realizadas as análises d... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: This study aimed to evaluate the proteomic profile and histatins 1 and 5 proteolysis in stimulated whole saliva of individuals with Down syndrome (DS) and non-syndromics (NS) in the presence and absence of periodontal disease (PD). Twenty-four individuals were selected and divided in the following groups (n=6): DS with PD (DSwPD), DS without PD (DSwtPD), NS with PD (NSwPD) and NS without PD (NSwtPD - control). First, periodontal condition and DMFT index were evaluated and 3.0 mL of stimulated whole saliva was collected. Then, part of whole saliva was used to microbiological analysis and the remaining samples were centrifuged in order to obtain the whole saliva supernatant (WSS), aliquoted and stored at -80ºC to proteomic and degradation assays. Levels of Porphyromonas gingivalis (Pg) and Aggregatibacter actinomycetemcomitans (Aa) were quantified by real-time polymerase chain reaction (qPCR). Spectrophotometric analyses were carried out with saliva pools of each group by using nLC-ESI-MS/MS (Liquid chromatography electrospray ionization tandem mass spectrometry). Protein degradation assay was carried out with synthetic histatins 1 or 5 added to WSS (1:10) followed by samples incubation at 37°C for 0, 0.5, 1.5, 4, 6, 8, 24 and 48 hours. Next, polyacrylamide cationic gel electrophoresis (PAGE) analysis and measurement of bands density (%) were performed. Kruskal-Wallis test complemented by Dunn's test was applied to analyze clinical and microbiological data. Total protein and hi... (Complete abstract click electronic access below) / Doutor

Les bactéries lactiques (BAL) ont été utilisées par l\'humanité depuis des siècles en raison de leurs propriétés technologiques et de leur capacité à améliorer les propriétés organoleptiques des aliments. En outre, la demande des consommateurs pour des produits laitiers sains et dépourvus de conservateurs chimiques est de plus en plus grande.Dans ce contexte, l\'utilisation de bactéries lactiques utilisées depuis des siècles pour la fermentation des produits laitiers semble pertinente pour améliorer la digestibilité et/ou prolonger la durée de vie des produits laitiers fermentés. L\'une des principales propriétés de ces bactéries est la production de substances antimicrobiennes telles que des bactériocines, des peptides ou des composés non protéiques de faible poids moléculaire (acides organiques, H2O2, et ainsi de suite) qui inhibent la croissance des pathogènes alimentaires et des micro-organismes d\'altération. Les bactériocines sont des peptides antimicrobiens ribosomiques produits entre autre par certaines bactéries lactiques et qui possèdent un spectre d\'inhibition étroit ciblant généralement les bactéries à Gram-positif. Les substances inhibitrices produites par BAL peuvent également inhiber les champignons qui sont en grande partie responsables pour la détérioration des aliments. Un autre propriété importante de BAL est de modifier les protéines du lait au cours du processus de fermentation. Ceci est important pour les personnes allergiques, en raison de la modification du potentiel allergénique de protéines du lait, mais également important pour la production de peptides bioactifs. Récentes découvertes ont montré que des peptides dérivés de l\'hydrolyse des protéines du lait peuvent avoir des activités biologiques, tels que des activités antihypertensives, antioxydantes, antimicrobiennes et immunomodulatrices. En résumé, les BAL sont des outils potentiels pour la production d\'aliments de haute qualité, ce qui stimule la recherche de nouvelles souches ayant des propriétés biologiques intéressantes. Ainsi, l\'objectif de cette étude était d\'isoler et de cribler de nouvelles souches de BAL possédant des activités antimicrobienne et / où protéolytique. Des souches de BAL ont ainsi été isolées de lait de vache, de buffle et de chèvre ainsi que des fromages provenant du sud-est du Brésil. À partir de 156 échantillons de lait et de fromages, 815 isolats ont été obtenus sur des géloses sélectives pour les BAL. La majorité d\'entre elles était des coques ou des bacilles à Gram-positif et négatif pour la production de catalase. La présence d\'activités antimicrobiennes a été évaluée sur des cultures pures de ces nouveaux isolats par des tests d\'antagonisme sur géloses (essai spot-on-the-lawn), et leurs activités protéolytiques on été évaluées par culture sur géloses BHI (Brian Heart Infusion) additionnée de lait écrémé. Les isolats les plus protéolytiques ont été testés par culture dans du lait écrémé suivie d\'une électrophorèse sur gel de polyacrylamide en condition dénaturante (sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis SDS-PAGE). Parmi les 815 isolats testés, quatre d\'entre eux, identifiés comme Lactobacillus paraplantarum FT 259 et Streptococcus uberis (FT86, FT126 et FT190) étaient producteurs de bactériocines, tandis que quatre autres, identifiés comme Weissella confusa FT424, Weissella hellenica FT476, Leuconostocs citreum FT671 et Lactobacillus plantarum FT723 ont montré une activité antifongique lors d\'essais préliminaires. Des analyses complémentaires ont montré que la souche la plus antifongique était L. plantarum FT723 qui inhibait Penicillium expansum sur gélose MRS modifiée (de Man, Rogosa, Sharpe, sans acétate) et dans un modèle de lait fermenté. Des activités protéolytiques ont été détectées dans 205 isolats lors des tests sur géloses supplémentées en lait écrémé. Les activités protéolytiques des 123 isolats présentant les activités les plus fortes ont été confirmées en faisant migrer les surnageants de laits fermentés sur SDS-PAGE. Les capacités protéolytiques des trois isolats les plus protéolytiques Enterococcus faecalis (FT132 et FT522) et Lactobacillus paracasei FT700 ont également été testées sur des caséines et sur deux protéines du lactosérum (?-lactoglobuline et d\'?-lactalbumine), les produits de dégradation ont été visualisés par SDS-PAGE. En raison de la grande similitude entre les deux souches d\'Enterococcus, seul E. faecalis FT132 et L. paracasei FT700 ont été sélectionnés pour des études plus poussées sur leurs activités protéolytiques en utilisant des protéines du lait comme substrats lors d\'incubations dans différentes conditions suivies de l\'analyse des produits d\'hydrolyse par SDSPAGE et par chromatographie liquide haute performance (high performance liquid chromatography, HPLC). Tant E. faecalis FT132 que L. paracasei FT700 ont montré des activités protéolytiques à un pH de 6,5, à des températures comprises entre 37 à 42 ºC. Leurs activités protéolytiques étaient dues à des métallo-protéases. Pour évaluer les activités biologiques possibles des peptides dérivés de l\'action d\'E. faecalis FT132 et L. paracasei FT700 sur les protéines du lait, les surnageants des laits fermentés par ces souches ont été purifiés sur colonnes C8 puis lyophilisés. Ces lyophilisats ont ensuite été repris dans du RPMI (Roswell Park Memorial Institute medium) et ajoutés à différentes cultures primaires (monocytes et macrophages) pour évaluer leur cytotoxicité, les mécanismes de la mort celullaire qui y étaient associés, ainsi que leurs propriétés immunomodulatrices (différenciation des monocytes en macrophages et quantification de TNF-?). Les peptides générés par les deux souches testées étaient toxiques (favorisant l\'apoptose des cellules) après 72 h d\'exposition à une concentration de 10 mg/mL. Au-dessous de ces concentrations cytotoxiques, les deux surnageants de laits fermentés produits par E. faecalis FT132 et L. paracasei FT700 ont stimulé la différenciation des monocytes en macrophages, comme observé par l\'expression accrue du marqueur CD71. Cette stimulation du système immunitaire n\'était pas inflammatoire en raison de la faible production de TNF-?. Certaines BAL peuvent contribuer à la santé des consommateurs et sont utilisées comme probiotiques. Cependant, les effets biologiques des souches ainsi que leur innocuité doivent être vérifiés avant leur utilisation comme probiotiques. Contrairement aux entérocoques, plusieurs espèces de lactobacilles sont reconnues comme GRAS (Generally Recognized as Safe). Dans cette étude, il a été montré que la souche E. faecalis FT132 hébergeait trois gènes de virulence asa1, as et gelE, et qu\'elle était résistante à l\'érythromycine et à la tétracycline, ce qui signifie que cette souche ne peut pas être ajoutée à des produits alimentaires. Cependant, L. paracasei FT700 pourrait d\'avéré un candidat potentiel pour être utilisée en tant que probiotique, ainsi que L. paraplantarum FT259, la souche bacteriocinogénique décrite précédemment. Afin d\'évaluer leur capacité de survie dans le tractus digestif en vu d\'une éventuelle utilisation comme probiotiques, les souches ont été incubées dans des milieux de culture acidifiés (pH 2,0, 2,5 et 3,5), dans des sels biliaires, dans des conditions simulant les conditions gastriques et leur capacité de survie a été testée ainsi que leur sensibilité à différents antibiotiques. En outre, la bactériocine produite par L. paraplantarum FT259 a été partiellement purifiée sur colonne remplie de résine XAD-16, suivie d\'une extraction en phase solide sur colonne C18, suivie d\'une analyse par SDS-PAGE. Des PCR avec différentes amorces ciblant la plantaricine NC8, la plantaricine S et la plantaricine W ont été effectuées suivie du séquençage des amplicons afin d\'idéntifier des gènes pour la production de bactériocines. Les résultats ont montré que L. paraplantarum FT259 tolérait des expositions à un pH de 3,5, et à une concentration en sels biliaires de 0,3% pendant une durée maximum de 180 minutes. En revanche, il n\'était plus possible de détecter de cellules viables (limite de détection de la méthode : 100 UFC / mL) après une exposition à des pH de 2,0 et de 2,5 pendant 90 minutes. Lors des expériences simulant les conditions gastriques, le nombre de cellules viables de L. paraplantarum FT259 a diminué de 8,6 log UFC/mL à 4,4 log UFC/mL après 180 minutes d\'incubation. Les résultats obtenus pour la souche L. paracasei FT700 ont montré que celle-ci a survécut à presque toutes les conditions. Après 180 minutes dans un pH de 2,0 et dans le jus gastrique simulé, la population bactériennes ont respectivement diminué de 4 et de 3 log UFC/mL. Il a également été démontré que L. paraplantarum FT259 et L. paracasei FT700 étaient sensibles à la majorité des antibiotiques testés. L\'analyse par SDS-PAGE a indiqué que la bactériocine partiellement purifiée présentait une masse moléculaire d\'environ 3900 Da et que le séquençage des amplicons d\'ADN suite aux PCR a montré que la souche possédait le gène de la plantaricine NC8. L\'ensemble de ces résultats indique que les deux souches de lactobacilles isolées lors de cette étude (L. paraplantarum FT259 et L. paracasei FT700) possèdent des caractéristiques pouvant leur conférer un intérêt d\'utilisation en tant queprobiotiques. La production de bactériocines (L. paraplantarum FT259), et l\'activité protéolytique (L. paracasei FT700) pourraient également être des caractéristiques intéressantes pour des applications alimentaires. En conclusion, les BAL obtenues dans cette étude pourraient être utiles dans l\'industrie alimentaire pour la production de nouveaux produits laitiers à durée de conservation prolongée et une digestibilité accrue, ou encore pour la production de peptides bioactifs. / As bactérias láticas (BAL) têm sido utilizadas pela humanidade há séculos devido às suas propriedades tecnológicas e potencial para conferir características sensoriais agradáveis aos alimentos. Além disso, é cada vez maior a demanda por alimentos de qualidade. Neste contexto, BAL tem grande potencial para serem utilizadas na produção de alimentos. Uma das principais características destas bactérias é a produção de substâncias que inibem a multiplicação de agentes patogênicos e micro-organismos deteriorantes em alimentos, tais como ácidos orgânicos, H2O2 e bacteriocinas. Estas últimas são um peptídeos antimicrobianos produzido via ribossomo por algumas bactérias e possuem pequeno espectro inibição. As bacteriocinas podem reduzir a multiplicação de bactérias-alvo, aumentando a segurança alimentar e a vida de prateleira de alimentos. Essas substâncias inibitórias produzidas por BAL podem também inibir fungos, que são em grande parte responsáveis pela deterioração dos alimentos. Outra importante propriedade das BAL é capacidade de modificar as proteínas do leite durante o processo de fermentação. Isto é importante para indivíduos alérgicos devido à alteração de potencial alergênico das proteínas do leite, e também é importante para a produção de peptídeos bioativos. Recentemente, resultados demonstraram que os peptídeos obtidos a partir da hidrólise de proteínas do leite podem ter diferentes atividades biológicas, tais como anti-hipertensiva, antioxidante, antimicrobiana e imunomodulatória. Em resumo, BAL apresentam potencial para a produção de alimentos de alta qualidade, o que estimula a busca de novas linhagens com propriedades tecnológicas de interesse. Assim, no presente estudo, BAL com atividade antimicrobiana e / ou proteolítica foram isoladas de leite e queijo de vaca, búfala e cabra, obtidos na região sudeste do Brasil. A partir de 156 amostras de leite e queijo, foram obtidos 815 isolados em ágar seletivo para BAL. A maioria eram cocos ou bacilos Gram-positivos, e não produziam a enzima catalase. Culturas puras destes novos isolados foram avaliadas quanto a atividade antimicrobiana por testes de antagonismo em ágar (spot-on-the-lawn), e quanto a atividade proteolítica sobre proteínas do leite pelo cultivo em placas de ágar BHI (Brain Heart Infusion suplementado com leite desnatado). Os isolados com maior atividade proteolítica também foram testados pelo cultivo em leite desnatado seguido de análise do leite fermentado por eletroforese em gel de poliacrilamida com dodecil sulfato de sódio (sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis SDS-PAGE). Entre os 815 isolados testados, quatro deles foram identificados como produtores de bacteriocinas, Lactobacillus paraplantarum FT259 (uma linhagem) e Streptococcus uberis (três linhagens, FT86, FT126 e FT190), enquanto quatro outros identificados como Weissella confusa FT424, W. hellenica FT476, Leuconostoc citreum FT671 e Lactobacillus plantarum FT723, os quais apresentaram atividade antifúngica em ensaios preliminares. Análises complementares mostraram que a linhagem com maior atividade antifúngica foi L. plantarum FT723, o qual inibiu Penicillium expansum em ágar MRS modificado (De Man, Rogosa, Sharpe, sem acetato) e em iv modelo de leite fermentado. No entanto, nenhuma inibição foi observada contra Yarrowia lipolytica. A atividade proteolítica foi detectada em 205 isolados por testes em ágar, sendo que 123 isolados com intensa atividade proteolítica foram submetidos a confirmação da atividade por SDS-PAGE. As atividades proteolíticas de três isolados identificados como Enterococcus faecalis (FT132 e FT522) e Lactobacillus paracasei FT700 foram confirmadas por SDS-PAGE, como visualizado pela digestão de caseínas e proteínas de soro de leite (?-lactoglobulina e ?- lactalbumina). No entanto, devido à alta semelhança entre as linhagens, apenas E. faecalis FT132 (juntamente com L. paracasei FT700) foram selecionados para os próximos estudos utilizando proteínas do leite como substratos em diferentes condições, seguidas de análises por SDS-PAGE e cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC, high-performance liquid chromatography). Ambos E. faecalis FT132 e L. paracasei FT700 apresentaram atividades proteolíticas em pH 6,5, entre 37 e 42 °C. A atividade proteolítica das linhagens foi devida à presença de metaloproteases. Em seguida, para avaliar as possíveis atividades biológicas dos peptídeos derivados da atividade proteolítica de E. faecalis FT132 e L. paracasei FT700 em proteínas do leite, o sobrenadante de leite fermentado produzido por estas linhagens foi purificado em cartucho C8 e liofilizado. Desse modo, os sobrenadantes de leite fermentado produzidos por estas linhagens foram adicionados às culturas de células (monócitos e macrófagos) para avaliar a sua citotoxicidade, os mecanismos de morte celular, propriedades imunomoduladoras (diferenciação de monócitos em macrófagos) e quantificação de TNF-? (do inglês tumor necrosis factor). Os sobrenadantes apresentaram toxicidade após 72 h de exposição a 10 mg/mL por apoptose. Abaixo das concentrações citotóxicas, ambos os sobrenadantes de leite fermentado estimularam a diferenciação de monócitos em macrófagos, como observado pelo aumento da expressão do marcador CD71. Esta estimulação imune não foi inflamatória visto que houve pouca produção de TNF-?. BAL também podem contribuir para a saúde dos consumidores quando utilizadas como probióticos. No entanto, algumas características das linhagens devem ser verificadas antes de serem utilizadas como probióticos, especialmente com relação aos fatores de virulência. Lactobacilos geralmente possuem um status GRAS (do inglês generally recognized as safe), ao contrário dos enterococos. Neste estudo, foi demonstrado que E. faecalis FT132 possuía três genes de virulência, asa1, ace e gelE, e que era resistente à eritromicina e à tetraciclina, indicando que esta linhagem não pode ser adicionada em alimentos. No entanto, L. paracasei FT700 seria um potencial candidato para ser utilizada como probiótico, bem como a linhagem bacteriocinogênica descrita anteriormente, L. paraplantarum FT259. As linhagens foram testadas quanto à sobrevivência em meio ácido (pH 2,0, 2,5 e 3,5), tolerância in vitro aos sais biliares, viabilidade em suco gástrico sintético e sensibilidade a antibióticos. Além disso, o peptídeo antimicrobiano produzido por L. paraplantarum FT259 foi parcialmente purificado em coluna preenchida com resina XAD-16, seguido de extração em fase sólida com cartucho de C18, e analisados por SDSPAGE. Reações em cadeia da polimerase (PCR, do inglês polymerase chain reaction) com primers para os genes estruturais da plantaricina NC8, plantaricina S e plantaricina W, seguidas de sequenciamento de DNA, foram realizados para detectar genes responsáveis pela produção de bacteriocinas. Os resultados mostraram que L. paraplantarum FT259 foi resistente ao pH 3,5 e a 0,3% de sais biliares por até 180 minutos, mas a população bacteriana em pH 2,0 e 2,5 após 90 minutos estava abaixo do limite de detecção do método (2 log UFC/mL). Em testes utilizando suco gástrico sintético, a população de L. paraplantarum FT259 reduziu de 8,6 log UFC/ v mL para 4,4 log UFC/mL após 180 minutos. Por outro lado, L. paracasei FT700 sobreviveu bem em quase todas as condições. Depois de 180 minutos em pH 2,0 e em suco gástrico sintético, a população bacteriana reduziu 4 e 3 log UFC/mL, respectivamente. Também foi demonstrado que L. paraplantarum FT259 e L. paracasei FT700 foram sensíveis à maioria dos antibióticos testados. A análise de SDS-PAGE indicou que a bacteriocina parcialmente purificada apresentava uma massa molecular de aproximadamente 3900 Da, e o sequenciamento de DNA do produto de amplificação obtido por PCR mostrou a presença do gene que codifica a produção da plantaricina NC8. De modo geral, os resultados indicaram que ambas as linhagens possuem potencial probiótico. Além disso, a produção de bacteriocinas (L. paraplantarum FT259) e a atividade proteolítica (L. paracasei FT700) podem ser características interessantes para aplicações em alimentos. As BAL obtidas neste estudo podem ser úteis na indústria de alimentos para a produção de novos produtos lácteos com maior vida de prateleira e aumento da digestibilidade de proteínas do leite, assim como para a produção de peptídeos bioativos comercializados como fórmulas parcialmente purificadas.

O presente trabalho teve como objetivo geral estudar a qualidade de carne (Longissimus dorsi) de machos inteiros da raça Nelore através de análise proteômica bidimensional. Para tanto, dois objetivos específicos foram propostos: (i) estudar a proteólise das carnes em diferentes tempos de maturação, no caso um, sete e 14 dias, e (ii) estudar o perfil protéico das carnes de bovinos machos inteiros Nelore com genótipos contrastantes para maciez, em diferentes tempos de maturação (um, sete e 14 dias), associados aos marcadores moleculares CAPN4751 (μ-calpaína) e UOGCAST1 (calpastatina). Amostras de sangue foram coletadas para realização de análises genotípicas. Para as análises eletroforéticas e de maciez, amostras maturadas por um, sete e 14 dias foram coletadas. A caracterização e determinação dos genótipos polimórficos (SNP) para os marcadores CAPN4751 e UOGCAST1 foram realizadas por meio de PCR em tempo real. Seis pools de amostras de animais foram preparados para a realização de eletroforese bidimensional. As análises estatísticas foram realizadas no pacote Statistical Analysis System(SAS). Foram encontrados 256 spots em comum na análise de proteólise, sendo 25 significativos (P<0,05). Na análise de regressão múltipla, sendo maciez a variável dependente e os spots significativos a variável independente, foi possível verificar que 13 spots explicaram em 73% a variação de maciez durante a maturação. As análises de variância da intensidade para os volumes de expressão normalizados (IVEN) indicaram 21 spots significativos (P<0,05) para os marcadores CAPN4751 e UOGCAST1. Análises de regressão múltipla para os spots significativos mostraram que alguns spots, além dos marcadores estudados, podem predizer a maciez da carne aos 14 dias de maturação. Portanto, as avaliações de spots permitirão identificar as proteínas diferencialmente expressas, auxiliando no melhor entendimento do complexo mecanismo que determina a maciez da carne. / The present work aimed to study beef quality (Longissimus dorsi) from Nellore bull through two-dimensional proteomic analysis. For this purpose, two specific objectives were proposed: (i) to study the proteolysis of meat at different aging times, if 24 hours, seven and 14 days, and (ii) to study the protein profile of meat from Nellore bull with contrasting genotypes for tenderness at different aging times (24 hours, seven and 14 days), associated with molecular markers CAPN4751 (μ-calpain) and UOGCAST1 (calpastatin). Blood samples were collected for genomic analyses. For electrophoretic analysis and tenderness, samples aged for 24 hours, seven and 14 days were collected. The characterization and determination of genotypes polymorphic (SNP) markers for CAPN4751 and UOGCAST1 were performed using real time PCR. Six samples of animals pools were set up to carry out two-dimensional electrophoresis. Statistical analyzes were performed in the package Statistical Analysis System (SAS). 256 spots were found in common in the analysis of proteolysis, with 25 spots significant. We found that 13 spots accounted for 73% of the variation in tenderness during aging. Analyses of variance of the intensity of expression for the normalized volumes (IENV), 21 spots indicated significant (P<0,05) for the markers CAPN4751 and UOGCAST1. Multiple regressions analysis to significant spots showed to some spots, in addition to the markers studied may predict meat tenderness at 14 days of aging. Therefore, the assessments will identify the spots differentially expressed proteins, aiding in better understanding the complex mechanism that determines the softness of the meat.

A expressão do PIF/DCD em tumores tem sido relacionada ao crescimento e resistência à morte celular e à indução de caquexia em camundongos. O objetivo deste estudo foi investigar o papel do PIF/DCD nestes processos. Foram construídos três PIF/DCD-RNAi chamados de IBC-I, II, III e pKLO (controle), compreendendo diferentes áreas do mRNA, geramos clones celulares PIF/DCD-RNAi e comparamos a expressão do mRNA por RT-PCR em tempo real. Depois, foi avaliado o crescimento e formação de colônias dos clones RNAi in vitro e a progressão tumoral in vivo em camundongo Nude. Os RNAi IBC-I, II e III reduziram a expressão em 93,25% dos transcritos do PIF/DCD, alem de reduzir em 61,7% a capacidade de formação de colônias em comparação ao controle (p<0.001). Nos experimentos in vivo, os camundongos 2 meses do grupo pKLO tiveram um retardo no desenvolvimento muscular. O grupo pKLO de 8 meses apresentou uma redução de 35% do seu peso. Ambos mostraram diminuição da massa muscular (p<0,05). Estes resultados confirmam o papel do PIF/DCD na progressão tumoral. / The PIF/DCD expression in tumors has been related to the growth and resistance to cellular death and induction of cachexia in mice. The aim of this study was to investigate the role of PIF/DCD in these processes. It was designed three PIF/DCD-RNAi named IBC-I, II and III and one control pKLO, comprising different areas of the mRNA. Next, it was generated PIF/DCD-RNAi cell clones and compared mRNA expression by RT-PCR real time. After that, we evaluated the growth and colony formation ability of RNAi clones in vitro and in vivo tumorogenicity in Nude mice. The IBC-I, II and III RNAi reduced in 93,25% the expression of transcripts for PIF/DCD. There was also a significant reduction (61,7%) in the colony formation compared to the control (p<0.001). In the in vivo experiments, the 2-month-old mice in the pKLO group had muscular development retardation. The 8-month-old pKLO group presented a 35% reduction on its weight. Both groups had shown muscular mass reduction (p<0,05). These results confirm the role of PIF/DCD in the tumoral progression.

Candida spp. se tornaram, nas últimas décadas, importantes agentes causadores de infecções invasivas, responsáveis por altos índices de morbidade e mortalidade. Acredita-se que a aspartato protease secretada (Sap) seja um fator diretamente associado aos processos infecciosos exercendo papel determinante na patogenicidade de Candida spp. e que a exposição a concentrações subinibitórias de antifúngicos, pode aumentar a produção de Sap e selecionar isolados resistentes. Analisaram-se isolados de Candida albicans e Candida não-albicans oriundos de casos de infecção hospitalar. Avaliou-se o perfil proteico destes isolados por eletroforese SDS-PAGE. Avaliou-se, também, o perfil de sensibilidade dos isolados frente a antifúngicos de uso convencional em esquemas terapêuticos (fluconazol e anfotericina B) e a antifúngicos mais novos que ainda não fazem parte das rotinas hospitalares (voriconazol e caspofungina). Determinou-se a atividade proteolítica qualitativa e quantitativa de Sap e atividade metabólica de C. albicans e Candida não-albicans cultivados na presença e ausência de concentrações subinibitórias de fluconazol e anfotericina B. Estabeleceu-se a correlação entre os testes e por fim, avaliou-se a expressão do gene SAP2 em C. albicans ATCC 64548 e C. krusei ATCC 6258. 100% dos isolados foram sensíveis a anfotericina B, voriconazol e caspofungina e 89,9% a fluconazol. Dois isolados (7,4%) apresentaram sensibilidade dependente da dose e um (3,7%) apresentou resistência ao fluconazol. Na análise qualitativa da atividade proteolítica, 77,7% dos isolados apresentaram atividade. A maioria dos isolados de C. albicans (50%) e Candida não-albicans (32%) apresentou atividade proteolítica moderada. A adição de fluconazol ao cultivo não promoveu alterações significativas na atividade proteolítica dos isolados padrões, enquanto anfotericina B inibiu o crescimento de C. glabrata ATCC 90030 e C. krusei ATCC 6258. Na análise quantitativa, todos os isolados se apresentaram ativos, sendo que a maior atividade foi observada em Candida complexo “psilosis” 210 (100%) e a menor em C. albicans 257 (2,44%). A maioria dos isolados de C. albicans (50%) foi classificada como fracamente proteolítica, enquanto Candida não-albicans (53%) como moderadamente proteolítica. A presença de antifúngicos no cultivo alterou significativamente o percentual de degradação da maioria dos isolados. A maior diferença de percentual foi observada em C. lusitaniae 286, que na presença de ¼ da IC90 de anfotericina B aumentou 13,7x em relação à ausência do fármaco. O método quantitativo de determinação da atividade proteolítica apresentou maior sensibilidade. 63% dos isolados de C. albicans apresentaram alta atividade metabólica e 68% de Candida não-albicans, atividade moderada. A maior atividade metabólica foi observada em C. albicans 120 (61,72%) e a menor em C krusei ATCC 6258 (2,35%). A atividade metabólica da maioria dos isolados foi significativamente alterada. A maior diferença de percentual foi observada em Candida complexo “psilosis” 210, que na presença de ½ da IC50 de fluconazol apresentou redução de 8x na atividade metabólica em relação à ausência do fármaco. Houve expressão de SAP2 apenas em C. albicans ATCC 64548, que foi reduzida significativamente na presença de ¼ da IC90 de anfotericina B. A atividade de Sap pode ser considerada um fator potencial associado à virulência, uma vez que o isolado que apresentou a maior atividade apresentou sensibilidade antifúngica reduzida. / Candida spp. has become in recent decades, major causative agents of invasive infections, responsible for high rates of mortality and morbidity. It is believed that the secreted aspartate protease (Sap) is a factor directly associated with infection exerting decisive role in the pathogenicity of Candida spp. and that the exposure to subinibitory concentrations of antifungals may increase the production of Sap and to select resistant isolates. We analyzed isolates of Candida albicans and Candida non-albicans from cases of hospital infection. We evaluated the protein profile of the isolates of Candida spp. by SDS-PAGE. We evaluated also the susceptibility profile of the isolates against antifungals of use conventional in regimens therapeutics (fluconazole and amphotericin B) and newer antifungals that are not yet part of the hospital routine (voriconazole and caspofungin). It was determined the proteolytic activity qualitative and quantitative of Sap and metabolic activity of isolates of C. albicans and Candida non-albicans grown in the presence and absence of subinhibitory concentrations of fluconazole and amphotericin B. Was established the correlation between the tests and, finally, the expression of the SAP2 gene in C. albicans ATCC 64548 and C. krusei ATCC 6258 was evaluated. 100% of the isolates were susceptible to amphotericin B, voriconazole and caspofungin and 89.9% to fluconazole. Two isolates (7.4%) showed susceptibility dose dependent and one (3.7%) showed resistance to fluconazole. In the qualitative analysis of proteolytic activity, 77.7% of the isolates showed activity. The most isolates of C. albicans (50%) and Candida non-albicans (32%) had moderate proteolytic activity. The addition of fluconazole to culture did not promote significant changes in the proteolytic activity of the isolates patterns, while amphotericin B inhibited the growth of C. glabrata ATCC 90030 and C. krusei ATCC 6258. In quantitative analysis, all isolates were active, being that the highest activity was observed in Candida complex “psilosis” 210 (100%) and the lowest in C. albicans 257 (2.44%). The most of the C. albicans isolates (50%) were classified as weakly proteolytic, while Candida non-albicans (53%) as moderately proteolytic. The presence of antifungals in the culture significantly changed the percentage of substrate degradation of the most of isolates. The greatest difference of percentage was observed in C. lusitaniae 286, which in the presence of ¼ IC90 of amphotericin B increased 13.7x regarding to absence of the drug. The quantitative method of determining the proteolytic activity presented greater sensitivity. 63% of the isolates of Candida albicans showed high metabolic activity and 68% of Candida non-albicans had moderate activity. The higher metabolic activity was observed in C. albicans 120 (61.72%) and lowest in C krusei ATCC 6258 (2.35%). The metabolic activity of the most of the isolates was significantly altered. The major difference of percentages was observed in Candida complex “psilosis” 210, which in the presence of ½ IC50 of fluconazole showed reduction of 8x in the metabolic activity regarding to absence of the drug. There was expression of SAP2 only in C. albicans ATCC 64548, which was significantly reduced in the presence of ¼ IC90 of amphotericin B. The Sap activity may be considered a potential factor associated to virulence, once that the isolate that showed the greatest activity showed susceptibility reduced. / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES

O objetivo deste estudo foi investigar os efeitos do T3 e do seu análogo GC-24, agonista TR<font face=\"symbol\">b seletivo, na proteólise muscular mediada pela via ubiquitina-proteassoma. Avaliamos o efeito do T3 e GC-24 no trofismo radial de fibras musculares, no nível de ubiquitinação e na expressão de genes envolvidos na via ubiquitina-proteassoma. Para tanto foram utilizados, ratos Wistar divididos em 4 grupos (Controle, 12 horas, 1 e 7 dias) e tratados com T3 e GC-24. Determinou-se a área de secção transversa dos cortes histológicos através do programa \"Image Pro-Plus\". O nível de ubiquitinação foi determinado através de Western Blot para proteína ubiquitinada e a expressão gênica por PCR em Tempo real. T3 e GC-24 promoveram redução do diâmetro das fibras musculares e aumentaram o nível de proteínas ubiquitinadas em ambos os músculos. Com relação à expressão gênica, T3 e GC-24 modularam a expressão dos genes analisados de maneira diferenciada, demonstrando que GC-24 é capaz de modular genes pouco ou não responsivos ao T3. / Triiodothyronine (T3) is known to play a key role in the function of several tissues/organs via the thyroid hormone receptor isoforms a/pha (TRa) and beta (TRI3). Abnormalities in skeletal muscle function have been associated with increased leveis of T3, which is a major sarcopenia (Ioss of sarcomeres). Although the phenomenon of sarcopenia induced by T3 has been widely reported, little is known about the molecular mechanisms invo/ved in proteolysis induced by T3. In this study we have investigated the effects of T3 and GC-24, a novel synthetic TRI3¬selective compound, on the ubiquitin proteasome pathway. We analyzed the effect of T3 and GC-24 on the radial trophism, ubiquitination leveis and gene expression of the ubiquitin-proteasome pathway, which are important regulators of muscle proteolysis in the skeletal muscle. We have addressed the ubiquitin ligases (Atrogin¬1, MuRF-1 and E3a) and the deubiquitinating enzymes (UBP45, UBP69 and USP28). Wistar male rats (170-200g) were divided in 4 groups (Control, 12, 1 and 7 days). Rats received T3 (30l-\'g/100g) and GC-24 (16 I-\'g/1 OOg). After decapitation, EDL and soleus muscles were removed for histological ana/ysis, protein expression and gene expression. Cross sectional area was determined in histological sections through the software \"Image-Pro Plus. The ubiquitination leveis was determined by Western Blot and gene expression determined by Real Time PCR analysis. T3 and GC-24 reduced the diameter of the muscle fibers vs control group. Both T3 and GC-24 incresed the ubiquitination leveis, in the soleus and EDL. Regarding gene expression analysis, T3 and GC-24 modulate the gene expression in a differential manner. In the soleus, T3 increased Atrogin-1 and E3 alpha gene expression, while did not alter Murf-1 gene expression. On the other hand, in EDL Atrogin-1 gene expression is not altered, while E3 alpha and Murf-1 are elevated by T3. In the soleus and EDL deubiquitinating gene expression is mostly not altered, exception made for UBP 45, which is reduced by T3 in soleus muscle. GC-24, increased gene expression of E3a and MuRF-1 in the soleus, while did not alter Atrogin-1 gene expression. However, in EDL muscle, GC-24 increased Atrogin-1 and E3a mRNA, while did not alter MuRF-1. Finally, GC-24 decreased UBP 45 gene expression in EDL muscle and USP 28 gene expression was robustly elevated by GC-24 in both muscles analyzed. This data shows that GC-24 is able to strongly modulate genes that are less responsive or even unresponsive to T3, pointing that the GC-24-TRb complex might trans-activate differently target genes. However, both T3 and GC-24 are able to modulate the muscle proteolysis.

O pH final (pHf) no músculo post mortem é amplamente utilizado como um indicador potencial de maciez e é um fator importante associado à qualidade de carne. O Brasil é líder mundial nas exportações de carne bovina, porém não são conhecidos os valores de pHf do músculo pós-abate e seu impacto na qualidade da carne de animais machos inteiros Bos taurus indicus. Baseado no exposto, objetivou-se com este trabalho identificar o atual \"status\" dos valores de pHf 24 h post mortem apresentados no frigorífico comercial, e a influência do pHf na proteólise muscular e parâmetros de qualidade como perda por gotejamento, cor e maciez de machos inteiros avaliados aos 0, 7, 14, 21 e 28 dias de maturação. Foi realizado um estudo preliminar, com 399 carcaças em abatedouro comercial, para conhecer a ocôrrencia pHf de animais machos inteiros abatidos no Brasil, podendo-se identificar três faixas de pHf: pHf 5,5 até 5,8 (baixo-normal); pHf 5,81 até 6,3 (intermediário); pHf > 6,3. Músculos Longissimus dorsi (n=12) foram porcionados em bifes, embalados a vácuo, classificados nos três diferentes grupos de pHf e maturados a 2°C por 0 (48h), 7, 14, 21 e 28 dias. Foram avaliadas características de perda por gotejamento, cor, força de cisalhamento, índice de fragmentação miofibrilar, colágeno total e solúvel, assim como proteólise miofibrilar. Carnes pertencentes ao grupo de pHf alto, apresentaram maior maciez (P<0,05) desde o início do experimento, quando comparado aos outros grupos do estudo. Bifes de pHf intermediário apresentaram os valores de força de cisalhamento mais elevados (P<0,05), o que indica um processo de maciez mais lento quando comparado com os outros grupos de pHf. Perdas por gotejamento, diminuem com o aumento nos valores de pHf (P< 0,05). Valores de L*, a*, b*, não apresentam diferenças entre os grupos de pH. O índice de fragmentação miofibrilar (MFI) foi maior em carne de pHf alto, seguido pelo grupo de pHf baixo-normal, e os menores valores pertenceram ao grupo de pHf intermediário (P<0,05) através do tempo de maturação. A degradação das proteínas como desmina e troponina-T foi maior e mais visível no pHf alto e baixo-normal desde as 48 h post mortem em comparação com o pHf intermediário, onde foram observadas as bandas de sua degradação quase ao final do período experimental. Proteínas chave como filamina e nebulina apresentaram maior degradação desde as 48 horas post mortem no pHf alto e mais lenta no pHf intermediário. Não foram observadas diferenças (P> 0,05) nos valores de colágeno total e solúvel nos diferentes grupos de pHf e nem através do tempo de maturação. Em geral, o grupo de pHf intermediário (5,8-6,3) apresentou maior inconsistência quanto às características de maciez e fragmentacão miofibrilar, consequência de uma proteólise tardia. / The ultimate pH (pHu) of the postmortem muscle is broadly use as a potential meat tenderness indicator and is an important factor related to meat quality. Brazil is the bovine meat exporter world leader; nevertheless the values of the postmortem pHu of the muscle and its impact on the meat quality of Bos indicus taurus bulls, are unknown. Therefore, the objective of this research was to establish the values of pHu after 48 hours postmortem and its impact over the meat quality through the characterization of the biochemical processes that occurs in the muscle Longissimus dorsi of Bos taurus indicus bulls. In order to know the actual pHu of the Brazilian bulls, a preliminary study were made, using 399 carcasses of a commercial slaughter house and resulting three levels of pHu: pHu 5,5 to 5,8 (low-normal); pHu 5,81 to 6,3 (intermediate); pHu > 6,3 (high). Twelve muscles Longissimus dorsi were cut into steaks, classified into the three groups of pHu, vacuum packed up and matured at 2°C for 0 (48h), 7, 14, 21 and 28 days. Drip loss, color, shear force, myofibril fragmentation index, total and soluble collagen and miofibrillar proteolysis were evaluated. The high pHu meat presented more tenderness from the beginning of the experiment (P<0,05) when compared with the other groups. The medium pHu steaks presented the highest shear force values (P<0,05), indicating a slower tenderization process in relation to the other pHu groups. The drip loss values diminished as the value of pHu rised (P< 0,05). The values of L*, a*, b* did not show significant differences within the groups of pHu. The highest miofibrillar fragmentation index (MFI) through the maturation time, was found in the high pHu meat, followed by the low pHu group and then by the intermediate pHu group (P<0,05). At 48 hours postmortem, degradation of proteins, like desmin and troponin-T, was higher and more evident in the high and low-normal pHu when compared to the intermediate pHu, where the bands and its degradation were only observed by the end of the experiment. Key proteins like filamin and nebulin, showed higher degradation rate from the 48 h postmortem in the high pHu group, and a slower degradation in the intermediate pHu group. No differences were observed through the pHu groups, nor through the maturation time (P<0,05), for total and soluble collagen values. Then, it is possible to say that the meat quality of Bos taurus indicus bulls, especially the tenderness, is related to the pHu, and can be affected by the proteolytic systems activity. In general, the tenderness and the MFI were more inconsistent in the medium pHu group (5,8-6,3) than in the two other pHu groups, as a consequence of a late proteolysis.