Apusozoa (Protozoa) is a phylum of heterotrophic gliding zooflagellates of unknown taxonomic affiliation, commonly observed in environmental samples. Almost nothing was previously known about the diversity and ecology of apusozoan species though, as bacterivores, they are probably important functional constituents within microbial assemblages. We explored apusozoan morphological and genetic diversity, ecology, and related methodological questions. By culturing environmental material from a range of habitats, we isolated and maintained monocultures of both previously described apusozoan orders, Apusomonadida (apusomonads) and Planomonadida (planomonads). For planomonads, we present a revised taxonomy based on morphology, ultrastructure, and 18S rDNA genetic differences. We describe nine new species and new genera Nutomonas and Fabomonas, and demonstrate ITS2 rDNA secondary structure analysis for species delineation. During our culturing effort, we also isolated two genotypes of a previously unknown flagellate group, shown here to belong to a novel third apusozoan order, Mantamonadida. We designed molecular probes specific to all three orders and applied them to environmental DNA, detecting novel 18S and ITS1 rDNA lineages in a range of habitats. We mined publically available metagenomic and metatranscriptomic sequence databases using 18S rDNA of described species as seeds, identifying hundreds of sequences with affinities to all three orders. Phylogenies featuring newly retrieved lineages with previously described species suggest that direct sequencing of transcriptomic material is more effective than amplification-dependent methods at detecting rare cells in mixed microbial assemblages. Finally, to test potential future applications of our newly isolated strains, we ran microcosm experiments examining the effect of protozoan (Cercozoa) grazing on the structure of bacterial assemblages, demonstrating that closely related and morphologically similar species can have different impacts on their prey base. Taken together, by combining traditional culturing and modern molecular methods, this thesis drastically improves our understanding of apusozoan diversity and sets the scene for future work using next-generation sequencing and ecologically driven functional experiments.

Rumen microbiota enable dairy cattle to breakdown fiber into useable energy for milk production. Rumen bacteria, protozoa, and fungi ferment feedstuff into volatile fatty acids (VFA), the main energy source, while methanogens utilize fermentation by-products to produce methane. Milk fat contains several bioactive rumen-derived fatty acids (FA), including odd-chain FA (OCFA) and branched-chain FA (BCFA), important for maintenance of human health. The overarching dissertation goal was to determine which factors affect rumen methanogen and protozoal community structures and their metabolism products, while defining relationships between rumen microbiota and animal performance. Results presented contribute to the goals of providing new knowledge to dairy farmers, maintaining ruminant health, and enhancing bioactive FA in milk. The first objective was to use next-generation sequencing techniques to determine if lactation stage and dairy breed affect rumen methanogen and protozoal community structures and protozoa cell FA compositions in Jersey, Holstein, and Holstein-Jersey crossbred cows at 3, 93, 183, and 273 days in milk (DIM). A core methanogen community persisted by lactation stage and breed. At 3 DIM, methanogen 16S rRNA gene sequences formed distinct clusters apart from 93, 183, and 273 DIM, reflective of the dietary transition period post-partum. The starch-utilizing protozoal genus Entodinium, was more abundant in Holsteins than in Jerseys and Holstein-Jersey crossbred cows and positively correlated with milk yield. Jerseys had greater iso-BCFA contents in protozoa and milk and protozoa of the genus Metadinium. The second objective was to determine if supplementation of mixed cool-season grasses with annual forages (AF) alters the forage, microbial, and milk FA contents during typical periods of decreased pasture growth in Northeastern US. In short-term grazing (21d) of AF, ruminal VFA and major rumen-derived FA were not altered in bacterial and protozoal cells, suggesting little alteration of biohydrogenation and maintenance of ruminant health. In spring, milk contents of iso-15:0 and 17:0 per serving of whole milk were greater in control (CON)-fed cows, while contents of 12:0 and 14:0 per serving were greater in AF-fed cows. Contents of de novo FA and OCFA per serving of whole milk were greater in summer AF-fed cows than CON-fed cows, while total contents and BCFA did not differ, suggesting post-ruminal FA modifications in adipose tissue and the mammary gland. The third objective was to characterize and relate the rumen microbiota from CON- and AF-fed cows to animal performance. Rumen protozoal taxa were not altered, while less abundant bacterial taxa (< 5%) were different in both periods. The protozoal genus Diplodinium was positively correlated with feed efficiency and milk fat yield. In spring, AF-fed cows had greater abundances of the methanogen species Methanobrevibacter millerae, whereas CON-fed cows had greater abundances of the methanogen species Methanobrevibacter ruminantium, potentially as a result of differences in substrate availability. In conclusion, the work presented identifies several factors that influence rumen microbiota, rumen microbial FA, and milk FA, while providing new information to dairy farmers, researchers, and consumers.

Orientador: Katia Denise Saraiva Bresciani / Banca: Wagner Luiz Ferreira / Banca: Jancarlo Ferreira Gomes / Resumo: Parasitos gastrintestinais são comuns em animais de companhia. Atualmente, os cães e gatos de estimação apresentam um importante papel entre os humanos, sendo até considerados como membros da família. Por conta deste laço estreito com os humanos, surgem as preocupações dos veterinários em proporcionar uma melhor qualidade de vida para animais, e também em relação a algumas doenças são consideradas de caráter zoonótico. Alguns protozoários e helmintos (Giardia spp., Cryptosporidium spp., Isospora spp., Toxocara spp. e Ancylostoma spp.) são comumente diagnosticados, apesar das medidas terapêuticas e profiláticas existentes. Várias destas enfermidades apresentam sinais clínicos diversos, sendo a diarreia comumente encontrada. As técnicas coproparasitológicas tem como finalidade auxiliar o médico veterinário para um diagnóstico preciso e consequentemente o tratamento adequado ao animal. O objetivo do nosso trabalho foi investigar a ocorrência dos parasitos gastrintestinais em animais filhotes domiciliados. / Abstract: Gastrointestinal parasites are common in pets. Pets play an important role among humans and lately they have been considered members of families Due to the fact of the closely contact between humans and animals, veterinarians worries about zoonotic risk of some parasitic diseases and to promote better life quality for both pets and tutors. Some gastrointestinal parasites (Giardia spp., Cryptosporidium spp., Isospora spp., Toxocara spp. and Ancylostoma spp.) are commonly diagnosed causing diarrhea, despite existing therapeutic and prophylactic evidence. The coproparasitological techniques have been helping veterinarians for an accurate diagnosis and consequently the appropriate treatment to the animal. The objective of this study was to investigate the occurrence of gastrointestinal parasites in domiciled dogs. / Mestre

A diminuição da disponibilidade de água de boa de qualidade em nível mundial é resultado, entre outros fatores, do consumo elevado exercido pela agricultura irrigada. A fim de minimizar os impactos ocasionados por essa atividade aos recursos hídricos, muitos países demonstram a viabilidade do emprego de efluentes de esgoto tratado na agricultura. Contudo, esta prática oferece riscos à saúde pública através dos organismos patogênicos capazes de sobreviver no esgoto. Entre estes patógenos a OMS destaca os protozoários e os helmintos parasitas do homem, pelo fato de apresentarem maior período de sobrevivência em condições adversas e alto poder de infecção. O presente trabalho tem como objetivo realizar um levantamento qualitativo e quantitativo dos parasitas intestinais de importância sanitária presentes no esgoto afluente, no efluente tratado e no efluente desinfetado de duas estações de tratamento localizadas na cidade de Piracicaba. A ETE Cecap é composta por um sistema australiano com uma lagoa anaeróbia, lagoas facultativas primária e secundária e tratamento por filtração e desinfecção por cloração. A ETE Piracicamirim é constituída por reatores UASB seguidos por lagoa aerada, decantadores secundários de lodo ativado, tratamento por filtro de areia e desinfecção por radiação ultravioleta. Entre maio de 2008 e dezembro de 2009 foram coletas amostras do esgoto bruto e dos efluentes tratado e desinfetado, seguindo as orientações de AYRES e MARA (1996). As técnicas de preparo e análises parasitológicas foram realizadas segundo YANKO (1987) e WHO (1999). A ETE Cecap apresentou uma freqüência de amostras positivas de 40 por cento para o efluente desinfetado, sendo Toxocara sp o parasita mais presente com 46,17 ovos/l. A média de ovos de helmintos para o período de estudo foi 3,78 ovos/l de efluente desinfetado. A ETE Piracicamirim apresentou uma freqüência de 100 por cento para o efluente desinfetado. Ascaris sp foi o parasita mais encontrado nos três pontos de coleta. A média de ovos de helmintos para o período foi de 0,89 ovos/l de efluente desinfetado. A ETE Cecap não apresentou um efluente final propício à utilização na irrigação. Já o efluente proveniente da ETE Piracicamirim atende as recomendações da WHO (2006), para a presença de ovos de helmintos, para utilização na irrigação irrestrita / Decreased availability of good water quality worldwide is a result, among other factors, high consumption exerted by irrigated agriculture. In order to minimize the impacts caused by this activity to water, many countries demonstrate the viability of using treated sewage effluent in agriculture. However, this practice provides a public health risk through the pathogens can survive in sewage. Among these pathogens, WHO stresses the protozoa and helminths of human, because they presented greater period of survival in adverse conditions and high power of infection. This paper aims to evaluate the quality and quantity of intestinal parasites of sanitary importance present in the raw sewage in the treated effluent and disinfected from two treatment plants located in the city of Piracicaba. The sewage treatment plant CECAP comprises an Australian system with an anaerobic pond, facultative ponds primary and secondary treatment by filtration and disinfection by chlorination. The sewage treatment plant Piracicamirim consists of UASB followed by aerated lagoon, activated sludge secondary clarifiers, treatment by sand filter and disinfection by ultraviolet radiation. Between May 2008 and December 2009 were collected and samples of raw sewage effluent treated and disinfected, following the guidelines of AYRES and MARA (1996). The techniques of preparation and analysis were performed according parasitological YANKO (in 1987) and WHO (1999). CECAP showed rates of positive samples of 40 per cent for the effluent disinfected with Toxocara sp parasite more present with 46.17 eggs/l. The mean helminths eggs for the study period was 3.78 eggs/l effluent disinfected. Piracicamirim showed rates of 100 per cent for the effluent disinfected. Ascaris sp was the parasite most commonly found in the three collection sites. The mean helminths eggs for the period was 0.89 eggs/l effluent disinfected. CECAP not produced a final effluent suitable for irrigation use. Already the effluent from the sewage treatment plant Piracicamirim meets the recommendations of WHO (2006), for the presence of helminths eggs for use in unrestricted irrigation

As chaperonas moleculares atuam no enovelamento de proteínas, montagem de complexos, prevenção/recuperação de proteínas de agregados e encaminhamento de proteínas mal enoveladas para depuração. As Hsp90 são chaperonas moleculares que atuam estabilizando proteínas relacionadas a vias de sinalização, crescimento celular, processos transcricionais e traducionais, estabilidade do genoma, entre outras, sendo essencial para a viabilidade celular. Em protozoários do gênero Leishmania, as Hsp90 são imprescindíveis no desenvolvimento, adaptação e transformação celular. Estes fatores fazem das Hsp90 alvos potenciais para o tratamento de patologias, como a leishmaniose, uma doença tropical negligenciada. As Hsp90 são homodímeros flexíveis onde cada protômero é dividido em três domínios denominados N, M e C. As Hsp90 possuem um ciclo conformacional associado ao seu ciclo funcional e sua baixa atividade ATPásica, o qual é direcionado e regulado por proteínas auxiliares, as co-chaperonas. A co-chaperona Aha1 atua estimulando a atividade ATPásica da Hsp90, participando da maturação de proteínas quinase e receptores de hormônios. O objetivo deste trabalho foi caracterizar estruturalmente a proteína Aha1 de L. braziliensis (LbAha1) e seu mecanismo de interação com a Hsp90 desse organismo (LbHsp90). A LbAha1 é formada por dois domínios, LbAha1N e LbAha1C, conectados entre si por um linker flexível. Experimentos de identificação in vivo mostraram que a LbAha1 e LbHsp90 são proteínas cognatas. A LbAha1 e as construções de seus domínios (LbAha1N e LbAha1C) recombinantes foram obtidas puras e enoveladas. A LbAha1 é estruturada em dois domínios com diferentes estabilidades, que não interagem entre si e se enovelam independentemente, porém influenciam-se reciprocamente. Em solução, a LbAha1 se comporta como um monômero alongado e possui notável flexibilidade, com dimensão suficiente para interagir com os domínios N e M da LbHsp90. A análise da interação entre a LbAha1 e LbHsp90 revelou que a associação destas proteínas é dirigida entalpicamente, ocorrendo através de interações eletrostáticas e com estequiometria de 2 moléculas de LbAha1 por dímero de LbHsp90. O mapeamento de regiões envolvidas na interação indicou que o domínio LbAha1N e o domínio M da LbHsp90 compõem o cerne da interação e somente a LbAha1 íntegra é capaz de encaminhar a LbHsp90 para um estado fechado. Experimentos de cinética enzimática mostraram que somente a LbAha1 íntegra estimula a atividade ATPásica da LbHsp90 por meio de um mecanismo cooperativo positivo. Assim, é proposto que a conexão entre os domínios da LbAha1, via linker, é essencial para o direcionamento da LbHsp90 para um estado conformacional fechado e competente na hidrólise de ATP. / Molecular chaperones play a role in protein folding, complex assembly, prevention/recover of proteins from aggregates and targeting misfolded proteins to depuration. Hsp90 molecular chaperones work stabilizing proteins related to signaling pathways, cell growth, transcription and translation processes, genome stability, among others, and are essential to cell viability. In protozoa of the genus Leishmania, Hsp90s are indispensable for cell developing, adaptation and transformation. These factors make Hsp90s potential targets for pathologies treatment, such as leishmaniasis, a neglected tropical disease. Hsp90s are flexible homodimers and each protomer is divided into three domains named N, M and C. Hsp90s have a conformational cycle associated to its functional cycle and low ATPase activity, which is directed and regulated by auxiliary proteins, so-called cochaperones. Aha1 co-chaperone stimulates Hsp90 ATPase activity, participating on protein kinase and hormone receptors maturation. This work aimed to characterize the structure of the Aha1 from L. braziliensis (LbAha1) and its mechanism of interaction with the Hsp90 from the same organism (LbHsp90). LbAha1 is formed by two domains, LbAha1N and LbAha1C, connected to each other by a flexible linker. In vivo experiments identified LbAha1 and LbHsp90 as cognate proteins. Recombinant LbAha1 and its domains construct (LbAha1N and LbAha1C) were obtained pure and folded. LbAha1 is divided into two domains with dissimilar stabilities and they do not interact to each other. In spite of this they fold independently and influence each other reciprocally. LbAha1 behaves as an elongated monomer in solution and has a remarkable flexibility, with sufficient dimension to interact to LbHsp90 N and M domains. The analysis of the LbAha1-LbHsp90 interaction revealed that the association between these two proteins is enthalpically driven, occurring through electrostatic interactions in a stoichiometry of 2 LbAha1 molecules per LbHsp90 dimer. Domain mapping experiments indicated that LbAha1N and LbHsp90 M domains compose the core of the interaction and only full length LbAha1 is able to direct LbHsp90 toward a closed state. Enzyme kinetics experiments showed that only full length LbAha1 stimulates LbHsp90 ATPase activity through a positive cooperative mechanism. Thus, it is proposed that the connection between the LbAha1 domains, via linker, is essential to direct the LbHsp90 toward a closed and ATPase-competent conformational state.

Embora dietas de alto concentrado sejam comumente utilizadas para acabamento de cordeiros, informações sobre o efeito de teores mínimos de fibra em detergente neutro (FDN) sobre o desempenho de cordeiros são limitadas. O objetivo deste estudo foi avaliar os efeitos da inclusão de baixos teores de FDN em dieta de alto concentrado sobre desempenho, eficiência alimentar, características de carcaça, variáveis sanguíneas e ruminais de cordeiros em terminação. Vinte e quatro cordeiros machos, não castrados (peso vivo inicial de 24,55 ± 2,2 kg) foram distribuídos aleatoriamente em baias individuais, em delineamento inteiramente casualizado, com três tratamentos e oito repetições. Os tratamentos foram teores de FDN na dieta de 15, 20 e 25% com base na matéria seca. As dietas foram compostas de milho, farelo de soja, minerais e silagem de milho, e foram oferecidas duas vezes por dia, com controle diário do alimento ofertado e sobra para determinação da ingestão de matéria seca (IMS). Os animais foram pesados semanalmente e abatidos após 50 dias de confinamento, com peso vivo final de 40,48 ± 2,3 kg. Peso de carcaça quente e fria (PCQ e PCF), bem como o rendimento de carcaça quente e fria (RCQ e RCF) foram medidos. Após a evisceração, foram coletados fluido e conteúdo ruminal para determinação de ácidos graxos de cadeia curta e protozoários. Os dados foram submetidos à análise de regressão, utilizando o pacote estatístico SAS® (versão 9.0, 2002). Cordeiros alimentados com diferentes teores de FDN, apresentaram efeito linear crescente sobre a IMS e o consumo alimentar residual (CAR) conforme aumentou o teor de FDN na dieta. O ganho médio diário (GMD) e as demais variáveis de eficiência alimentar não diferiram estatisticamente entre os tratamentos. Os teores crescentes de FDN na dieta ocasionou diminuição do PCQ, RCQ e RCF, e não houve efeito significativo sobre as demais variáveis de carcaça. As variáveis sanguíneas e ruminais não foram alteradas pelos tratamentos, sugerindo que as dietas utilizadas com alto teor de concentrado e diferentes teores de FDN para cordeiros em terminação proporcionaram homeostase aos animais e ambiente adequado para fermentação ruminal. De modo geral, as dietas com teores baixos de FDN não alteraram o GMD, mas tiveram efeito sobre CAR, peso e rendimentos de carcaça aumentaram e não proporcionaram alterações fisiológicas e ruminais. / Although high concentrate diets are commonly used for finishing lambs, information about the effect of minimum levels of neutral detergent fiber (NDF) on performance is limited. The purpose of this study was to evaluate the effects of increasing dietary fiber levels on performance, feed efficiency and parameters of carcass, blood and rumen of finishing lambs fed high concentrate diet. Twenty four uncastrated male lambs (initial body weight of 24.55 ± 2.2 kg) were randomly assigned to 24 individual pens, in a complete randomized design with three treatments and eight replicates. Treatments were dietary NDF levels of 15, 20 and 25% based on dry matter. Diets were composed of corn, soybean meal, minerals and corn silage, and were offered twice a day with refusals daily measured to determine dry matter intake (DMI). Animals were weighed weekly and slaughtered after 50 d of feedlot, with body weight of 40.48 ± 2.3 kg. Hot and cold carcass weight (HCW and CCW) as well as hot and cold carcass yield (HCY and CCY) were measured. After evisceration, fluid and rumen contents were collected to determine fatty acid short chain and protozoa. Data were submitted to analysis of regression, using the statistical software SAS (version 9.0, 2002). Lambs fed with increasing levels of NDF had a linear efeect on IMS and residual feed intake (RFI). The average daily gain (ADG) and other food efficiency variables were not statistically different between treatments. Increasing levels of NDF in the diet caused a decrease in HCW, HCY and CCY, and there was no significant effect on other carcass variables. Blood and rumen variables were not affected by treatments, suggesting that the diets with high concentrate and different levels of NDF for finishing lambs provided homeostasis animals and adequate environment for rumen fermentation. In general, diets with low NDF did not alter the ADG, but had no effect on RFI, weight and carcass yield increased and did not provide physiological and ruminal changes.

Resumo: As enteroparasitoses comumente afetam o equilíbrio orgânico dos animais de estimação, sendo isto particularmente preocupante em relação aos cães, devido ao intimo contato destes com o homem. As técnicas coproparasitológicas usualmente utilizadas na rotina laboratorial para detecção de parasitoses gastrintestinais são indispensáveis para o diagnóstico e por conseqüência para determinar a necessidade de tratamento dos animais infectados. Neste estudo objetivou-se avaliar a ocorrência de helmintoses e protozooses em cães domiciliados e sua associação com faixa etária, sexo e raça, bem como a eficiência dos Métodos Willis- Mollay, Faust, Sedimentação e Exame Direto quanto a recuperação de ovos e oocistos de parasitos gastrintestinais da espécie canina. Foram processadas 401 amostras fecais, sendo que em 300 foi efetuada a Técnica de Kinyoun para pesquisa de Cryptosporidium spp. Os parasitos encontrados foram Ancylostoma spp. em 53,1%, Toxocara canis em 20,7%, Cystoisospora ohioensis em 15,7%, Trichuris vulpis em 3,7%, Dipylidium caninum em 2,5%, Cryptosporidium spp. em 1,33% e Taenia spp. em 1,0% das amostras. A positividade para Ancylostoma spp. não foi influenciada pelas variáveis raça, sexo e idade. Houve diferença estatisticamente significativa para T. canis e C. ohioensis nos cães com até seis meses de idade quando comparados a animais acima de seis meses (P<0,0001). Quanto a variável sexo houve associação apenas com o ascarídeo T. canis com maior ocorrência nos machos quando comparado as fêmeas (P = 0,0243). A associação da presença das formas evolutivas dos parasitos com raça dos cães não foi estatisticamente significativa. / Abstract: The enteroparasitoses generally affect the organic equilibrium of pets, being particularly worrying referring to dogs, due to intimate contact with the human being. The techniques coproparasitologics usually used in laboratorial routines for detection of gastroenteric parasitoses are indispensable for the diagnosis and consequence to determine the necessary of infected animals treatment. In this study we evaluated the occurrence of helminthoses and protozooses in dogs and its association with age, sex and race, as well as the efficiency of Willis-Mollay, Faust, Sedimentation and exam Direct methods. It was processed 401 fecal samples, being accomplished in 300 parts, the technique of Kinyoun for directed research of Cryptosporidium spp. The parasite found were Ancylostoma spp. (53.1%), Toxocara canis (20.7%), Cystoisospora ohioensis (15.7%), Trichuris vulpis (3.7%), Dipylidium caninum (2.5%), Cryptosporidium spp. (1.33%) and Taenia spp. (1.0%). There was a statistically significant difference for T. canis and C. ohioensis in dogs up to six months old (P<0,0001). The occurrence of T. canis was statistically bigger in males when compared to females (P=0,0243). The association of parasites with race was not statistically significant. Of the four dogs (1.33%) positives for Cryptosporidium spp., only one presented a semi liquid consistence faeces and light dehydration (5 to 7%), having this animal age superior to six months old, with simultaneous infection for Ancylostoma spp. The Willis-Mollay was more efficient in the diagnosis of Ancylostoma spp. and T. canis eggs. The Direct method was least efficient. The techniques were statistically the same as the occurrence of the C. ohioensis oocysts. / Orientador: Silvia Helena Venturoli Perri / Coorientador: Kátia Denise Saraiva Bresciani / Banca: Alessandro Francisco Talamini do Amarante / Banca: Solange Maria Gennari / Mestre

As chaperonas moleculares atuam no enovelamento de proteínas, montagem de complexos, prevenção/recuperação de proteínas de agregados e encaminhamento de proteínas mal enoveladas para depuração. As Hsp90 são chaperonas moleculares que atuam estabilizando proteínas relacionadas a vias de sinalização, crescimento celular, processos transcricionais e traducionais, estabilidade do genoma, entre outras, sendo essencial para a viabilidade celular. Em protozoários do gênero Leishmania, as Hsp90 são imprescindíveis no desenvolvimento, adaptação e transformação celular. Estes fatores fazem das Hsp90 alvos potenciais para o tratamento de patologias, como a leishmaniose, uma doença tropical negligenciada. As Hsp90 são homodímeros flexíveis onde cada protômero é dividido em três domínios denominados N, M e C. As Hsp90 possuem um ciclo conformacional associado ao seu ciclo funcional e sua baixa atividade ATPásica, o qual é direcionado e regulado por proteínas auxiliares, as co-chaperonas. A co-chaperona Aha1 atua estimulando a atividade ATPásica da Hsp90, participando da maturação de proteínas quinase e receptores de hormônios. O objetivo deste trabalho foi caracterizar estruturalmente a proteína Aha1 de L. braziliensis (LbAha1) e seu mecanismo de interação com a Hsp90 desse organismo (LbHsp90). A LbAha1 é formada por dois domínios, LbAha1N e LbAha1C, conectados entre si por um linker flexível. Experimentos de identificação in vivo mostraram que a LbAha1 e LbHsp90 são proteínas cognatas. A LbAha1 e as construções de seus domínios (LbAha1N e LbAha1C) recombinantes foram obtidas puras e enoveladas. A LbAha1 é estruturada em dois domínios com diferentes estabilidades, que não interagem entre si e se enovelam independentemente, porém influenciam-se reciprocamente. Em solução, a LbAha1 se comporta como um monômero alongado e possui notável flexibilidade, com dimensão suficiente para interagir com os domínios N e M da LbHsp90. A análise da interação entre a LbAha1 e LbHsp90 revelou que a associação destas proteínas é dirigida entalpicamente, ocorrendo através de interações eletrostáticas e com estequiometria de 2 moléculas de LbAha1 por dímero de LbHsp90. O mapeamento de regiões envolvidas na interação indicou que o domínio LbAha1N e o domínio M da LbHsp90 compõem o cerne da interação e somente a LbAha1 íntegra é capaz de encaminhar a LbHsp90 para um estado fechado. Experimentos de cinética enzimática mostraram que somente a LbAha1 íntegra estimula a atividade ATPásica da LbHsp90 por meio de um mecanismo cooperativo positivo. Assim, é proposto que a conexão entre os domínios da LbAha1, via linker, é essencial para o direcionamento da LbHsp90 para um estado conformacional fechado e competente na hidrólise de ATP. / Molecular chaperones play a role in protein folding, complex assembly, prevention/recover of proteins from aggregates and targeting misfolded proteins to depuration. Hsp90 molecular chaperones work stabilizing proteins related to signaling pathways, cell growth, transcription and translation processes, genome stability, among others, and are essential to cell viability. In protozoa of the genus Leishmania, Hsp90s are indispensable for cell developing, adaptation and transformation. These factors make Hsp90s potential targets for pathologies treatment, such as leishmaniasis, a neglected tropical disease. Hsp90s are flexible homodimers and each protomer is divided into three domains named N, M and C. Hsp90s have a conformational cycle associated to its functional cycle and low ATPase activity, which is directed and regulated by auxiliary proteins, so-called cochaperones. Aha1 co-chaperone stimulates Hsp90 ATPase activity, participating on protein kinase and hormone receptors maturation. This work aimed to characterize the structure of the Aha1 from L. braziliensis (LbAha1) and its mechanism of interaction with the Hsp90 from the same organism (LbHsp90). LbAha1 is formed by two domains, LbAha1N and LbAha1C, connected to each other by a flexible linker. In vivo experiments identified LbAha1 and LbHsp90 as cognate proteins. Recombinant LbAha1 and its domains construct (LbAha1N and LbAha1C) were obtained pure and folded. LbAha1 is divided into two domains with dissimilar stabilities and they do not interact to each other. In spite of this they fold independently and influence each other reciprocally. LbAha1 behaves as an elongated monomer in solution and has a remarkable flexibility, with sufficient dimension to interact to LbHsp90 N and M domains. The analysis of the LbAha1-LbHsp90 interaction revealed that the association between these two proteins is enthalpically driven, occurring through electrostatic interactions in a stoichiometry of 2 LbAha1 molecules per LbHsp90 dimer. Domain mapping experiments indicated that LbAha1N and LbHsp90 M domains compose the core of the interaction and only full length LbAha1 is able to direct LbHsp90 toward a closed state. Enzyme kinetics experiments showed that only full length LbAha1 stimulates LbHsp90 ATPase activity through a positive cooperative mechanism. Thus, it is proposed that the connection between the LbAha1 domains, via linker, is essential to direct the LbHsp90 toward a closed and ATPase-competent conformational state.

O presente trabalho teve como objetivo avaliar os efeitos de três diferentes aditivos (Levedura, Virginiamicina e Bicarbonato de sódio) na dieta de bovinos composta de 30% de silagem de milho e 70% de concentrado sobre alguns parâmetros do metabolismo ruminal (concentração de amônia, pH, protozoários ciliados), degradabilidade in situ da dieta e alguns parâmetros sanguíneos (pH, PCO2, PO2, TCO2, HCO3, Beefc, sO2 e lactato). Para tanto, quatro bovinos zebuínos, machos castrados, da raça Nelore, com cânulas ruminais e peso vivo médio de 295 Kg, foram utilizados em um experimento em quadrado latino 4 x 4 com 10 dias de adaptação e sete dias de colheita de amostras em cada período. Os animais foram alojados em galpão de alvenaria, com cochos e bebedouros individuais. No geral, houve uma diferença significativa no pH em todos os tratamentos nas primeiras 2 horas após a alimentação (P < 0,05), entretanto, não houve diferença entre os tratamentos nesse período. Já em relação aos parâmetros sanguíneos, o tratamento virginiamicina apresentou menor valor de pH em relação ao tratamento levedura (P < 0,10). No entanto, os tratamentos controle e bicarbonato de sódio não apresentaram diferença estatística (P < 0,10). Houve um aumento na concentração de oxigênio saturado (sO2) no tratamento levedura, enquanto no tratamento virginiamicina, o valor encontra se diminuído. Não houve diferença estatística entre os demais tratamentos (P > 0,05). Os demais parâmetros não apresentaram diferenças estatísticas (P > 0,05). Houve diferença significativa entre os tratamentos em todos os tempos. O tratamento com bicarbonato de sódio obteve maior concentração de protozoários, deferindo dos demais (P < 0,05). Os tratamentos levedura e virginiamicina, não diferiram entre si (P > 0,05). O tratamento controle apresentou a menor concentração de protozoários em relação aos demais tratamentos (P < 0,05). Não houve efeito significativo nos valores encontrados (P > 0,05) para amônia ruminal. Na degradabilidade, apenas o coeficiente de degradabilidade da matéria seca (CDMS) diferiu estatisticamente dos outros tratamentos (P < 0,05). / The present work had as objective evaluates the effects of three different addictive (Yeast, Virginiamycin and Bicarbonate of sodium) in the diet of bovine composed of 30% of corn silage and 70% of concentrated on some parameters of the metabolism ruminal (concentration of ammonia, pH, protozoa ciliated), degradability in situ of the diet and some sanguine parameters (pH, PCO2, PO2, TCO2, HCO3, Beefc, sO2 and lactato). For so much, four bovine zebu, castrated males, of the race Nelore, with stems ruminate and medium alive weight of 295 Kg, they were used in an experiment in Latin square 4 x 4 with 10 days of adaptation and seven days of crop of samples in each period. The animals were housed at masonry hangar. In the general, there was a significant difference in the pH in all of the treatments in the first 2 hours after the feeding (P < 0.05), however, there was not difference among the treatments in that period. Already in relation to the sanguine parameters, the treatment virginiamycin presented smaller pH value in relation to the treatment yeast (P < 0.10). However, the treatments control and bicarbonate of sodium didn\'t present statistical difference (P < 0.10). There was an increase in the concentration of oxygen saturated (sO2) in the treatment yeast, while in the treatment virginiamycin, the value finds if decreased. There was not statistical difference among the other treatments (P > 0.05). The other parameters didn\'t present statistical differences (P > 0.05). There was significant difference among the treatments in all of the times. The treatment with bicarbonate of sodium obtained larger concentration of protozoa, granting of the others (P < 0.05). The treatments yeast and virginiamycin didn\'t differ amongst themselves (P > 0.05). The treatment control presented to smallest concentration of protozoa in relation to the other treatments (P < 0.05). There was not significant effect in the found values (P > 0.05) for ammonia ruminal. In the degradability, just the coefficient of degradability of the matter dries (CDMS) differed of the other treatments (P < 0.05).

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