Made available in DSpace on 2015-12-06T23:47:26Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2008 / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / laboratório e dessa forma caracterizar a evolução filogenética do clone de P. aeruginosa produtor da MβL SPM-1; comparar o poder discriminatório e a reprodutibilidade desta técnica com as técnicas de PFGE e ribotipagem automatizada para tipagem molecular de P. aeruginosa e avaliar a capacidade do MLST de discriminar amostras que foram classificadas sob ribogrupos distintos, mas com padrões de PFGE idênticos. Métodos: Um total de 50 amostras de P. aeruginosa produtoras de SPM-1 foram coletadas de nove centros brasileiros. Três amostras de P. aeruginosa produtoras de IMP-1 e duas amostras de P. aeruginosa n„o produtoras de MβL foram incluídas no estudo. A técnica de MLST foi padronizada conforme descrito por Curran et al. As seq¸Íncias obtidas foram comparadas com as existentes no banco de dados mundial de MLST para P. aeruginosa (www.pubmlst.org/paeruginosa) para que dessa forma fosse determinado o perfil alélico e, subsequentemente, o tipo de sequência (ST). Para a análise filogenética foi utilizado o método de Jukes-Cantor e Neighbor-Joining. Um total de cinco STs foram identificadas entre as 55 amostras de P. aeruginosa estudadas. Todos os isolados de P. aeruginosa produtores de SPM-1 apresentaram perfil alélico idêntico e, dessa forma, receberam a mesma ST (ST277), com exceção de uma amostra proveniente de Belo Horizonte, a qual recebeu a ST235. As três amostras de P. aeruginosa produtoras de IMP-1 foram classificadas sob a mesma ST (ST593), enquanto que as amostras não produtoras de MβL apresentaram perfis alélico ainda não existentes no banco de dados, e assim, duas novas STs foram criadas para estas amostras (ST594 e ST595). O clone endêmico brasileiro de P. aeruginosa produtor de SPM-1 (ST277) mostrou perfil alélico idêntico ao de uma cepa isolada na Áustria (ID 275), em setembro de 2006. Variação em um ˙nico lócus da ST277 foi encontrada em uma amostra proveniente da Áustria (ID279), isolada em janeiro 2007. Similaridade entre cinco dos sete alelos foi encontrada entre as amostras deste estudo pertencentes a ST277 e uma amostra isolada no Canadá· (ID 148), em 1990. Conclusão: Nossos dados sugerem que as amostras de P. aeruginosa produtoras de SPM-1 descendem de um ancestral comum e que podem possuir relação ancestral com os isolados da Áustria e mais remotamente com a amostra do Canadá. / FAPESP: 2005/57496-1 / BV UNIFESP: Teses e dissertações

Made available in DSpace on 2016-02-26T13:34:39Z (GMT). No. of bitstreams: 2 melise_silveira_ioc_mest_2014.pdf: 2936486 bytes, checksum: f73183e180b237b1d6dc63c0c0afa155 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2016-02-23 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / O surgimento de bactérias Gram-negativas resistentes à drogas tem sido progressivo e alarmante. Entre os patógenos de particular importância está Pseudomonas aeruginosa multirresistentes à drogas (MDR). Um clone epidêmico de P. aeruginosa MDR produtor da metalo-\03B2-lactamase SPM-1, chamado clone SP (ST277), tem sido encontrado em diferentes estados brasileiros. O gene blaSPM-1 foi descrito em uma estrutura genética chamada ISCR4, responsável pela sua mobilização e expressão. Além do gene blaSPM-1, tem sido descrito, neste clone, a presença de um integron de classe I carreando genes de resistência (In163) e um elemento genético ISCR14 carreando uma metilase de RNAr 16S (rmtD), que confere resistência a altas concentrações de aminoglicosídeos. Este tipo de associação resulta em um perfil de resistência extremamente preocupante. Assim, este estudo teve como objetivo investigar a contexto genético dos genes blaSPM-1 e rmtD, além de caracterizar mutações em genes cromossomais associados a multirresistência a antimicrobianos em amostras de P. aeruginosa pertencentes ao clone ST277, através de Sourthen blot e sequenciamento de nova geração. A partir de 50 amostras de P. aeruginosa MDR isoladas entre 2007 e 2010, foram selecionadas 13 amostras pertencentes ao ST277 (através de MLST) que apresentaram positividade para blaSPM-1 e/ou rmtD e In163 (através de PCR), sendo 12 do clone SP (A) e uma de um clone diferente, M, através de PFGE. Através de restrição do DNA com as enzimas de restrição SpeI e XbaI, e posterior hibridação com sondas dos genes alvos (blaSPM-1, rmtD e In163) foi possível observar que os genes alvos encontravam-se em fragmentos distintos e que a amostra do clone M apresentou um perfil de hibridação diferentes das demais amostras demonstrando a ocorrência de vários rearranjos na mesma, indicando uma maior distância evolutiva A partir destes resultados, selecionamos 6 amostras para sequenciamento total do genoma utilizando a plataforma de sequenciamento MiSeq da Illumina. Através de sucessivas análises - que incluíram os contigs gerados na montagem de novo, montagens por referência e alinhamentos par a par- chegamos a uma região de 239.648pb onde estavam contidos o In163 e o ISCR14 carreando rmtD, inseridos em uma ilha genômica incorporada ao cromossomo bacteriano. O gene blaSPM-1 inserido no ISCR4 foi encontrado em uma região de 13.959pb, que incluía genes relacionados a plasmídios e transposons, contudo ainda não sabemos se esse elemento está incorporado ao cromossomo, ou livre em forma de plasmídio. Através da análise das mutações em genes cromossômicos associados a resistência à antimicrobianos, encontramos mutações nos genes oprD, ampD, mexZ, mexS, mexT, gyrA e parC que foram comuns às 6 amostras sequenciadas do ST277. Isso explicaria o fenótipo MDR nas amostras negativas para rmtD e/ou blaSPM-1. Além disso, como estas amostras foram isoladas em estados e anos distintos, acreditamos que essas mutações sejam características do ST277, o que pode ser um dos fatores associados a distribuição epidêmica deste clone no Brasil / The development of antimicrobial resistance among Gram - negative pathogens has been progressive and relentless. A pathogen of particular concern is multidrug - resistant (MDR) Pseudomonas aeruginosa . An epidemic clone of MDR P. aeruginosa producing the metall o - β - lactamase SPM - 1, named SP clone (ST277), has been found in different Brazilian states. The bla SPM - 1 gene has been described in a genetic structure called ISCR4, responsible for its mobilization and expression. Besides the bla SPM - 1 gene, it has been des cribed in this clone, a classe I integron (In163) carrying resistance genes and the genetic element ISCR14 carrying a 16S rRNA metilase ( rmtD ), that confers resistance to high concentrations of aminoglycosides. This kind of association results in an extrem ely worrisome profile of resistance. Thus, this work aimed to investigate the genetic background of bla SPM - 1 and rmtD genes and to characterize mutations in chromosomal genes associated with multidrug resistance in P. aeruginosa isolates belonging to ST277 clone, using Sourthen blot and next - generation sequencing. From 50 MDR P. aeruginosa isolates recovered from 2007 to 2010,there were selected 13 bla SPM - 1 and /or rmtD - positive isolates (by PCR) belonging to ST277 (by MLST), 12 f rom SP (A) clone and one from a different PFGE clone (M). By DNA digestion with Spe I and Xba I restriction enzymes, and subsequent hybridization with probes for target genes ( bla SPM - 1 , rmtD and In163 ), it was observed that the target genes were in separate fragments, and that the M clone isolate showed a different profile compared with the other isolates, indicating various rearrangements, suggesting a greater evolutionary distance. With these results, 6 isolates were selected for whole genome sequencing by Illumina MiSeq platform. Through successive analyzes – which included de novo assembly contigs, map to reference assemblies and pairwise alignments - we came up to a 239648pb region containing the In163 and ISCR14 inserted into a genomic island incorporated into bacterial chromosome. The bla SPM - 1 gene was inserted into ISCR4, found in a 13950pb region, which included genes related to plasmids and transposons, however we do not know whether this element s chromosomal or plasmidial . Through analysis of chromoso mal genes mutations associated with multidrug resistance, we found mutations in oprD, ampD, mexZ, mexS, mexT, gyrA e parC genes, which were common to the 6 ST277 isolates sequenced. This would explain the MDR phenotype in bla SPM - 1 and/or rmtD negative isol ates. Furthermore, since these microorganisms were isolated in different years and states, we believe these mutations are ST277 characteristic, which may be one of the factors associated with the epidemic characteristics of this clone

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Ciências da Saúde, Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde, 2017. / Submitted by Priscilla Sousa (priscillasousa@bce.unb.br) on 2017-11-07T11:20:59Z No. of bitstreams: 1 2017_ElaineMariaGuaráLôbo.pdf: 3413466 bytes, checksum: 9abee0f883e0274e43b7f665a94c66b0 (MD5) / Approved for entry into archive by Patrícia Nunes da Silva (patricia@bce.unb.br) on 2018-05-08T18:54:38Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2017_ElaineMariaGuaráLôbo.pdf: 3413466 bytes, checksum: 9abee0f883e0274e43b7f665a94c66b0 (MD5) / Made available in DSpace on 2018-05-08T18:54:38Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2017_ElaineMariaGuaráLôbo.pdf: 3413466 bytes, checksum: 9abee0f883e0274e43b7f665a94c66b0 (MD5) Previous issue date: 2018-05-09 / As doenças periodontais (DPs) apresentam-se como as doenças infecciosas mais comuns da cavidade oral, associadas ao biofilme dento-bacteriano, podendo resultar na destruição dos tecidos de suporte dos dentes e perda dentária. A clorexidina, por sua vez, é o principal agente utilizado para o controle deste biofilme, por ser um antisséptico catiônico de amplo espectro. Entretanto, apresenta efeitos adversos como ardência bucal, manchamento de dentes, aumento do cálculo e perda do paladar em pacientes que fazem seu uso por períodos prolongados. Neste sentido, os peptídeos antimicrobianos (PAMs) têm sido propostos como uma abordagem alternativa ao tratamento de infecções e controle do biofilme dental, com o intuito de evitar a resistência microbiana e consequentemente, os efeitos colaterais do uso da clorexidina. Desta forma, o presente estudo teve por finalidade avaliar in vitro a capacidade antimicrobiana, citotóxica e imunomodulatória do peptídeo synoeca-MP e da clorexidina isolados e em sinergismo contra a bactéria Pseudomonas aeruginosa, além de avaliar a inibição da formação de biofilme e bactérias planctônicas de P. aeruginosa, em diferentes concentrações do peptídeo synoeca-MP e da clorexidina. De acordo com os resultados, infere-se uma comprovada ação antimicrobiana, imunomodulatória e antibiofilme do peptídeo synoeca-MP, assim como também quando combinado com o digluconato de clorexidina. Dessa forma, depreende-se que a atuação sinérgica entre clorexidina e synoeca-MP foi benéfica nos ensaios antimicrobianos in vitro envolvendo a bactéria oportunista P. aeruginosa. Neste contexto, espera-se que os agentes, em conjunto, possam ser capazes de controlar a infecção e sua disseminação, além de potencializar a resposta imune de macrófagos contra o microrganismo estudado. Em adição, a redução da concentração de clorexidina pela adição da synoeca-MP pode minimizar efeitos indesejáveis de ambos em ambiente clínico. / The periodontal diseases (PDs) are the most common oral cavity’s infectious diseases. When associated with the dento-bacterial biofilm, may result in tooth support tissues’ destruction and even, tooth loss. The chlorhexidine, in turn, is the main agent used to control this biofilm, as it is a wide-spectrum cationic antiseptic. However, it has adverse effects such as oral burning, teeth staining, increased calculus and loss of taste in patients who use it for prolonged periods. In this sense, the antimicrobial peptides (AMPs) have been proposed as an alternative approach to the infections’ treatment and control of dental biofilm, in order to avoid microbial resistance and consequently, the side effects of the use of chlorhexidine. Thus, the aim of the present study was to evaluate in vitro the antimicrobial and immunomodulatory capacity and cytotoxicity of synoeca-MP peptide and chlorhexidine isolated and both in synergism against Pseudomonas aeruginosa bacterium, besides evaluating the inhibition of the biofilm formation and planktonic bacteria of P. aeruginosa, in different concentrations of the synoeca-MP peptide and chlorhexidine. According to the results, a proven antimicrobial, immunomodulatory and anti-biofilm action of the synoeca-MP peptide is inferred, as well as, when combined with chlorhexidine digluconate. Therefore, it is concluded that the synergistic action between synoeca-MP and chlorhexidine was beneficial in the in vitro antimicrobial assays involving the opportunistic P. aeruginosa bacterium. In this context, it is expected that the agents, together, could be able to control the infection and its dissemination, besides potentiating the immune response of macrophages against the studied microorganism. In addition, reducing the concentration of chlorhexidine by the addition of synoeca-MP peptide may minimize the undesirable effects of both in a clinical setting.

abstract: The viscous lung mucus of cystic fibrosis (CF) patients is characterized by oxygen gradients, which creates a unique niche for bacterial growth. Pseudomonas aeruginosa and Staphylococcus aureus, two predominant microorganisms chronically infecting the airways of CF patients, typically localize in hypoxic regions of the mucus. While interspecies interactions between P. aeruginosa and S. aureus have been reported, little is known about the role of low oxygen in regulating these interactions. Studying interspecies interactions in CF lung disease is important as evidence suggests that microbial community composition governs disease progression. In this study, P. aeruginosa lab strain PAO1 and two primary clinical isolates from hypoxic tissues were cultured alone, or in combination, with methicillin resistant S. aureus (MRSA) strain N315 under hypoxic or normoxic conditions. Herein, it is shown for the first time that low oxygen conditions relevant to the CF lung affect the competitive behavior between P. aeruginosa and S. aureus. Specifically, S. aureus was able to better survive competition in hypoxic versus normoxic conditions. Competition data from different oxygen concentrations were consistent using PAO1 and clinical isolates even though differences in the level of competition were observed. PAO1 strains carrying mutations in virulence factors known to contribute to S. aureus competition (pyocyanin/phzS, elastase/lasA and lasI quorum sensing/lasI) were used to determine which genes play a role in the differential growth inhibition. The lasA and lasI mutants competed less effectively with S. aureus regardless of the oxygen level present in the culture compared to the isogenic wild type strain. These results are consistent with previous findings that elastase and lasI quorum sensing play a role in competitive behavior of P. aeruginosa and S. aureus. Interestingly, the phzS mutant competed less effectively in hypoxic conditions suggesting that pyocyanin may be important in microaerophilic conditions. This study demonstrates that oxygen plays a role in competition between P. aeruginosa and S. aureus and contributes to understanding CF environmental factors that may regulate microbial community dynamics important for disease progression with potential for development of therapeutic avenues. / Dissertation/Thesis / Masters Thesis Biology 2014

Resumo: A fibrose cística (FC) tem incidência de 1:9.520 nascidos vivos no Estado do Paraná. A principal causa de morbidade e mortalidade da doença é a infecção crônica por Pseudomonas aeruginosa (PA), o que torna a detecção e o tratamento precoces da colonização cruciais para prevenir a instalação da bactéria. Os objetivos do presente trabalho foram documentar a evolução da colonização por PA em crianças com FC na primeira infância, e determinar o método laboratorial mais eficaz, cultura de orofaringe ou detecção de anticorpos anti-LPS de PA, na detecção precoce da presença da bactéria. Trata-se de um estudo observacional de coorte prospectivo longitudinal. Quarenta e quatro crianças diagnosticadas com FC foram acompanhadas por três anos. Foram coletados swabs de faringe posterior para cultura e amostras de sangue para quantificação de anticorpos IgG contra uma preparação padronizada de antígeno de lipopolissacáride purificado de PA, a intervalos de aproximadamente 6 meses. Foi encontrada nas culturas uma frequência total de colonização por PA em 75% dos pacientes, dos quais aproximadamente 15% eram crônicos durante todo o tempo de acompanhamento. O método laboratorial mais eficaz para o diagnóstico precoce da infecção pulmonar por PA nos pacientes estudados foi a cultura de orofaringe. A utilização do LPS purificado de PA como antígeno demonstrou soroconversão significativa anterior à cultura somente na faixa etária entre 2 e 4 anos de idade, indicando que o método sorológico utilizado não foi capaz de detectar a infecção por PA antes da cultura em todos os pacientes estudados. Entretanto, o uso concomitante de métodos tradicionais bacteriológicos (cultura) e sorológicos pode contribuir para o diagnóstico precoce da presença de PA em crianças pequenas incapazes de obter amostras respiratórias ideais para o isolamento de PA. A baixa incidência de exacerbações respiratórias, o estado nutricional adequado da maioria dos pacientes, e a baixa prevalência de colonização crônica por PA podem ser explicados, pelo menos em parte, pela eficácia do monitoramento ambulatorial oferecido aos pacientes.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:27:23Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2006Bitstream added on 2014-06-13T19:14:46Z : No. of bitstreams: 1 pirollo_mps_me_rcla.pdf: 1848706 bytes, checksum: 98d8ca1a8ad1551fbb2bb0fdf4a32eb8 (MD5) / Agência Nacional do Petróleo, Gás Natural e Biocombustíveis (ANP) / A cepa bacteriana Pseudomonas aeruginosa LBI, isolada de solo contaminado com hidrocarbonetos, foi inoculada visando promover a degradação dos hidrocarbonetos através da capacidade de produção de biossurfactantes. Como matéria prima alternativa de baixo custo para produção biossurfactantes utilizou-se a borra oleosa proveniente do fundo de tanques de estocagem da REPLAN-PETROBRAS. Os ensaios foram realizados em triplicatas a 30C, 200 rpm, durante 168 horas e o acompanhamento foi realizado por amostra a cada 24 horas para quantificar o biossurfactantes e o crescimento celular. A tensão superficial, PH e os estudos de estabilidade e emulsificação foram realizados com o sobrenadante do cultivo de 168 horas. A cepa bacteriana mostrou-se capaz de se desenvolver e produzir biossurfactantes em querosene, óleo diesel, petróleo e borra oleosa. Apenas benzeno e tolueno não apresentam resultados positivos. / Pseudomonas aeruginosa LBI isolated from hydrocarbon contaminated soil and potential producer of biosurfactant was used for hydrocarbon biodegradation. The petroleum waste from REPLAN-PETROBRAS, alternative source of low cost to biosurfactante synthesis was utilized on medium culture. These studies were done at 30C with shaking at 200 rpm, during 168 hours, in triplicate. The samples were withdrawn daily for growth studies and biosurfactante production. The surface tension, PH and stability studies were done with the cell-free broth after 168 hours of incubation. The strain was able to produce biosurfactantes and to grow on the analyzed carbon sources, except benzene and toluene. When cultivated on diesel oil 30%, the strain produced higher quantities of biosurfactante. The biosurfactante was able to emulsifier all analyzed hidrocarbons. Stability studies of the product on the culture broth indicate that the biosurfactante is stable in extreme conditions. Therefore the strain Pseudomonas aeruginosas LBI and the biosurfactante produced have potential applications in bioremediation of site hydrocarbon contaminated, and possible application in enhanced oil recuperation.

A presença de bactérias patogênicas com capacidade de formar biofilme nos dispositivos de uso médico constitui um dos principais problemas na saúde pública. O biofilme confere proteção contra os mecanismos de defesa do hospedeiro e ação dos antimicrobianos, aumentando a virulência e resistência dos micro-organismos. A erradicação deste tipo de biofilmes é uma das principais estratégias no tratamento de doenças infecciosas associadas a bactérias patogênicas. A erradicação pode ser feita com o uso de biomoléculas produto do metabolismo secundário de diferentes micro-organismos. O objetivo deste estudo foi procurar novas moléculas com o potencial de erradicar biofilmes patogênicos associados a implantes médicos a partir de bactérias associadas ao género Drosera usando como bactérias alvo os patógenos Pseudomonas aeruginosa e Staphylococcus epidermidis. Para isto, foram crescidos 193 isolados bacterianos associados à planta Drosera que cresce na região litoral de Nova Tramandaí (RS) no sul do Brasil. Do total de isolados bacterianos foram usados os 36 que apresentaram atividade proteolítica para a produção de sobrenadantes bioativos. Os sobrenadantes bioativos foram usados para testes de erradicação de biofilme usando placas de 96 poços e a técnica de Cristal Violeta nas duas bactérias alvo. Nove isolados bacterianos associados à Drosera apresentaram atividade de erradicação de biofilme por acima de 40%, três deles para P. aeruginosa e seis para S. epidermidis. Destes isolados foi escolhido o isolado com melhor atividade de erradicação para P. aeruginosa e foram realizados testes para determinação da concentração mínima de erradicação de biofilme, antiformação de biofilme, viabilidade celular e microscopia eletrônica de varredura junto com a identificação da bactéria por médio de genes 16S, bem como o fracionamento bioguiado do sobrenadante. Adicionalmente, o sobrenadante bioativo foi testado in vitro em um modelo de dispositivo médico (cateter). A bactéria Gram-positiva que apresentou maior atividade de erradicação em seu sobrenadante possui 99% de similaridade com o Bacillus pumilus. Esta atividade de erradicação de biofilme de P. aeruginosa, pode ser atribuída à presença de uma molécula o composto de aproximadamente 34 kDa. Esta biomolécula o composto pode constituir uma alternativa complementária ao uso dos antibióticos convencionais. A perspectiva de purificar e caracterizar esta biomolécula ou composto para P. aeruginosa permitirá estudar seu mecanismo de ação e o uso no tratamento deste biofilme patogénico na clínica. / The presence of pathogenic bacteria with the ability to form biofilm on medical devices is one of the major problems in public health. The biofilm protects against the host defense mechanisms and the action of antibiotics, increasing the virulence and resistance of microorganisms. The elimination of this type of biofilms is a main strategy in the treatment of infectious diseases associated with pathogenic bacteria. This elimination can be done by using biomolecules from the secondary metabolism product of different micro-organisms. The objective of this study was to look for new molecules with the potential to eradicate pathogenic biofilms associated with medical implants from bacteria associated with gender Drosera using bacteria as targets Pseudomonas aeruginosa and Staphylococcus epidermidis pathogens. For this, were grown 193 bacterial isolates associated with Drosera plant that grows in the coastal region of New Tramandaí (RS) in southern Brazil. Of total bacterial isolates were used which had 36 proteolytic activity for the production of bioactive supernatants. The bioactive supernatants were used for biofilm eradication tests using 96- well plates and Crystal Violet technique in both target bacteria. Then the supernatant with the best eradication activity to P. aeruginosa was chosen to determine the minimum concentration to eradicate biofilm, biofilm inhibition, cell viability and scanning electron microscopy together with the identification of the bacteria by means of 16S and bioguided the fractionation of the supernatant. Additionally, the bioactive supernatant was tested in an in vitro model using the clinical device. Nine bacterial isolates associated with Drosera showed biofilm eradication activity by over 40%, three for P. aeruginosa and six for S. epidermidis. The Gram-positive bacterium with 99% similarity to the Bacillus pumilus showed the best biofilm eradication activity to P. aeruginosa capacity allocated to the presence of a molecule composed of approximately 34 kDa. These biomolecules can be an alternative to complement the use of conventional antibiotics or the direct use of antibiotic activity is presented as the case of bioactive found for P. aeruginosa supernatant. The prospect of purify and characterize this biomolecule or compound to P. aeruginosa will allow us to study this mechanism of action and the use in the treatment of this pathogenic biofilm in the clinic.

A presença de bactérias patogênicas com capacidade de formar biofilme nos dispositivos de uso médico constitui um dos principais problemas na saúde pública. O biofilme confere proteção contra os mecanismos de defesa do hospedeiro e ação dos antimicrobianos, aumentando a virulência e resistência dos micro-organismos. A erradicação deste tipo de biofilmes é uma das principais estratégias no tratamento de doenças infecciosas associadas a bactérias patogênicas. A erradicação pode ser feita com o uso de biomoléculas produto do metabolismo secundário de diferentes micro-organismos. O objetivo deste estudo foi procurar novas moléculas com o potencial de erradicar biofilmes patogênicos associados a implantes médicos a partir de bactérias associadas ao género Drosera usando como bactérias alvo os patógenos Pseudomonas aeruginosa e Staphylococcus epidermidis. Para isto, foram crescidos 193 isolados bacterianos associados à planta Drosera que cresce na região litoral de Nova Tramandaí (RS) no sul do Brasil. Do total de isolados bacterianos foram usados os 36 que apresentaram atividade proteolítica para a produção de sobrenadantes bioativos. Os sobrenadantes bioativos foram usados para testes de erradicação de biofilme usando placas de 96 poços e a técnica de Cristal Violeta nas duas bactérias alvo. Nove isolados bacterianos associados à Drosera apresentaram atividade de erradicação de biofilme por acima de 40%, três deles para P. aeruginosa e seis para S. epidermidis. Destes isolados foi escolhido o isolado com melhor atividade de erradicação para P. aeruginosa e foram realizados testes para determinação da concentração mínima de erradicação de biofilme, antiformação de biofilme, viabilidade celular e microscopia eletrônica de varredura junto com a identificação da bactéria por médio de genes 16S, bem como o fracionamento bioguiado do sobrenadante. Adicionalmente, o sobrenadante bioativo foi testado in vitro em um modelo de dispositivo médico (cateter). A bactéria Gram-positiva que apresentou maior atividade de erradicação em seu sobrenadante possui 99% de similaridade com o Bacillus pumilus. Esta atividade de erradicação de biofilme de P. aeruginosa, pode ser atribuída à presença de uma molécula o composto de aproximadamente 34 kDa. Esta biomolécula o composto pode constituir uma alternativa complementária ao uso dos antibióticos convencionais. A perspectiva de purificar e caracterizar esta biomolécula ou composto para P. aeruginosa permitirá estudar seu mecanismo de ação e o uso no tratamento deste biofilme patogénico na clínica. / The presence of pathogenic bacteria with the ability to form biofilm on medical devices is one of the major problems in public health. The biofilm protects against the host defense mechanisms and the action of antibiotics, increasing the virulence and resistance of microorganisms. The elimination of this type of biofilms is a main strategy in the treatment of infectious diseases associated with pathogenic bacteria. This elimination can be done by using biomolecules from the secondary metabolism product of different micro-organisms. The objective of this study was to look for new molecules with the potential to eradicate pathogenic biofilms associated with medical implants from bacteria associated with gender Drosera using bacteria as targets Pseudomonas aeruginosa and Staphylococcus epidermidis pathogens. For this, were grown 193 bacterial isolates associated with Drosera plant that grows in the coastal region of New Tramandaí (RS) in southern Brazil. Of total bacterial isolates were used which had 36 proteolytic activity for the production of bioactive supernatants. The bioactive supernatants were used for biofilm eradication tests using 96- well plates and Crystal Violet technique in both target bacteria. Then the supernatant with the best eradication activity to P. aeruginosa was chosen to determine the minimum concentration to eradicate biofilm, biofilm inhibition, cell viability and scanning electron microscopy together with the identification of the bacteria by means of 16S and bioguided the fractionation of the supernatant. Additionally, the bioactive supernatant was tested in an in vitro model using the clinical device. Nine bacterial isolates associated with Drosera showed biofilm eradication activity by over 40%, three for P. aeruginosa and six for S. epidermidis. The Gram-positive bacterium with 99% similarity to the Bacillus pumilus showed the best biofilm eradication activity to P. aeruginosa capacity allocated to the presence of a molecule composed of approximately 34 kDa. These biomolecules can be an alternative to complement the use of conventional antibiotics or the direct use of antibiotic activity is presented as the case of bioactive found for P. aeruginosa supernatant. The prospect of purify and characterize this biomolecule or compound to P. aeruginosa will allow us to study this mechanism of action and the use in the treatment of this pathogenic biofilm in the clinic.

Submitted by Marcelo Andrade Silva (marcelo.andradesilva@ufpe.br) on 2015-03-09T14:41:01Z No. of bitstreams: 2 DISSERTAÇÃO Valdemir Vicente da Silva Júnior.pdf: 1457648 bytes, checksum: c499026f0a26b07d06d850f098d6dc61 (MD5) license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-03-09T14:41:01Z (GMT). No. of bitstreams: 2 DISSERTAÇÃO Valdemir Vicente da Silva Júnior.pdf: 1457648 bytes, checksum: c499026f0a26b07d06d850f098d6dc61 (MD5) license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) Previous issue date: 2014 / Pseudomonas aeruginosa é uma bactéria gram-negativa conhecida por causar infecções oportunistas em diversos sítios do corpo humano principalmente tendo como destaque as infecções das vias aéreas. Estes patógenos apresentam resistência intrínseca a várias classes de agentes antimicrobianos, e notável habilidade em adquirir outros mecanismos de resistência, como por exemplo, a ação de enzimas beta-lactamases. Os genes que codificam essas enzimas geralmente são adquiridos através de mecanismos de transferência genética intra e/ou interespécies. A ação dessas beta-lactamases juntamente com outros mecanismos de resistência é frequentemente a razão das falhas terapêuticas durante o tratamento das infecções. Sendo assim, o presente estudo visou determinar a frequência genotípica de beta-lactamases do tipo ESBL (Beta-lactamases de espectro estendido) em isolados de P.aeruginosa provenientes do Hospital das Clínicas de Pernambuco (HC-UFPE). Os 159 isolados tiveram seu DNA extraído através do kit Brazol. O DNA obtido da extração foi quantificado e diluído para então iniciar a pesquisa genética através da técnica de PCR. Os isolados foram selecionados para pesquisa molecular de acordo com o perfil de resistência. Para o gene blaTEM, 1,41% (1/71) apresentou positividade; com relação ao blaGES observou-se que 2 isolados dos 54 testados (3,92%) carreavam o gene, após sequenciamento e análise in silico verificou-se que se tratava da GES-1; a tipagem molecular por ERIC-PCR demonstrou que os dois isolados são geneticamente relacionados. Esses achados possuem importância epidemiológica molecular dado que o gene blaGES em P.aeruginosa ainda não foi descrito no nordeste Brasileiro e o gene blaTEM em P.aeruginosa não foi relatado no Brasil; e portanto, servem de alerta para uma possível disseminação desses genes que contribuem de forma expressiva na resistência apresentada por isolados de P.aeruginosa.

Submitted by Fabio Sobreira Campos da Costa (fabio.sobreira@ufpe.br) on 2016-03-30T14:10:58Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) Mestrado_Digitalizado.pdf: 1089011 bytes, checksum: 59c4dfb2b409c96a5b5f1a41ee6f478f (MD5) / Made available in DSpace on 2016-03-30T14:10:58Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) Mestrado_Digitalizado.pdf: 1089011 bytes, checksum: 59c4dfb2b409c96a5b5f1a41ee6f478f (MD5) Previous issue date: 2013-02-15 / Pseudomonas aeruginosa é um patógeno oportunista responsável por infecções nosocomiais graves e que cada vez ganha destaque pelo desenvolvimento de multiressistência. O objetivo deste trabalho foi avaliar o sinergismo da β-lapachona com antimicrobianos convencionais e sua atividade sobre fatores de virulência. Inicialmente foram testadas dez cepas de Pseudomonas aeruginosa com fenótipo de resistência previamente definido. Destas, quatro cepas (LFBM 01, LFBM 02, LFBM 16, LFBM 18) apresentaram um perfil de resistência a ciprofloxacino, meropenem e cloridrato de cefepima e por essa razão foram selecionadas para este estudo. Para verificar o efeito sinérgico entre a β-lapachona e os agentes antimicrobianos, foi utilizou-se o método de checkerboard. Os critérios utilizados para avaliar a atividade sinérgica foram definidos pelo Índice da Concentração Inibitória Fracionada (FIC índex). A partir dos melhores valores do FIC índex das associações β- lapachona/antimicrobiano foram avaliadas a atividade destas sobre a produção de biofilme e piocianina. Os valores do FIC índex variaram de 0,12 a 0,50 indicando uma interação sinérgica para a maior parte das associações. O percentual de redução na formação do biofilme foi acima de 70% para todas as associações, exceto para β-lapachona/meropenem frente cepa LFBM 18. O percentual de redução na produção de piocianina variou de 89,% a 98,9% e de 36 a 69,9% para a associação da β-lapachona com cloridrato de cefepima e meropenem respectivamente. / Pseudomonas aeruginosa is an opportunistic pathogen responsible for serious nosocomial infections and that time is highlighted by the development of multiressistência. The objective of this study was to evaluate the synergy of β-lapachone with conventional antimicrobial agents and their activity on virulence factors. Initially were assayed ten strains of Pseudomonas aeruginosa with predetermined resistance phenotype. Of these four strains (LFBM 01, LFBM 02, LFBM 16, LFBM 18) presented one to ciprofloxacin resistance profile, meropenem and cefepime hydrochloride and therefore were selected for this study. To verify the synergistic effect between the β- lapachone and antimicrobial agents, was used the checkerboard method. The criteria used to evaluate the synergistic activity were defined by the Index of Fractional Inhibitory Concentration (FIC index). From the top of the FIC index values for β- lapachone / associations antimicrobial activity of these were evaluated for the production of pyocyanin and biofilm. The FIC index values ranged from 0.12 to 0.50 indicating a synergistic interaction for most organizations. The percentage reduction in biofilm formation was above 70% for all associations, except for β-lapachone / meropenem front strain LFBM 18. The percentage reduction in pyocyanin production ranged from 89% to 98.9% and 36 to 69.9% for the association of β-lapachone with cefepime hydrochloride and meropenem respectively.