O enfisema pulmonar é caracterizado pela destruição das paredes alveolares, sendo a fumaça de cigarro o principal agente etiológico. Pretendeu-se, neste estudo, comparar os efeitos terapêuticos do transplante de células mononucleares da medula óssea (BMMC) e células mesenquimais (CTM) em animais com enfisema pulmonar induzido por exposição à fumaça de cigarro. Camundongos fêmeas da linhagem C57Bl6/J foram expostos à fumaça de cigarro durante 90 dias e, 21 dias após o término do período de exposição, receberam BMMC ou CTM derivadas da medula óssea de camundongos machos da linhagem C57Bl6/J, expressando a proteína GFP. As análises morfométricas mostraram que os tratamentos com BMMC e CTM foram eficientes na recuperação do parênquima pulmonar dos animais expostos à fumaça de cigarro. Testes de fluorescência direta e PCR mostraram a migração de BMMC e CTM para o pulmão. Desta forma, pode-se concluir que, morfologicamente, a terapia celular com BMMC ou CTM é eficaz no tratamento do enfisema pulmonar resultante da exposição à fumaça de cigarro em modelo animal. / Pulmonary emphysema is characterized by destruction of alveolar walls, and the cigarette smoking is the main etiologic agent. It was intended in this study to compare the therapeutic effects of the transplantation of bone marrow mononuclear cells (BMMC) and mesenchymal stem cells (MSC) in animals with pulmonary emphysema induced by exposure to cigarette smoke. C57Bl6/J female mice were exposed to cigarette smoke for 90 days and 21 days after the end of the exposure time, received BMMC or MSC derived from bone marrow of C57Bl6/J male mice expressing the GFP protein. The morphometric analysis showed that treatments with BMMC and MSC were efficient in recovering the lung of animals exposed to cigarette smoke. Fluorescence and PCR tests showed the migration of BMMC and MSC to the lung. Thus, it is concluded the cell therapy with BMMC or CTM is morphologically effective in the treatment of pulmonary emphysema resulting from exposure to cigarette smoke in an animal model.

Objetivos: Verificar alterações na mecânica e parâmetros de morfometria pulmonar em um estudo temporal sobre enfisema em um modelo animal. Métodos:Setenta camundongos Balb / c receberam instilação nasal de solução de papaína ou salina e foram estudados no 1º, 3º, 15º, 28º e 40º dias após a instilação. Resistência das vias aéreas (Raw), Resistência do tecido (Gtis) e elastância tecidual (Htis), foram analisados. Intercepto Linear Médio (Lm), a proporção do volume de fibras elásticas e colágenas, macrófagos (MAC), o número de células que expressam MMP12 e a expressão de -isoprostano 8 no parênquima pulmonar, foram medidos. Resultados: Comparando os grupos papaína e solução salina ao longo do tempo, foi observado um aumento de Lm após o dia 28, associado a uma diminuição no Htis e Gtis. Houve um aumento na proporção do volume das fibras colágenas a partir do dia 15 até o dia 40, enquanto a proporção do volume de fibras elásticas foi aumentada somente no dia 40. Analisando o número de macrófagos, houve um aumento no dia 1 e manteve-se crescente até o dia 40. A expressão de MMP12 aumentou a partir do dia 3 até o dia 40. No entanto, a expressão de isoprostano 8 foi maior apenas no dias 1 e 3. Conclusão: Um aumento significativo no intercepto linear médio (Lm) após o dia 28 de instilação de papaína foi associado a uma piora na função pulmonar caracterizando assim o enfisema pulmonar. No entanto, no dia 40, as diferenças na morfometria foram mantidos, mas não houve diferenças na mecânica respiratória. O remodelamento da matriz extracelular observada no parênquima pulmonar no dia 40 poderia explicar estes resultados / Objectives: To verify how mechanical and morphometry parameters change in a temporal study of emphysema in an animal model. Methods: Balb/c mice received either a nasal drop of papain solution (Papa) or saline (Sal) and were studied on the 1st, 3rd, 15th, 28th and 40th days after instillation. We evaluated airway resistance (Raw), tissue damping (Gtis) and tissue elastance (Htis). Using morphometry, we measured mean linear intercept (Lm), volume proportion of elastic and collagen fibers, number of macrophages (MAC), number of cells expressing MMP12 and the expression of 8-isoprostane in parenchyma. Results: Comparing Papain and Saline groups in each time window, we observed an increase in Lm after the 28th day associated to a decrease in Htis and Gtis. The volume proportion of collagen fibers increased from the 15th to the 40th day, while the volume proportion of elastic fibers increased only on the 40th day. Analyzing the macrophages number, there was an increase on the 1st day, and it continued increasing until the 40th day. The expression of MMP12 increased from the 3rd until 40th day. However, the expression of 8-isoprostane increased only on the 1st and the 3rd day. Conclusions: A significant increase in mean linear intercept (Lm) after the 28th day of papain instillation was associated to a worsening in lung function. However, on the 40th day, differences in morphometry maintained but there were no differences in respiratory assessment. The extracellular matrix remodeling observed in lung parenchyma on the 40th day could explain these results

INTRODUÇÃO: Os macrófagos são células inflamatórias importantes no desenvolvimento e progressão do enfisema pulmonar e dependendo do estímulo do microambiente estas células podem ser diferenciadas em fenótipos M1 ou fenótipo M2. Os macrófagos de fenótipo M1 são reconhecidos como pró-inflamatórios enquanto que os macrófagos de fenótipo M2 são reconhecidos pela ação anti-inflamatória. O objetivo deste estudo foi caracterizar a polarização dos macrófagos em fenótipos M1 e M2 nos diferentes modelos experimentais de indução de enfisema pulmonar. MÉTODOS: foram utilizados camundongos C57BL/6 machos e foram divididos em quatro grupos experimentais, Grupo PPE (Elastase Pancreática de Porco): Animais que receberam instilação intranasal de 50 microL de PPE (0,667UI) com eutanásia no 28° dia; Grupo Salina: Animais que receberam instilação intranasal de 50 microL de soro fisiológico (SF) (0,9%) com eutanásia no 28° dia; Grupo Fumo: Animais que foram expostos à fumaça de cigarro durante 30 minutos, duas vezes por dia, 5 dias por semana consecutivos durante 12 semanas e Grupo Controle: Animais que foram mantidos no biotério e expostos ao ar ambiente por 12 semanas. Após eutanásia, os pulmões foram removidos, fixados em formaldeído e em seguida, foram feitos cortes para análise do intercepto linear médio (Lm) e contagem de células positivas para os macrófagos totais (MAC-2), interferon-gama (IFN)-gama e fator de necrose tumoral (TNF)-alfa, interleucina (IL)-10, transformação do fator do crescimento (TGF)-beta, metaloproteases (MMP)-9 e -12, no parênquima pulmonar. Pela técnica de ELISA foi avaliado no lavado broncoalveolar (LBA): IFN-gama e IL-12 (fenótipo M1) e IL-4, IL-10 e IL-13 (fenótipo M2). Pela técnica de PCR em tempo-real foi avaliada a expressão gênica para cluster of differentiation 68 (CD68), fator de regulação de interferon (Irf)-5, quimiocinas- CXC (CXCL9) e (CXCL10), o receptor de interleucina (IL)-12b e óxido nítrico sintase (iNOS) (fenótipo M1) e Irf-4, resistin-like molecule alpha (Fizz1), chitinase-3-like protein 3 (Ym1) e arginina-1 (Arg1) (fenótipo M2). RESULTADOS: Nossos resultados demonstraram aumento dos espaços aéreos distais e consequente presença de enfisema pulmonar nos dois grupos avaliados. Observamos redução da expressão gênica para CD68 no grupo PPE em comparação ao seu controle e tendência a aumento da expressão deste gene para o grupo Fumo comparado ao seu controle. A avaliação da expressão gênica para marcadores M1 revelou aumento para CXCL9 e CXCL10 nos grupos PPE, aumento de CXCL9 e redução de CXCL10 no grupo Fumo e redução de IL-12b no grupo Fumo comparados aos seus respectivos controles. A avaliação da expressão gênica para fenótipo M2, demonstrou diminuição de Arg1 e Fizz1 nos grupos PPE comparado ao salina. Pela técnica de ELISA encontramos uma redução de IL-4, IL-10 e IL-13 nos grupos PPE e aumento no grupo Fumo de IL-10, ambos comparados aos seus respectivos controles. Para a contagem de células positivas MAC-2, encontramos o aumento de macrófagos totais nos dois modelos avaliados, para marcadores de fenótipo M1, encontramos aumento de TNF-alfa e IFN-gama nos dois modelos avaliados, para marcadores de fenótipo M2, encontramos aumento de TGF-beta nos dois modelos de enfisema pulmonar avaliado. Entretanto para interleucina-10 encontramos uma redução no grupo PPE e aumento no grupo Fumo, ambos comparados aos seus respectivos controles. CONCLUSÃO: Demonstramos que os modelos induzidos pela exposição a fumaça de cigarro e instilação elastase resultaram em diferentes polarizações de macrófagos devido às diferenças do microambiente e que o modelo experimental de exposição à fumaça de cigarro foi o que melhor representou as características fisiológicas observadas em pacientes DPOC / Macrophages are important inflammatory cells on development and progression of pulmonary emphysema. Depending on microenvironment stimuli, these cells can differentiate into M1 or M2 phenotypes. Macrophages M1 phenotype play proinflammatory role whereas macrophages M2 phenotype play anti-inflammatory role. Our objective was to characterize the polarization of macrophages in M1 and M2 phenotypes in different experimental models of pulmonary emphysema induction. Male C57BL/6 mice were used and divided into four experimental groups. Group PPE (Porcine Pancreatic Elastase): Animals received intranasal instillation of 50 microL of PPE (0.677 IU) with euthanasia on the 28th day; Saline Group: Animals which received intranasal instillation of 50 microL SF (0.9%) with euthanasia on the 28th day; Cigarette Smoke Group: Animals exposed to cigarette smoke for 30 minutes, twice a day, 5 days a week for 12 weeks and Control Group: Animals that were exposed to ambient air for 12 weeks. After euthanasia, the lungs were removed, fixed in formaldehyde and then sectioned for analysis of the mean linear intercept (Lm) and counting of cells positive for total macrophages (MAC-2), interferon gamma (IFN-gama), factor Tumor necrosis (TNF-alfa), interleukin (IL)-10, transforming growth factor beta (TGF)-beta, matrix metalloproteinases- (MMP)-9 e -12 in the lung parenchyma through the immunohistochemistry technique. In order to evaluate the expression of proteins we used ELISA technique for IFN-gama and IL-12 (M1 phenotype) and IL-4, IL-10 and IL-13 (M2 phenotype) by bronchoalveolar lavage (BAL). They were also evaluated by gene expression analysis by the Real Time-PCR technique for cluster of differentiation 68 (CD68), interferon regulating factor (Irf-5), chemokines CXC (CXCL9) and (CXCL10), subunit beta of interleukin 12 (IL-12b) and nitric oxide synthase (iNOS) and for M2 phenotypes were analyzed Irf4, found in inflammatory zone- 1(Fizz1), chitinase type-1 (Ym1) and arginine-1 (Arg1) molecules. RESULTS: Our results demonstrated an increase in distal air spaces and consequent presence of pulmonary emphysema in both groups. Also, we observed reduction of CD-68 gene expression in PPE group compared to his control and tendency to increase the expression on Cigarette Smoke group (CS) compared to his Control. The evaluation of gene expression for M1 markers revealed an increase for CXCL9 and CXCL10 in the PPE groups, increase of CXCL-9 and reduction of CXCL10 on CS group and reduction of IL-12b on CS group compared to their respective controls. The evaluation of gene expression for M2 phenotype demonstrated a decrease of Arg1 and Fizz1 in PPE groups compared to saline group. By ELISA technique, we found reduction of IL-4, IL-10 and IL-13 on PPE groups, while we did not observe statistical difference in CS group, both compared to their respective controls. The TNF-alfa and IFN-gama positive cells counts showed an increase for both groups in the two models evaluated, for M2 phenotype we found an increase for TGF-beta in both emphysema models whereas for IL-10 we found a reduction in PPE group and increase on CS group, both compared to their respective controls. CONCLUSIONS: We demonstrated that the models induced by exposure to cigarette smoke and elastase instillation resulted in different macrophages polarizations due to differences in the microenvironment and that the experimental model of exposure to cigarette smoke was the one that best represented the physiological characteristics observed in COPD patients

INTRODUÇÃO: Os macrófagos são células inflamatórias importantes no desenvolvimento e progressão do enfisema pulmonar e dependendo do estímulo do microambiente estas células podem ser diferenciadas em fenótipos M1 ou fenótipo M2. Os macrófagos de fenótipo M1 são reconhecidos como pró-inflamatórios enquanto que os macrófagos de fenótipo M2 são reconhecidos pela ação anti-inflamatória. O objetivo deste estudo foi caracterizar a polarização dos macrófagos em fenótipos M1 e M2 nos diferentes modelos experimentais de indução de enfisema pulmonar. MÉTODOS: foram utilizados camundongos C57BL/6 machos e foram divididos em quatro grupos experimentais, Grupo PPE (Elastase Pancreática de Porco): Animais que receberam instilação intranasal de 50 microL de PPE (0,667UI) com eutanásia no 28° dia; Grupo Salina: Animais que receberam instilação intranasal de 50 microL de soro fisiológico (SF) (0,9%) com eutanásia no 28° dia; Grupo Fumo: Animais que foram expostos à fumaça de cigarro durante 30 minutos, duas vezes por dia, 5 dias por semana consecutivos durante 12 semanas e Grupo Controle: Animais que foram mantidos no biotério e expostos ao ar ambiente por 12 semanas. Após eutanásia, os pulmões foram removidos, fixados em formaldeído e em seguida, foram feitos cortes para análise do intercepto linear médio (Lm) e contagem de células positivas para os macrófagos totais (MAC-2), interferon-gama (IFN)-gama e fator de necrose tumoral (TNF)-alfa, interleucina (IL)-10, transformação do fator do crescimento (TGF)-beta, metaloproteases (MMP)-9 e -12, no parênquima pulmonar. Pela técnica de ELISA foi avaliado no lavado broncoalveolar (LBA): IFN-gama e IL-12 (fenótipo M1) e IL-4, IL-10 e IL-13 (fenótipo M2). Pela técnica de PCR em tempo-real foi avaliada a expressão gênica para cluster of differentiation 68 (CD68), fator de regulação de interferon (Irf)-5, quimiocinas- CXC (CXCL9) e (CXCL10), o receptor de interleucina (IL)-12b e óxido nítrico sintase (iNOS) (fenótipo M1) e Irf-4, resistin-like molecule alpha (Fizz1), chitinase-3-like protein 3 (Ym1) e arginina-1 (Arg1) (fenótipo M2). RESULTADOS: Nossos resultados demonstraram aumento dos espaços aéreos distais e consequente presença de enfisema pulmonar nos dois grupos avaliados. Observamos redução da expressão gênica para CD68 no grupo PPE em comparação ao seu controle e tendência a aumento da expressão deste gene para o grupo Fumo comparado ao seu controle. A avaliação da expressão gênica para marcadores M1 revelou aumento para CXCL9 e CXCL10 nos grupos PPE, aumento de CXCL9 e redução de CXCL10 no grupo Fumo e redução de IL-12b no grupo Fumo comparados aos seus respectivos controles. A avaliação da expressão gênica para fenótipo M2, demonstrou diminuição de Arg1 e Fizz1 nos grupos PPE comparado ao salina. Pela técnica de ELISA encontramos uma redução de IL-4, IL-10 e IL-13 nos grupos PPE e aumento no grupo Fumo de IL-10, ambos comparados aos seus respectivos controles. Para a contagem de células positivas MAC-2, encontramos o aumento de macrófagos totais nos dois modelos avaliados, para marcadores de fenótipo M1, encontramos aumento de TNF-alfa e IFN-gama nos dois modelos avaliados, para marcadores de fenótipo M2, encontramos aumento de TGF-beta nos dois modelos de enfisema pulmonar avaliado. Entretanto para interleucina-10 encontramos uma redução no grupo PPE e aumento no grupo Fumo, ambos comparados aos seus respectivos controles. CONCLUSÃO: Demonstramos que os modelos induzidos pela exposição a fumaça de cigarro e instilação elastase resultaram em diferentes polarizações de macrófagos devido às diferenças do microambiente e que o modelo experimental de exposição à fumaça de cigarro foi o que melhor representou as características fisiológicas observadas em pacientes DPOC / Macrophages are important inflammatory cells on development and progression of pulmonary emphysema. Depending on microenvironment stimuli, these cells can differentiate into M1 or M2 phenotypes. Macrophages M1 phenotype play proinflammatory role whereas macrophages M2 phenotype play anti-inflammatory role. Our objective was to characterize the polarization of macrophages in M1 and M2 phenotypes in different experimental models of pulmonary emphysema induction. Male C57BL/6 mice were used and divided into four experimental groups. Group PPE (Porcine Pancreatic Elastase): Animals received intranasal instillation of 50 microL of PPE (0.677 IU) with euthanasia on the 28th day; Saline Group: Animals which received intranasal instillation of 50 microL SF (0.9%) with euthanasia on the 28th day; Cigarette Smoke Group: Animals exposed to cigarette smoke for 30 minutes, twice a day, 5 days a week for 12 weeks and Control Group: Animals that were exposed to ambient air for 12 weeks. After euthanasia, the lungs were removed, fixed in formaldehyde and then sectioned for analysis of the mean linear intercept (Lm) and counting of cells positive for total macrophages (MAC-2), interferon gamma (IFN-gama), factor Tumor necrosis (TNF-alfa), interleukin (IL)-10, transforming growth factor beta (TGF)-beta, matrix metalloproteinases- (MMP)-9 e -12 in the lung parenchyma through the immunohistochemistry technique. In order to evaluate the expression of proteins we used ELISA technique for IFN-gama and IL-12 (M1 phenotype) and IL-4, IL-10 and IL-13 (M2 phenotype) by bronchoalveolar lavage (BAL). They were also evaluated by gene expression analysis by the Real Time-PCR technique for cluster of differentiation 68 (CD68), interferon regulating factor (Irf-5), chemokines CXC (CXCL9) and (CXCL10), subunit beta of interleukin 12 (IL-12b) and nitric oxide synthase (iNOS) and for M2 phenotypes were analyzed Irf4, found in inflammatory zone- 1(Fizz1), chitinase type-1 (Ym1) and arginine-1 (Arg1) molecules. RESULTS: Our results demonstrated an increase in distal air spaces and consequent presence of pulmonary emphysema in both groups. Also, we observed reduction of CD-68 gene expression in PPE group compared to his control and tendency to increase the expression on Cigarette Smoke group (CS) compared to his Control. The evaluation of gene expression for M1 markers revealed an increase for CXCL9 and CXCL10 in the PPE groups, increase of CXCL-9 and reduction of CXCL10 on CS group and reduction of IL-12b on CS group compared to their respective controls. The evaluation of gene expression for M2 phenotype demonstrated a decrease of Arg1 and Fizz1 in PPE groups compared to saline group. By ELISA technique, we found reduction of IL-4, IL-10 and IL-13 on PPE groups, while we did not observe statistical difference in CS group, both compared to their respective controls. The TNF-alfa and IFN-gama positive cells counts showed an increase for both groups in the two models evaluated, for M2 phenotype we found an increase for TGF-beta in both emphysema models whereas for IL-10 we found a reduction in PPE group and increase on CS group, both compared to their respective controls. CONCLUSIONS: We demonstrated that the models induced by exposure to cigarette smoke and elastase instillation resulted in different macrophages polarizations due to differences in the microenvironment and that the experimental model of exposure to cigarette smoke was the one that best represented the physiological characteristics observed in COPD patients

O presente estudo tem como objetivo investigar a ação da insulina no desenvolvimento da resposta inflamatória aguda e crônica do enfisema pulmonar induzido por elastase pancreática de porco (EPP). Ratos machos da raça Wistar (aloxana, 42 mg/kg, i.v., 10 dias) e ratos controle foram instilados com solução salina fisiológica contendo EPP (0.25 UI/0.2 mL, pulmão direito) ou salina (pulmão esquerdo). Foram realizadas as seguintes análises: a) número de leucócitos presentes no lavado broncoalveolar dos animais, 6 h após a instilação com salina ou elastase (fase aguda); b) diâmetro médio alveolar (m), quantificação das fibras elásticas e colágenas (%), análise radiográfica do volume pulmonar e número de macrófagos alveolares (mm2) 50 dias após instilação com salina ou EPP (fase crônica). Ratos diabéticos apresentaram uma redução de 42% no número de neutrófilos presentes no lavado broncoalveolar, um aumento de 20% do diâmetro médio alveolar, um aumento de 15% do volume pulmonar e uma diminuição de 33% das fibras elásticas nos septos alveolares, sem alteração na quantidade de fibras colágenas. Não houve diferença no número de macrófagos. Tratamento dos ratos diabéticos com 4 UI de insulina NPH, 2 h após a instilação de elastase restaurou completamente o número de neutrófilos do lavado broncoalveolar. O diâmetro médio alveolar, volume pulmonar e a fração de área de fibras elásticas presentes nos septos alveolares foram semelhantes aos valores observados nos ratos controle, após o tratamento com 4 UI de insulina 2 h após a instilação, seguida de 2 UI/dia pelos próximos 50 dias. Além disso, observou-se aumento do número de macrófagos em ratos diabéticos tratados com insulina. Os resultados sugerem que a insulina modula o desenvolvimento das fases aguda e crônica do enfisema pulmonar induzido por EPP, assegurando uma reparação e remodelamento tecidual dentro dos limites da normalidade / The present study was undertaken to investigate the role of insulin in the development of acute and chronic inflammatory responses in porcine pancreatic elastase (PPE)-induced pulmonary emphysema. Diabetic male Wistar rats (alloxan, 42 mg/kg, i.v., 10 days) and control rats were instilled with physiological saline solution containing PPE (0.25 IU/0.2 mL, right lung) or saline only (left lung). The following analyses were performed: a) number of leukocytes in the bronchoalveolar lavage (BAL) fluid of the animals, 6 h after saline or PPE instillation (acute phase); b) mean alveolar diameter (m), quantification of elastic and collagen fibers (%), radiographic analyses of lung volume, and number of alveolar macrophages (mm2) 50 days after saline or PPE instillation (chronic phase). Relative to controls, alloxan-induced diabetic rats presented 42% reduction in the number of neutrophils in BAL fluid, 20% increase in mean alveolar diameter, 15% increase in lung volume, 33% decrease of elastic fibers in alveolar septa, without changes in the content of collagen fibers. There were no differences in the number of macrophages. Treatment of diabetic rats with 4 IU neutral protamine Hagedorn (NPH) insulin, 2 h before elastase instillation restored the number of neutrophils in BAL fluid. Mean alveolar diameter, lung volume, and elastic fibers in alveolar septa matched the values observed in control rats, after treatment with 4 IU NPH insulin 2 h before instillation, followed by 2 IU/day for the next 50 days. Furthermore, increased number of macrophages was observed in insulin-treated diabetic rats. Data presented suggest that insulin modulates the development of acute and chronic phases of PPE-induced pulmonary emphysema, assuring normal repair and tissue remodeling.

O enfisema pulmonar é um dos maiores problemas de saúde pública atualmente. É caracterizado pela destruição permanente das paredes alveolares levando ao alargamento do espaço aéreo, à perda de retração elástica, à diminuição da superfície de troca gasosa, à hiperexpansão pulmonar e ao aumento do trabalho respiratório. Diferentes abordagens cirúrgicas são realizadas em pacientes enfisematosos, sendo a cirurgia redutora de volume pulmonar (CRVP) uma das mais utilizadas, devido à melhora imediata da qualidade de vida dos pacientes. Várias hipóteses são consideradas para explicar essa melhora, como o aumento do fluxo expiratório máximo, o aumento da elasticidade pulmonar, o aumento da capacidade vital e o crescimento pulmonar compensatório (CPC), sendo esta última uma das mais estudadas. Em modelos animais, a lobectomia (LBX) é utilizada para mimetizar a CRVP, pois o pulmão remanescente sofre rápido CPC, com restabelecimento de peso, volume, quantidade de DNA e níveis de proteínas do pulmão após 3 semanas. Este estudo teve o objetivo de investigar as mudanças estruturais e funcionais que ocorrem no pulmão após a LBX através de parâmetros morfométricos. Para tanto, utilizamos um modelo animal de enfisema pulmonar induzido pela instilação intratraqueal de elastase pancreática suína. Os efeitos do CPC foram avaliados 2 (T2), 4 (T4) e 16 (T16) semanas após a bilobectomia (ressecção dos lobos médio e cardíaco do pulmão direito). Os animais enfisematosos submetidos à LBX apresentaram: diminuição do intercepto linear médio (T2 e T16); aumento da proporção de fibras elásticas (T2 e T16); melhora da elastância pulmonar (T4 e T16); e CPC devido ao aumento de peso e volume pulmonar (T2 e T4) e aumento do volume total da região respiratória (T4 e T16) e do tecido respiratório (T2, T4 e T16). Concluímos que a bilobectomia promoveu o CPC nos animais enfisematosos com a reestruturação da arquitetura alveolar e melhora da função respiratória / Currently, the pulmonary emphysema is a major public health issues. It is characterized by permanent destruction of alveolar walls leading to airspace enlargement, elastic retraction loss, gas exchange surface reduction, lung overexpansion and increased breathing effort. Different surgical approaches are performed in patients with emphysema. Lung volume reduction surgery (LVRS) is one of the most widely used, due to immediate improvement in life quality of these patients. Several hypotheses are considered to explain this improvement, such as increasing the maximum expiratory flow, improved lung elasticity, increased vital capacity, and compensatory lung growth (CLG), which is one of the most studied. In animal models, lobectomy (LBX) is used to mimic LVRS because the remaining lung undergoes rapid CLG, with restoration of weight, volume, amount of DNA and protein levels of the lung after three weeks. This study investigated the structural and functional changes that occur in the lungs after LBX by morphometric parameters. We used an animal model of pulmonary emphysema induced by intratracheal instillation of porcine pancreatic elastase. The CLG effects were evaluated 2 (T2), 4 (T4) and 16 (T16) weeks after bilobectomy (resection of the middle and cardiac lobes of the right lung). After lobectomy, the emphysematous animals presented: mean linear intercept decrease (T2 and T16); increased proportion of elastic fibers (T2 and T16); lung elastance improvement (T4 and T16); and CLG due to the increase of both weight and volume of the lung (T2 and T4), beside the increase of total volume of respiratory region (T4 and T16) and respiratory tissue (T2, T4 and T16). We conclude that bilobectomy promoted the CLG in emphysematous animals by the restructuring of alveolar architecture and respiratory function improvement

Orientador: Prof. Dr. Sergio Daishi Sasaki / Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do ABC, Programa de Pós-Graduação em Biossistemas, 2015. / Embora a doença pulmonar obstrutiva crônica (DPOC)seja uma das maiores causas de morbidade e mortalidade no mundo, ainda não há tratamento que reverta àdestruição do parênquima pulmonarobservadas nestes pacientes. O desenvolvimento de modelos experimentais,que mimetizam as características e os mecanismos fisiopatológicos envolvidos no enfisema,por meioda instilação de uma protease,éde extrema relevância uma vez que podem contribuirpara o desenvolvimento de futuras estratégias terapêuticas. Uma das causas atribuídas para o aparecimento da doença éo tabagismo, no entanto, fatores genéticose fatoresambientais como a poluição também estão envolvidos com o aparecimento da doença em humanos. Algumas enzimas estão envolvidas no processo de instalação da doença como as metaloproteases 9 e 12 e as serinoproteases, especificamente a elastase de neutrófilos humana. Em um projeto anterior,utilizando o inibidor de serinoproteases recombinante rBmTI-Ano modelo de indução deenfisema pulmonar em camundongos,foi observado que esta molécula é capaz de interferir na progressão do enfisema pulmonar, o rBmTI-A é um inibidor pertencente à família Kunitz-BPTI e possui dois domínios inibitórios com atividade sobre tripsina, calicreína plasmática humana e elastase de neutrófilos humana. Neste projeto,foi utilizadooinibidor rBmTI-6,também pertencente à família Kunitz-BPTI,porém contendo três domínios inibitórios com atividade sobre tripsina bovinae plasmina. Uma amostra de rBmTI-6 previamente purificada por cromatografia de afinidadeem tripsina-sepharosefoiaplicada emuma cromatografia de troca iônica, coluna Resource Q,que separou osdomínios inibitóriosem domínio 1 (rBmTI-6-d1)e domínios 2e 3 (rBmTI-6-d2/3). O rBmTI-6-d1teve suaconcentraçãoativa determinada em 1,5µMe a constante de inibição (Ki)sobre tripsina bovina determinado em 1,95nM, este domínio purificado apresentou 77% de atividade específica (inibidor ativo em relação à proteína total da amostra). O rBmTI-6-d1 foi utilizado em um experimentono modelo experimental de enfisema pulmonar.Neste experimento o enfisema foi induzido utilizando a instilação por via nasal de elastase pancreática porcina(PPE)e 1 hora depois da instilaçãocom PPEfoi feito o tratamento coma instilaçãorBmTI-6-d1. Vinte e um dias após a instilação de PPEe rBmTI-6-d1 foi feita a analise da função respiratória para os14 parâmetros de elastância tecidual (Htis),resistência tecidual (Gtis)eresistência das vias aéreas (Raw). Animais induzidos ao enfisema e tratados com o rBmTI-6-d1apresentaram valores de elastância tecidual (Htis)e resistência tecidual (Gtis) próximasaosvalores dosgrupos controles, cujos animais não foram induzidos ao enfisema, os animais não tratados com rBmTI-6-d1 apresentaram aumento de Htis e Gtis. Para o parâmetro de resistência das vias aéreas o resultado mostra uma tendência de redução deste parâmetro para animais tratados com rBmTI-6-d1. Os resultados da medida do intercepto linear médio (Lm), apontam uma tendência ao grupo que foi induzido ao enfisema e tratado com rBmTI-6-d1 de redução da Lm em comparação com o grupo induzido ao enfisema e não tratado.Estes resultados sugerem que o inibidor teve papel de prevenir a instalação do enfisema pulmonar nos animais tratados com rBmTI-6-d1. / Although chronic obstructive pulmonary disease (COPD) is a major cause of morbidity and mortality worldwide, there is no treatment to reverse the destruction of the lung parenchymaobserved in these patients. The development of experimental models that mimic the characteristics and pathophysiological mechanisms of emphysema by instillationone protease is extremely important since it can contribute to the development of future therapeutic strategies. One of the causes associated with the onset of the disease is smoking, however, genetic factors and environmental factors such as pollutionare also involved in disease in humans. Some enzymes are involved in the installation process of the disease like metalloproteases 9 and 12 and serineproteases, specifically human neutrophil elastase. In a previous study using recombinant serineprotease inhibitor rBmTI-A in a pulmonary emphysema model with mice was observed that this molecule is capable of interfering with the progression of the disease, rBmTI-A is an inhibitor belongingto the Kunitz-BPTI family and has two inhibitory domains with activity towardtrypsin, human plasmakallikreinand human neutrophil elastase. In this project, a sample of rBmTI-6 inhibitor also belongs to the Kunitz-BPTI family, previously purified by affinity chromatography on trypsin-sepharose was used, the sample was purified again using an ion exchange chromatography with Resource Q column, where it was observed a separation of the inhibitory domains. The domain 1 (rBmTI-6-d1) had their active concentration determined in 1,5?M. The rBmTI-6-d1 had a Ki on certain bovine trypsin in 1,95nM this purified domain had 77% specific activity (active inhibitor in the total protein of the sample). The rBmTI-6-d1 was selectedfor the experiments with an experimental model of pulmonary emphysema. In these experiments emphysema was induced by intranasal instillation of porcine pancreatic elastase (PPE) and 1 hour after PPE instillation, the treatment with rBmTI-6-d1. Twenty-one days after instillation of PPE and rBmTI-6-d1 was made the analysis of respiratory function to tissue elastance parameters (Htis), tissue resistance (Gtis) and airway resistance (Raw). Animals induced emphysema and treated with rBmTI-6-d1 showedtissue elastance values (Htis) and tissue resistance (Gtis) close to the values of the control groups, whose animals were not induced emphysema, untreated animals with rBmTI-6-d1 increased by Htis and Gtis. For the air way resistance the result shows a tendency to decrease in this parameter for animals treated with rBmTI-6-d1. The results of measuring the mean linear intercept (Lm), show a tendency to emphysema group that was induced and treated with -rBmTI6-d1 Lm reduced in comparison with the experimental group and the untreated emphysema. These results suggest that the inhibitory role was to prevent the development of pulmonary emphysema in animals treated with rBmTI6-d1.

A Doença Pulmonar Obstrutiva Crônica (DPOC) destaca-se como um grave problema de saúde no mundo. O enfisema pulmonar, dentro do espectro das DPOC, caracteriza-se pelo alargamento dos espaços aéreos distais resultante da destruição do parênquima pulmonar. O tabagismo é considerado o principal fator relacionado ao surgimento da patologia. Considerando a escassez de aparelhos comercializados para exposição à fumaça de cigarro, bem como o elevado custo dos existentes, o presente projeto propôs um modelo experimental de enfisema por exposição à fumaça utilizando um novo aparato. Foram realizadas avaliações morfométricas e funcionais nos pulmões de ratos expostos à fumaça ou ao ar ambiente. Além disso, o peso dos animais foi aferido semanalmente. Os resultados indicaram alargamento dos espaços aéreos pulmonares, além de redução do ganho de peso nos animais expostos. Não houve diferenças funcionais entre os grupos controle e experimental. O trabalho objetivou o desenvolvimento de um aparato eficiente e menos custoso para estudos relacionados ao enfisema pulmonar. / The Chronic Obstructive Pulmonary Disease (COPD) stands out as a serious health problem in the world. The pulmonary emphysema, in the spectrum of COPD, has as main feature the enlargement of the airspaces distal resulting from destruction of lung parenchyma. Smoking is considered the main factor related to the development of pathology. Considering the lack of machines marketed for exposure to cigarette smoke, as well as the high cost of devices available, the currently project has proposed a experimental model of pulmonary emphysema induced by the use of a new apparatus. Were performed morphometric and functional measurements in the lung of rats exposed to cigarette smoke or clean air. Further, the animal weight was measured weekly. The results indicated enlargement of the pulmonary airspaces, as well as reduction of weight gain in animals exposed. There were no functional differences between control and experimental groups. The current study aimed to the development of an efficient and less costly apparatus for experimental studies related to the pulmonary emphysema.

Objetivos: Verificar alterações na mecânica e parâmetros de morfometria pulmonar em um estudo temporal sobre enfisema em um modelo animal. Métodos:Setenta camundongos Balb / c receberam instilação nasal de solução de papaína ou salina e foram estudados no 1º, 3º, 15º, 28º e 40º dias após a instilação. Resistência das vias aéreas (Raw), Resistência do tecido (Gtis) e elastância tecidual (Htis), foram analisados. Intercepto Linear Médio (Lm), a proporção do volume de fibras elásticas e colágenas, macrófagos (MAC), o número de células que expressam MMP12 e a expressão de -isoprostano 8 no parênquima pulmonar, foram medidos. Resultados: Comparando os grupos papaína e solução salina ao longo do tempo, foi observado um aumento de Lm após o dia 28, associado a uma diminuição no Htis e Gtis. Houve um aumento na proporção do volume das fibras colágenas a partir do dia 15 até o dia 40, enquanto a proporção do volume de fibras elásticas foi aumentada somente no dia 40. Analisando o número de macrófagos, houve um aumento no dia 1 e manteve-se crescente até o dia 40. A expressão de MMP12 aumentou a partir do dia 3 até o dia 40. No entanto, a expressão de isoprostano 8 foi maior apenas no dias 1 e 3. Conclusão: Um aumento significativo no intercepto linear médio (Lm) após o dia 28 de instilação de papaína foi associado a uma piora na função pulmonar caracterizando assim o enfisema pulmonar. No entanto, no dia 40, as diferenças na morfometria foram mantidos, mas não houve diferenças na mecânica respiratória. O remodelamento da matriz extracelular observada no parênquima pulmonar no dia 40 poderia explicar estes resultados / Objectives: To verify how mechanical and morphometry parameters change in a temporal study of emphysema in an animal model. Methods: Balb/c mice received either a nasal drop of papain solution (Papa) or saline (Sal) and were studied on the 1st, 3rd, 15th, 28th and 40th days after instillation. We evaluated airway resistance (Raw), tissue damping (Gtis) and tissue elastance (Htis). Using morphometry, we measured mean linear intercept (Lm), volume proportion of elastic and collagen fibers, number of macrophages (MAC), number of cells expressing MMP12 and the expression of 8-isoprostane in parenchyma. Results: Comparing Papain and Saline groups in each time window, we observed an increase in Lm after the 28th day associated to a decrease in Htis and Gtis. The volume proportion of collagen fibers increased from the 15th to the 40th day, while the volume proportion of elastic fibers increased only on the 40th day. Analyzing the macrophages number, there was an increase on the 1st day, and it continued increasing until the 40th day. The expression of MMP12 increased from the 3rd until 40th day. However, the expression of 8-isoprostane increased only on the 1st and the 3rd day. Conclusions: A significant increase in mean linear intercept (Lm) after the 28th day of papain instillation was associated to a worsening in lung function. However, on the 40th day, differences in morphometry maintained but there were no differences in respiratory assessment. The extracellular matrix remodeling observed in lung parenchyma on the 40th day could explain these results

O presente estudo tem como objetivo investigar a ação da insulina no desenvolvimento da resposta inflamatória aguda e crônica do enfisema pulmonar induzido por elastase pancreática de porco (EPP). Ratos machos da raça Wistar (aloxana, 42 mg/kg, i.v., 10 dias) e ratos controle foram instilados com solução salina fisiológica contendo EPP (0.25 UI/0.2 mL, pulmão direito) ou salina (pulmão esquerdo). Foram realizadas as seguintes análises: a) número de leucócitos presentes no lavado broncoalveolar dos animais, 6 h após a instilação com salina ou elastase (fase aguda); b) diâmetro médio alveolar (m), quantificação das fibras elásticas e colágenas (%), análise radiográfica do volume pulmonar e número de macrófagos alveolares (mm2) 50 dias após instilação com salina ou EPP (fase crônica). Ratos diabéticos apresentaram uma redução de 42% no número de neutrófilos presentes no lavado broncoalveolar, um aumento de 20% do diâmetro médio alveolar, um aumento de 15% do volume pulmonar e uma diminuição de 33% das fibras elásticas nos septos alveolares, sem alteração na quantidade de fibras colágenas. Não houve diferença no número de macrófagos. Tratamento dos ratos diabéticos com 4 UI de insulina NPH, 2 h após a instilação de elastase restaurou completamente o número de neutrófilos do lavado broncoalveolar. O diâmetro médio alveolar, volume pulmonar e a fração de área de fibras elásticas presentes nos septos alveolares foram semelhantes aos valores observados nos ratos controle, após o tratamento com 4 UI de insulina 2 h após a instilação, seguida de 2 UI/dia pelos próximos 50 dias. Além disso, observou-se aumento do número de macrófagos em ratos diabéticos tratados com insulina. Os resultados sugerem que a insulina modula o desenvolvimento das fases aguda e crônica do enfisema pulmonar induzido por EPP, assegurando uma reparação e remodelamento tecidual dentro dos limites da normalidade / The present study was undertaken to investigate the role of insulin in the development of acute and chronic inflammatory responses in porcine pancreatic elastase (PPE)-induced pulmonary emphysema. Diabetic male Wistar rats (alloxan, 42 mg/kg, i.v., 10 days) and control rats were instilled with physiological saline solution containing PPE (0.25 IU/0.2 mL, right lung) or saline only (left lung). The following analyses were performed: a) number of leukocytes in the bronchoalveolar lavage (BAL) fluid of the animals, 6 h after saline or PPE instillation (acute phase); b) mean alveolar diameter (m), quantification of elastic and collagen fibers (%), radiographic analyses of lung volume, and number of alveolar macrophages (mm2) 50 days after saline or PPE instillation (chronic phase). Relative to controls, alloxan-induced diabetic rats presented 42% reduction in the number of neutrophils in BAL fluid, 20% increase in mean alveolar diameter, 15% increase in lung volume, 33% decrease of elastic fibers in alveolar septa, without changes in the content of collagen fibers. There were no differences in the number of macrophages. Treatment of diabetic rats with 4 IU neutral protamine Hagedorn (NPH) insulin, 2 h before elastase instillation restored the number of neutrophils in BAL fluid. Mean alveolar diameter, lung volume, and elastic fibers in alveolar septa matched the values observed in control rats, after treatment with 4 IU NPH insulin 2 h before instillation, followed by 2 IU/day for the next 50 days. Furthermore, increased number of macrophages was observed in insulin-treated diabetic rats. Data presented suggest that insulin modulates the development of acute and chronic phases of PPE-induced pulmonary emphysema, assuring normal repair and tissue remodeling.