Les récepteurs purinergiques P2X sont des canaux ioniques activés par l’ATP. Ils sont exprimés très largement dans l’organisme, et possèdent de nombreux rôles physiologiques et pathologiques. Les récepteurs P2X4 en particulier ont été impliqués dans les processus de douleur chronique. Suite à une lésion nerveuse, l’expression des récepteurs P2X4 est induite de novo dans la microglie spinale activée, où ils sont responsables de l’hypersensibilité mécanique caractéristique des douleurs neuropathiques.Notre étude montre que les récepteurs P2X4 neuronaux sont également des acteurs centraux dans plusieurs processus pathologiques, et notamment dans la douleur inflammatoire périphérique chronique. Les récepteurs P2X4 sont exprimés par les neurones sensoriels des ganglions rachidiens et semblent impliqués dans la libération du BDNF dans la corne dorsale de la moëlle épinière. Cette libération conduit à l’activation des voies de signalisation de la voie BDNF/TrkB, et en particulier à la diminution de l’expression de KCC2. Ce processus est en partie responsable de l’allodynie tactile et de l’hyperalgésie mécanique observée en cas de douleur inflammatoire chronique. Notre étude a également permis d’étendre cette hypothèse à un modèle d’excitotoxicité in vitro dans l’hippocampe, mimant une activité épileptiforme. Nos résultats indiquent que les récepteurs P2X4 neuronaux pourraient être des acteurs importants de la libération de BDNF dans l’hippocampe lors d’un évènement excitotoxique. / Purinergic receptors P2X are ATP-gated ion channels widely expressed in the organism and involved in many physiological and pathological states. Particularly, P2X4 receptors have been involved in chronic pain. Following nerve injury, their expression is induced de novo in activated spinal cord microglia where they are responsible for the BDNF release leading to tactile allodynia, a characteristic of neuropathic pain. Our study shows that neuronal P2X4 receptors are crucial actors of other pathological processes, including inflammatory pain. We show that P2X4R are expressed in sensory neurons in dorsal root ganglions and seem involved in BDNF release in the spinal cord. This release leads to activation of BDNF/TrkB signalization pathways, and particularly to the downregulation of KCC2. This process underlies the spinal hyperexcitability in chronic inflammatory pain states. These results have been extended to model of excitotoxicity in the hippocampus mimicking the lesions caused by an epileptic activity. Our preliminary results suggest that neuronal P2X4 receptors are likely major actors in the BDNF release in the hippocampus following an excitotoxicitic insult.

Thèse numérisée par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal.

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L'inflammation joue un rôle clé dans de nombreuses pathologies, telles que les maladies inflammatoires chroniques, les désordres métaboliques et le cancer. L'un de ses médiateurs le plus puissant est l'interleukine-1β (IL-1β), qui est une cytokine pro-inflammatoire participant à tous les stades de l'inflammation et de l'immunité. Son activation est régulée par un complexe multi-protéique nommé inflammasome, dont la caspase-1 active en découlant est responsable du clivage et de la maturation de l'IL-1β. Huit types d'inflammasomes activant et clivant la pro-caspase-1 ont été identifiés et contiennent tous la protéine ASC (apoptosis-associated speck-like protein containing a CARD). Les inflammasomes partagent un signal intracellulaire commun et le mécanisme menant à leur assemblage et leur activation n'est pas totalement élucidé. L'utilisation de la lignée cellulaire humaine monocytaire, THP-1, différenciée en macrophages grâce à un ester de phorbol, le TPA, a permis la mise en place d'un modèle d'étude de modulateurs de l'inflammasome en conditions stériles. Ce modèle a permis l'étude des mécanismes impliqués suite à des signaux issus de l'inflammation chronique, tels que l'ATP et les espèces réactives de l'oxygène (ROS). Ce travail montre qu'il existe une synergie entre ATP et ROS, qui agissent grâce à une boucle d'activation impliquant probablement plusieurs inflammasomes, dont NLRP3. Des donneurs de NO connus (trinitrine et isosorbide dinitrate) ou nouveau (dérivé de purine) ont montré une activité anti-inflammatoire. D'autres composés ont été identifiés comme de potentiels inhibiteurs d'inflammasome (extraits de dattes et dérivé de purine portant un acide lipoïque)

L’inflammation joue un rôle clé dans de nombreuses pathologies, telles que les maladies inflammatoires chroniques, les désordres métaboliques et le cancer. L’un de ses médiateurs le plus puissant est l’interleukine-1β (IL-1β), qui est une cytokine pro-inflammatoire participant à tous les stades de l’inflammation et de l’immunité. Son activation est régulée par un complexe multi-protéique nommé inflammasome, dont la caspase-1 active en découlant est responsable du clivage et de la maturation de l’IL-1β. Huit types d’inflammasomes activant et clivant la pro-caspase-1 ont été identifiés et contiennent tous la protéine ASC (apoptosis-associated speck-like protein containing a CARD). Les inflammasomes partagent un signal intracellulaire commun et le mécanisme menant à leur assemblage et leur activation n’est pas totalement élucidé. L’utilisation de la lignée cellulaire humaine monocytaire, THP-1, différenciée en macrophages grâce à un ester de phorbol, le TPA, a permis la mise en place d’un modèle d’étude de modulateurs de l’inflammasome en conditions stériles. Ce modèle a permis l’étude des mécanismes impliqués suite à des signaux issus de l’inflammation chronique, tels que l’ATP et les espèces réactives de l’oxygène (ROS). Ce travail montre qu’il existe une synergie entre ATP et ROS, qui agissent grâce à une boucle d’activation impliquant probablement plusieurs inflammasomes, dont NLRP3. Des donneurs de NO connus (trinitrine et isosorbide dinitrate) ou nouveau (dérivé de purine) ont montré une activité anti-inflammatoire. D’autres composés ont été identifiés comme de potentiels inhibiteurs d’inflammasome (extraits de dattes et dérivé de purine portant un acide lipoïque) / Inflammation has a pivotal role in several disorders, such as chronic inflammatory diseases, metabolic disorders and cancer. Interleukin-1β (IL-1β) is one of the most powerful mediators in this mechanism. IL-1β is a pro-inflammatory cytokine which is implicated in every step of inflammation and immunity. IL-1β is regulated by a multi-protein complex named inflammasome, in which active caspase-1 is responsible for IL-1β processing and maturation. Eight inflammasomes processing and activating pro-caspase-1 has been identified and all contain the adaptor protein ASC (apoptosis-associated speck-like protein containing a CARD). Inflammasomes share a common intracellular signal and the mechanism for their structural assembly and activation is not totally clear. The human monocytic cell line, THP-1, has been used and cells have been differentiated in macrophages by the phorbol ester, TPA. Based on this, a cellular pattern has been established for studying inflammasome modulators under sterile conditions. This pattern allowed the study of implicated mechanisms in chronic inflammatory signals, such as ATP and reactive oxygen species (ROS). This study shows that ATP and ROS synergize for activating inflammasomes and NLRP3 and act in an autocrine loop. Stimulation with others natural or synthetic compounds has been realized for characterization of their inflammatory activity. Therapeutic NO donors (trinitrin and isosorbide dinitrate) and a new NO donor (purine nitrate ester) have been characterized for their anti-inflammatory activity. Others compounds from a new category of inflammasome inhibitors have been identified (date fruit extracts and lipoic acid purine derivative)

Cette thèse s’inscrit dans le cadre de l’étude de la relation structure-activité d’analogues de ligands naturels de récepteurs nicotiniques et purinergiques. Ce travail se divise en deux parties.<p><p>Dans la première partie de cette thèse, nous avons réalisé la synthèse d’analogues de la 11-homosédinone, alcaloïde isolé de la plante Sedum acre, qui présente une activité agoniste sur différents récepteurs nicotiniques du système nerveux central. Les différents analogues ont été synthétisé par application de la méthoxylation anodique pour introduire succesivement deux substituants en postion 2 et 6 d’un noyau pipéridinique. Les analogues synthétisés se différencient par la nature du noyau aromatique, la présence d’un groupement méthyle sur l’atome d’azote de la pipéridine et l’oxydation du sustituant en position 2. Ce travail a notamment permis de montré l’importance du groupement N-méthyle vis-à-vis de l’activité des analogues. Nous avons également pu mettre en évidence que l’introduction d’un halogène sur le noyau aromatique diminuait l’activité de l’analogue sur le récepteur a7 tout en augmentant l’acitivité sur le récepteur a4b2 et que l’introduction d’un noyau furanique permettait d’augmenter la sélectivité vis-à-vis du récepteur a4b2 tandis que l’introduction sur le noyau aromatique d’un groupement nitro ou méthoxy conduit à une perte totale de l’activité.<p><p>Dans la seconde partie de cette thèse, nous avons réalisé la synthèse d’analogues de la dATP, afin d’évaluer leur effet agoniste sur le récepteur P2Y11, impliqué dans différents mécanismes de différentiation cellulaire, dont notamment celui de la maturation des cellules leucémiques HL60 en cellules de type neutrophile. Les analogues synthétisés se différencient de la dATP par la présence d’un groupement méthylène ou dichlorométhylène entre les phosphores b et g de la chaîne polyphosphate, ainsi que par l’estérification de l’alcool en position 3’ du sucre. Ce travail a pu confirmer que les analogues en série 2’-désoxy conduisent à de meilleures activités que ceux de la série 2’-OH. Nous avons également pu montrer que l’estérification de la position 3’ conduit à une diminution de l’activité agoniste, à l’exception du groupement a-naphtoyle qui conduit à une augmentation significative de l’activité sur P2Y11.<p><p> / Doctorat en sciences, Spécialisation chimie / info:eu-repo/semantics/nonPublished

L’ATP est bien connue pour son rôle de transporteur d'énergie à l’intérieur des cellules, mais en dehors de la cellule, elle agit en tant que molécule de signalisation extracellulaire. En se liant aux récepteurs purinergiques, l’ATP extracellulaire amorce la signalisation purinergique afin de réguler certains processus physiologiques et pathophysiologiques. Dans les poumons, l’ATP stimule la sécrétion de surfactant et promeut la clairance mucociliaire. Compte tenu du rôle critique de l’ATP extracellulaire dans les poumons, il est important de comprendre le mécanisme du relargage d’ATP cellulaire — la première étape de la signalisation purinergique. Parce que les forces mécaniques constituent le déclencheur principal du relargage d’ATP, cette thèse a pour but d’investiguer le(s) mécanisme(s) physiologique(s) et les sources cellulaires d’un tel relargage d’ATP mécanosensible. Cet ouvrage est divisé en trois parties : 1) Pour étudier les caractéristiques spatiales et temporelles du relargage d’ATP, j’ai développé une technique d’imagerie hautement sensible basée sur la bioluminescence de la luciférine-luciférase couplée avec un système de lentilles à grand champ de vision (WFOV, wide field of view) optimisant l’apport de lumière. Pour évaluer notre approche d’imagerie, j’ai soumis des cellules A549, dérivées d’un adénocarcinome pulmonaire humain, à un étirement ou un choc hypotonique de 50% pour déclencher un relargage d’ATP. J’ai démontré que notre technique nous permet de quantifier précisément la quantité et le taux (ou l’efflux) d’ATP s’échappant des cellules. Le WFOV constitue un outil essentiel utilisé dans les études décrites dans cette thèse pour déterminer le mécanisme et la source cellulaire du relargage d’ATP dans l’alvéole. 2) Afin d’examiner le mécanisme physiologique du relargage d’ATP induit par l’étirement dans les cellulaires alvéolaires primaires, j’ai déterminé les contributions individuelles des cellules alvéolaires de type 1 (AT1) en comparaison des cellules alvéolaires de type 2 (AT2). Pour ce faire, des cellules AT2 fraîchement isolées de poumons de rats ont été ensemencées sur une chambre flexible en silicone et cultivées jusqu’à sept jours, ce qui permettait aux cellules AT2 de se transdifférencier progressivement en cellules semblables aux cellules AT1. Le ratio des cellules alvéolaires (AT2:AT1), étant de 4:1 au jour 3, est devenu 1:4 au jour 7. La quantité d'ATP libérée diminuait avec le nombre décroissant de cellules AT2, les impliquant en tant que principale source pour le relargage d’ATP en réponse à un étirement. Alors que les modulateurs pharmacologiques des canaux d’ATP, carbenoxolone et probénécide, ne diminuaient pas la quantité d’ATP libérée, le BAPTA, un chélateur de calcium intracellulaire ([Ca2+]i), l’a significativement réduite. De même, ces trois modulateurs exercent des effets similaires sur les réponses calciques intracellulaires mesurées par le Fura-2, suggérant une connexion entre le relargage d’ATP et les niveaux de [Ca2+]i. 3) Pour explorer le rôle qu’ont les propriétés viscoélastiques de la membrane dans le relargage d’ATP mécanosensible, j’ai démontré qu’une déformation de 30% induisait un relargage d’ATP transitoire qui était accompagné d’une absorption d’iodure de propidium (PI, propidium iodide) chez des cellules AT2. Ceci est cohérent avec une rupture membranaire transitoire induite par une déformation, assez large pour le passage d’ATP et de PI. L’efflux d’ATP augmente aussi selon le taux de déformation, et la durée de déformation prolonge la demi-vie du relargage d’ATP. Donc, ces résultats fournissent des indices sur la manière dont l’étirement de la membrane viscoélastique peut mener au relargage d’ATP par un mécanisme alternatif impliquant une mécanoporation de la membrane cellulaire. Dans l’ensemble, ces résultats démontrent que le relargage d’ATP ne se produit pas à travers les canaux conduisant l’ATP mais plutôt par une mécanoporation transitoire de la membrane. D’autres études sur les dommages membranaires sont nécessaires pour mieux comprendre sa contribution dans le relargage d’ATP mécanosensible et les signaux de [Ca2+]i. De telles études élucideront la signalisation purinergique dans les organes qui sont constamment exposés à des contraintes physiques. Ceci pourrait suggérer des cibles/approches thérapeutiques pour moduler les impacts négatifs d’un relargage d’ATP excessif observés lors de certaines conditions pathologiques, telles que les lésions pulmonaires induites par la ventilation mécanique. / ATP is widely known to be an energy carrier within cells, but outside of the cell, it acts as an extracellular signaling molecule. Upon binding to purinergic receptors, extracellular ATP initiates the purinergic signaling to regulate certain physiological and pathophysiological processes. In the lungs, ATP stimulates surfactant secretion and promotes mucociliary clearance. Given the critical role of extracellular ATP in the lungs, it is important to understand the mechanism of cellular ATP release — the first step of purinergic signaling. Because mechanical forces constitute the primary trigger of ATP release, this thesis aims to investigate the physiological mechanism(s) and cellular sources of such mechanosensitive ATP release. This work is divided into three parts: 1) To study the spatial and temporal characteristics of ATP release, I developed a highly sensitive imaging technique based on luciferin-luciferase bioluminescence coupled with a custom-designed lens system, which combined a wide field of view (WFOV) and high light-gathering power. To evaluate our imaging approach, I subjected A549 cells, derived from human lung adenocarcinoma, to stretch or 50% hypotonic shock to trigger ATP release. I demonstrated that our technique allows us to precisely quantify the amount and the rate (or efflux) of ATP escaping from cells. The WFOV constitutes an essential tool used in the studies described in this thesis to determine the mechanism and cellular source of ATP release in the alveolus. 2) To examine the physiological mechanism of stretch-induced ATP release in primary alveolar cells, I determined the individual contributions of alveolar type 1 (AT1) in comparison with alveolar type 2 (AT2) cells. To this end, freshly isolated AT2 cells from rat lungs were seeded on a flexible silicone chamber and were cultured for up to seven days, which allowed AT2 cells to progressively transdifferentiate into AT1-like cells. The ratio of alveolar cells (AT2:AT1), being 4:1 on day 3, became 1:4 on day 7. The quantity of released ATP decreased with the decreasing numbers of AT2 cells, implicating them as the main source of ATP release in response to stretch. While pharmacological ATP channel modulators, carbenoxolone and probenecid, did not diminish the amount of ATP release, BAPTA, an intracellular calcium ([Ca2+]i) chelator, significantly reduced it. Likewise, these three modulators had similar effects on intracellular calcium responses measured by Fura-2, suggesting a connection between ATP release and [Ca2+]i levels. 3) To explore the role of membrane viscoelastic properties in mechanosensitive ATP release, I demonstrated that a 30% strain induced transient ATP release that was accompanied by uptake of propidium iodide (PI) in AT2 cells. This is consistent with a strain-induced transient membrane rupture, big enough for the passage of ATP and PI. ATP efflux also increases with strain rate, and hold time prolongs the half-life of ATP release. Thus, these results provide clues on how stretching of the viscoelastic membrane may lead to ATP release via an alternate mechanism involving transient mechanoporation of the cell membrane. Overall, these findings demonstrate that stretch-induced ATP release does not occur through ATP-conducting channels but rather a transient membrane mechanoporation. Further studies on membrane injury induced by strain are needed to better understand its contribution to mechanosensitive ATP release and [Ca2+]i signaling. Such studies will elucidate purinergic signaling in organs that are constantly exposed to physical stresses. This could suggest novel therapeutic targets/approach to modulate the negative impacts of excessive ATP release observed under certain pathological conditions, such as ventilator-induced lung injury.