The development of improved sequencing technologies hasenabled the field of genomics to evolve. Handling andsequencing of large numbers of samples require an increasedlevel of automation in order to obtain high throughput andconsistent quality. Improved performance has lead to thesequencing of numerous microbial genomes and a few genomes fromhigher eukaryotes and the benefits of comparing sequences bothwithin and between species are now becoming apparent. Thisthesis describes both the development of automated purificationmethods for DNA, mainly sequencing products, and a comparativesequencing project. The initially developed purification technique is dedicatedto single stranded DNA containing vector specific sequences,exemplified by sequencing products. Specific capture probescoupled to paramagnetic beads together with stabilizing modularprobes hybridize to the single stranded target. After washing,the purified DNA can be released using water. When sequencingproducts are purified they can be directly loaded onto acapillary sequencer after elution. Since this approach isspecific it can be applied to multiplex sequencing products.Different probe sets are used for each sequencing product andthe purifications are performed iteratively. The second purification approach, which can be applied to anumber of different targets, involves biotinylated PCR productsor sequencing products that are captured using streptavidinbeads. This has been described previously, buthere theinteraction between streptavidin and biotin can be disruptedwithout denaturing the streptavidin, enabling the re-use of thebeads. The relatively mild elution conditions also enable therelease of sensitive biotinylated molecules. Another project described in this thesis is the comparativesequencing of the 40 kbcagpathogenicity island (PAI) in fourHelicobacter pyloristrains. The results included thediscovery of a novel gene, present in approximately half of theSwedish strains tested. In addition, one of the strainscontained a major rearrangement dividing thecagPAI into two parts. Further, information about thevariability of different genes could be obtained. Keywords:DNA sequencing, DNA purification, automation,solid-phase, streptavidin, biotin, modular probes,Helicobacter pylori,cagPAI. / <p>NR 20140805</p>

Helicobacter pylori colonizes the human stomach, where it causes gastritis that may develop into peptic ulcer disease or cancer when left untreated. Neisseria gonorrhoeae colonizes the urogenital tract and causes the sexually transmitted disease gonorrhea. In contrast, Lactobacillus species are part of the human microbiota, which is the resident microbial community, and are considered to be beneficial for health. The first host cell types that bacteria encounter when they enter the body are epithelial cells, which form the border between the inside and the outside, and macrophages, which are immune cells that engulf unwanted material.       The focus of this thesis has been the interaction between the host and bacteria, aiming to increase our knowledge of the molecular mechanisms that underlie the host responses and their effects on bacterial pathogenicity. Understanding the interactions between bacteria and the host will hopefully enable the development of new strategies for the treatment of infectious disease. In paper I, we investigated the effect of N. gonorrhoeae on the growth factor amphiregulin in cervical epithelial cells and found that the processing and release of amphiregulin changes upon infection. In paper II, we examined the expression of the transcription factor early growth response-1 (EGR1) in epithelial cells during bacterial colonization. We demonstrated that EGR1 is rapidly upregulated by many different bacteria. This upregulation is independent of the pathogenicity, Gram-staining type and level of adherence of the bacteria, but generally requires viable bacteria and contact with the host cell. The induction of EGR1 is mediated primarily by signaling through EGFR, ERK1/2 and β1-integrins. In paper III, we described the interactions of the uncharacterized protein JHP0290, which is secreted by H. pylori, with host cells. JHP0290 is able to bind to several cell types and induces apoptosis and TNF release in macrophages. For both of these responses, signaling through Src family kinases and ERK is essential. Apoptosis is partially mediated by TNF release. Finally, in paper IV, we showed that certain Lactobacillus strains can reduce the colonization of H. pylori on gastric epithelial cells. Lactobacilli decrease the gene expression of SabA and thereby inhibit the binding mediated by this adhesin. / <p>At the time of the doctoral defense, the following papers were unpublished and had a status as follows: Paper 2: Manuscript. Paper 4: Manuscript.</p>

Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario / Con el fin de detectar, por primera vez en Chile, la presencia de Helicobacter pylori y organismos Helicobacter heilmannii-like en el estómago de perros, se realizó la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) a biopsias gástricas de 10 perros que fueron positivos a la prueba de ureasa. Para la detección de H. pylori se utilizó una secuencia génica de la citotoxina vacuolizante (vac A) y para la detección de H. heilmannii-like se utilizó una secuencia génica de 112 pares de bases (pb) de ARN 16S, específico para este grupo de bacterias. Se obtuvo positividad en 5/10 perros para H. pylori y positividad en 6/10 perros para H. heilmannii-like. Dos individuos fueron positivos a ambas bacterias y un individuo negativo para ambas bacterias. A partir de estos resultados y con el fin de diagnosticar bacterias H. pylori y/o bacterias H. heilmannii-like en biopsias gástricas endoscópicas de perros, se recomienda la utilización de PCR, idealmente antecedido por la prueba rápida de ureasa. / Proyecto FIV no. 4602019

Presentada a la Universidad de Chile para optar al Grado de Doctora en Farmacología / Helicobacter pylori (H. pylori) es una patógeno gástrico humano asociado al desarrollo de cáncer gástrico. En células epiteliales gástricas, la infección con H. pylori promueve la activación de diversas vías de señalización asociadas tanto a la progresión como al arresto del ciclo celular. Por otro lado, H. pylori ha demostrado inducir los niveles del Factor Inducible por Hipoxia-1α (HIF-1α), un factor transcripcional relacionado con la expresión de genes necesarios para la progresión tumoral. Fuera de sus funciones canónicas, se ha descrito que, en el contexto de la hipoxia, HIF-1α es capaz de promover arresto del ciclo celular en la fase G1 como parte de una acción no transcripcional. No obstante esto, HIF- 1α puede ser inducido por la activación de la vía PI3K/Akt/mTOR, vía de señalización relacionada con progresión del ciclo celular que ha sido asociada también a la acción de H. pylori. Aunque se ha descrito que la infección con H. pylori promueve la inducción de HIF-1α, actualmente no hay antecedentes precisos acerca de la vía de señalización precedente a este fenómeno, así como tampoco de su efecto sobre el destino de las células epiteliales gástricas. En este trabajo se buscó determinar si HIF-1α representa una transición desde señales que promueven un progreso del ciclo celular hacia un arresto del ciclo celular en la infección con H. pylori. En consecuencia, se propuso estudiar si H. pylori, al activar la vía PI3K/Akt/mTOR, podría llevar a un aumento de los niveles de HIF-1α y éste, a su vez, llevar a una respuesta de arresto del ciclo celular. Para estudiar esto, se utilizó un modelo in vitro basado en células humanas derivadas de cáncer gástrico MKN45 y AGS y la cepa de H. pylori 26695. Los resultados indican que H. pylori induce un aumento transitorio de HIF-1α con localización principalmente nuclear. Al inhibir farmacológicamente la vía PI3K/Akt/mTOR, se obtuvo que la inhibición de PI3K con LY294002 y de mTOR con Rapamicina fueron capaces de prevenir la inducción de HIF-1α por H. pylori. Al silenciar HIF-1α se obtuvo una reducción del arresto del ciclo celular en G0/G1 promovido por la bacteria. Consecuente con esto, los niveles de la proteína ciclina D1, importante para lograr la transición G1/S del ciclo celular, fueron diminuidos por la infección con H. pylori, sin embargo, esta diminución fue menos severa en las células que se silenció HIF-1α. En cuanto a su actividad transcripcional, se observó que al silenciar HIF-1α se previno el aumento del mRNA de GLUT-1 promovido por H. pylori sólo a tiempos tempranos de infección, pero éstos no fueron afectados a tiempos mayores. Por lo demás, el análisis bioinformático mostró que la infección con H. pylori no incrementó significativamente la expresión de genes blancos clásicos de HIF-1α en la mucosa antral. Finalmente, al analizar la acción de los componentes solubles o de la pared de H. pylori sobre la inducción de HIF-1α, se obtuvo que ninguno de ellos fue capaz de promover este efecto, sólo el contacto directo entre el patógeno vivo y el hospedero fue necesario para promover un aumento de los niveles de la proteína. En resumen, los resultados sugieren que H. pylori promueve un aumento de HIF-1α a través de la activación de PI3K y mTOR, y que esta inducción permite el arresto de células gástricas en la fase G0/G1 del ciclo celular. Además, HIF-1α tendría una participación menor en la expresión de su gen blanco GLUT-1. Finalmente, los datos sugieren que el factor de virulencia posiblemente implicado en este fenómeno requiere de la interacción directa entre H. pylori y la célula gástrica para ejercer su función / Helicobacter pylori (H. pylori) is a human gastric pathogen whose presence is linked to gastric carcinogenesis. In gastric epithelial cells, H. pylori infection promotes activation of several signaling pathways associated with both cell cycle progression and cell cycle arrest. On another hand, H. pylori has been linked to the induction of Hipoxia Inducible Factor -1α (HIF-1α), a transcription factor involved in the expression of several genes required for tumor progression. In addition to its canonical functions, in the context of hypoxia, HIF- 1α has been shown to promote cell cycle arrest in G1 phase as a nontranscriptional mode of action. HIF-1α induction in normoxia by activation of the PI3K/Akt/mTOR pathway has been described, and signaling via this pathway related to cell cycle progression also has been linked to H. pylori infection. However, although H. pylori reportedly promotes HIF-1α induction, currently little data is available concerning the signaling pathway(s) by which H. pylori promotes HIF-1α induction, as well as the consequences of such induction for cell fate. In this study, we sought to determine whether HIF-1α mediates the transition from cell cycle progression to cell cycle arrest observed following H. pylori infection. Thus, we evaluated whether activation of the PI3K/Akt/mTOR pathway increases HIF-1α levels and whether this leads to cell cycle arrest. To do so, these studies employed as in vitro models the human gastric cancer cell lines MKN45 and AGS as well as the H. pylori 26695 strain. The results indicate that H. pylori induces transient HIF-1α increases and enhances nuclear localization of the transcription factor. Pharmacological inhibiton of the PI3K/Akt/mTOR pathway revealed that the PI3K inhibitor LY294002 and the mTOR inhibitor Rapamycin precluded H. pylori-enhanced HIF-1α induction. HIF-1α silencing prevented H. pylori-induced cell cycle arrest in G0/G1 phase. Consequently, cyclin D1, an important protein for G1-S phase transition, decreased following H. pylori infection, and this decrease was less dramatic in HIF-1α knockdown gastric cells. With respect to HIF-1α transcriptional activity, we observed that HIF-1α silencing precluded increases in GLUT-1 mRNA promoted by H. pylori at early stages of infection only. Furthermore, bioinformatic analysis revealed that H. pylori infection was not associated with an increase in the expression of classical HIF-1α target genes in antral mucosa. Finally, analysis of the contribution of soluble components or components from the bacterial wall to HIF-1α induction, revealed that none of them individually were sufficient to promote the effect. Rather, the direct interaction between live bacteria and gastric cells was neccessary for H. pylori to increase HIF-1α protein levels. In summary, the results obtained in this thesis suggest that H. pylori increases of HIF-1α protein levels in normoxia through PI3K and mTOR activation, and that this induction promotes cell cycle arrest in the G0/G1 phase. Furthermore, HIF-1α appears to participate to some extent in modulating the expression of the target gene GLUT-1. Finally, the putative virulence factor involved in these events requires the direct interaction between bacteria and the host cell to exert its effect / Conicyt; Fondecyt; Fondap

Made available in DSpace on 2017-07-21T14:13:06Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Bruno Rodrigo Minozzo.pdf: 2630206 bytes, checksum: 3bd9ced03193a1954969ce2be98510b3 (MD5) Previous issue date: 2015-12-02 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / A mucosa gástrica é continuamente exposta a agentes lesivos endógenos (ácido clorídrico, pepsina, bile, espécies reativas de oxigênio) e exógenos (álcool, anti-inflamatórios, fumo, Helicobacter pylori) que estão envolvidos na patogênese das úlceras. De uma forma geral é aceito que a doença ocorre quando há um desbalanço entre os fatores de proteção e os de agressão. A espécie Euphorbia umbellata (Pax) Bruyns, comumente conhecida como ―janaúba‖, possui indicações populares para o tratamento de inúmeras doenças, incluindo as úlceras do trato gastrintestinal. Até o momento são poucos os estudos que avaliam possíveis ações farmacológicas deste vegetal frente a esta patologia. Dessa forma, buscou-se nesse trabalho avaliar o potencial antiúlcera da fração metanólica (FM) das cascas de E. umbellata e estudar os mecanismos de ação envolvidos. O efeito gastroprotetor da fração metanólica foi testado frente a modelos agudos de úlcera induzidos por etanol e indometacina em ratos. As formas de ação foram investigadas pelo uso de inibidores farmacológicos como L-NAME (70 mg.Kg-1, i. p.), aminoguanidina (AMG, 100 mg.Kg-1, i. p.), azul de metileno (AZM, 20 mg.Kg-1, i. p.) e indometacina (30 mg.Kg-1, s. c.). Avaliou-se o envolvimento de compostos sulfidrílicos totais (SH-T) e não protéicos (SH-NP), assim como a atividade da enzima catalase de animais tratados com a FM. Analisou-se também a ação da FM sobre Helicobacter pylori e inibição da urease in vitro. Além disso, a ação antioxidante da FM foi verificada frente ao DPPH•, ABTS•+, O2•-, HOCl, TauCl e HRP. O potencial redutor do soro dos ratos foi testado na captura do ABTS•+. Alterações histológicas no tecido estomacal dos animais teste também foram averiguadas. O tratamento via oral com FM (200 mg.Kg-1) proporcionou gastroproteção de 89,7 % para o etanol e 88,5 % para a indometacina. Histologicamente a FM conferiu proteção ao epitélio, sem maiores danos a integridade da mucosa. O tratamento com L-NAME, AMG e AZM reverteu a ação antiúlcera apresentada pela FM nos modelos anteriores, bem como o uso de indometacina também minimizou os seus efeitos. As respostas obtidas nos testes antioxidantes mostram a habilidade de captura de radicais e espécies reativas de oxigênio pela FM, além de sua ação inibitória em modelo de peroxidase. Elevação dos níveis de SH-T foram vistos no soro de animais tratados, muito embora SH-NP e CAT não tenham sofrido alterações significativas. O soro de ratos tratados com a FM aumentou 7,46 % a captura de ABTS•+ comparado ao controle negativo. Para o teste antimicrobiano a FM alcançou 44,16 % de inibição do crescimento do H. pylori na concentração de 256 μg.mL-1. No teste anti-urease a FM apresentou bloqueio enzimático de 78,62 % em 1024 μg.mL-1. As atividades biológicas da FM de E. umbellata podem estar associadas à presença de compostos fenólicos derivados de ácido gálico, elágico, flavonoides e taninos, detectados pela técnica de LC-MS pela primeira vez nessa espécies vegetal. Em conjunto os resultados obtidos permitem sugerir que o efeito gastroprotetor da FM possa estar relacionado à presença dos polifenólicos, bem como aliado ao seu potencial scavenger sobre espécies reativas, ativação da via óxido nítrico/monofosfato de guanosina cíclico e ciclooxigenases e ações anti-H. pylori e anti-ureasex / A mucosa gástrica é continuamente exposta a agentes lesivos endógenos (ácido clorídrico, pepsina, bile, espécies reativas de oxigênio) e exógenos (álcool, anti-inflamatórios, fumo, Helicobacter pylori) que estão envolvidos na patogênese das úlceras. De uma forma geral é aceito que a doença ocorre quando há um desbalanço entre os fatores de proteção e os de agressão. A espécie Euphorbia umbellata (Pax) Bruyns, comumente conhecida como ―janaúba‖, possui indicações populares para o tratamento de inúmeras doenças, incluindo as úlceras do trato gastrintestinal. Até o momento são poucos os estudos que avaliam possíveis ações farmacológicas deste vegetal frente a esta patologia. Dessa forma, buscou-se nesse trabalho avaliar o potencial antiúlcera da fração metanólica (FM) das cascas de E. umbellata e estudar os mecanismos de ação envolvidos. O efeito gastroprotetor da fração metanólica foi testado frente a modelos agudos de úlcera induzidos por etanol e indometacina em ratos. As formas de ação foram investigadas pelo uso de inibidores farmacológicos como L-NAME (70 mg.Kg-1, i. p.), aminoguanidina (AMG, 100 mg.Kg-1, i. p.), azul de metileno (AZM, 20 mg.Kg-1, i. p.) e indometacina (30 mg.Kg-1, s. c.). Avaliou-se o envolvimento de compostos sulfidrílicos totais (SH-T) e não protéicos (SH-NP), assim como a atividade da enzima catalase de animais tratados com a FM. Analisou-se também a ação da FM sobre Helicobacter pylori e inibição da urease in vitro. Além disso, a ação antioxidante da FM foi verificada frente ao DPPH•, ABTS•+, O2•-, HOCl, TauCl e HRP. O potencial redutor do soro dos ratos foi testado na captura do ABTS•+. Alterações histológicas no tecido estomacal dos animais teste também foram averiguadas. O tratamento via oral com FM (200 mg.Kg-1) proporcionou gastroproteção de 89,7 % para o etanol e 88,5 % para a indometacina. Histologicamente a FM conferiu proteção ao epitélio, sem maiores danos a integridade da mucosa. O tratamento com L-NAME, AMG e AZM reverteu a ação antiúlcera apresentada pela FM nos modelos anteriores, bem como o uso de indometacina também minimizou os seus efeitos. As respostas obtidas nos testes antioxidantes mostram a habilidade de captura de radicais e espécies reativas de oxigênio pela FM, além de sua ação inibitória em modelo de peroxidase. Elevação dos níveis de SH-T foram vistos no soro de animais tratados, muito embora SH-NP e CAT não tenham sofrido alterações significativas. O soro de ratos tratados com a FM aumentou 7,46 % a captura de ABTS•+ comparado ao controle negativo. Para o teste antimicrobiano a FM alcançou 44,16 % de inibição do crescimento do H. pylori na concentração de 256 μg.mL-1. No teste anti-urease a FM apresentou bloqueio enzimático de 78,62 % em 1024 μg.mL-1. As atividades biológicas da FM de E. umbellata podem estar associadas à presença de compostos fenólicos derivados de ácido gálico, elágico, flavonoides e taninos, detectados pela técnica de LC-MS pela primeira vez nessa espécies vegetal. Em conjunto os resultados obtidos permitem sugerir que o efeito gastroprotetor da FM possa estar relacionado à presença dos polifenólicos, bem como aliado ao seu potencial scavenger sobre espécies reativas, ativação da via óxido nítrico/monofosfato de guanosina cíclico e ciclooxigenases e ações anti-H. pylori e anti-urease

Orientador: Taís Maria Bauab / Banca: Rosemeire Cristina Linhari Rodrigues Pietro / Banca: Carlos Henrique Gomes Martins / Banca: Marcia Nitschke / Banca: Suraia Said / Resumo: A resistência aos antibióticos é reconhecida pela Organização Mundial de Saúde (OMS) como a maior ameaça para o tratamento de doenças infecciosas. Uma estratégia importante para ajudar a combater o problema da resistência envolve a descoberta e desenvolvimento de novos agentes capazes de suprimir parcial ou totalmente os mecanismos de resistência microbiana. As plantas de cerrado são conhecidas como uma fonte de compostos de interesse biotecnológico elevado com aplicações na indústria farmacêutica e de alimentos. Dessa maneira, tornou-se relevante avaliar a atividade antimicrobiana dos extratos de Pouteria torta e Pouteria ramiflora (Sapotaceae), da fração enriquecida de Salacia campestris contendo netzaucoieno e maitenina (FrMN) e das substâncias isoladas netzaucoieno de Salacia campestris (Hippocrateaceae) e maitenina de Maytenus ilicifolia (Celastraceae), pela técnica de diluição em microplacas frente aos micro-organismos Staphylococcus aureus ATCC 25923, Salmonela sp. ATCC 19196, Bacillus subtilis ATCC 19659, Escherichia coli ATCC 25922, Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853, Staphylococcus aureus multi-resistente isolado de paciente hospitalizado, Helicobacter pylori ATCC 43504 e Candida albicans ATCC 18804. Além disso, também foi utilizada a técnica de Checkerboard frente ao H. pylori e Time Kill frente aos micro-organismos que apresentaram sensibilidade às substâncias testadas. Os resultados obtidos demostraram que o extrato de P. torta inibiu o crescimento das cepas de S. aureus, B. subtilis e E. coli, enquanto as cepas de S. aureus, B. subtilis, E. coli, P. aeruginosa, S. setubal e C. albicans foram mais sensíveis frente ao extrato de P. ramiflora. Das amostras avaliadas, a maitenina e a FrMN foram as que apresentaram as atividades mais promissoras contra bactérias... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: The antibiotic resistance is known by the World Health Organization (WHO) as the biggest threat to the treatment of infectious diseases. An important strategy to help tackle resistance involves the discovery and development of new agents able to partially or totally suppress the microbial resistance mechanisms. "Cerrado" plants are known as a source of compounds of high biotechnological interest with applications in the pharmaceutical industry and the food industry. In this manner, it has become relevant to evaluate the antimicrobial activity of the extracts of the Pouteria torta and Pouteria ramiflora (Sapotaceae), of the enriched fraction of Salacia campestris containing netzaucoien and maytenin (FrMN) and of the isolated substances netzaucoyen of Salacia campestris (Hippocrateaceae) and maytenin of Maytenus ilicifolia (Celastraceae), through the technique of dilution in microplates against microorganisms Staphylococcus aureus ATCC 25923, Salmonela sp. ATCC 19196, Bacillus subtilis ATCC 19659, Escherichia coli ATCC 25922, Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853, Staphylococcus aureus multi-resistant isolated of a hospitalized patient, Helicobacter pylori ATCC 43504 and Candida albicans ATCC 18804. Other than that, the Checkerboard technique against the H. pylori and Time Kill against the microorganisms that were sensitive to the tested substances. The obtained results demonstrated that the P. torta extract inhibited the S. aureus, B. subtilis and E. coli growth, while the P. ramiflora extract, the strain S. aureus, B. subtilis, E. coli, P. aeruginosa, S. setubal and C. albicans were more sentitive. Of the evaluated compounds, the maytenin and the FrMN were within those who presented the most prominent activities against the bacteria Gram-positive S aureus (ATCC) and S. aureus multi-resistente, and B. subtilis... (Complete abstract click electronic access below) / Doutor

Introdução e objetivos: Eosinofilia duodenal está associada com parasitoses intestinais e com alergias alimentares, e tem sido sugerida como possível fator etiológico da dispepsia funcional, pela capacidade de causar alterações na motilidade e na sensibilidade do aparelho digestivo. Sua relação com o Helicobacter pylori é pouco conhecida, tendo sido avaliada apenas como achado secundário em alguns estudos, com resultados controversos. Esse estudo tem como objetivos avaliar o papel da infecção gástrica pelo H. pylori no número de eosinófilos duodenais e avaliar a relação dos eosinófilos duodenais com os sintomas da dispepsia funcional. Métodos: foram avaliados 100 pacientes dispépticos funcionais, de acordo com os critérios de Roma III, dos quais 50 foram H. pylori positivos e 50 negativos. Os pacientes foram submetidos à endoscopia digestiva alta com biópsias gástricas e duodenais. A positividade do H. pylori foi avaliada pelo teste de urease e pelo exame histológico (Hematoxilina-eosina e Giemsa). As biópsias duodenais foram avaliadas com hematoxilina-eosina e a número de eosinófilos duodenais foi quantificada pela média de eosinófilos por 5 campos de grande aumento (CGA) aleatórios e não sobrepostos. Eosinofilia duodenal foi definida pela presença de >22 eosinófilos/CGA. As medianas das médias aritméticas dos eosinófilos duodenais por cinco CGA foram comparadas entre os pacientes H. pylori positivos e negativos. Também foi avaliada a relação do número de eosinófilos duodenais com a intensidade e tipo de sintomas dispépticos, determinados por questionário validado (PADYQ). Os eosinófilos duodenais foram avaliados para variáveis demográficas e endoscópicas. Resultados: Pacientes do sexo feminino representaram 88% da amostra e a idade média foi de 41,7 anos As características basais dos pacientes H. pylori positivos e H. pylori negativos foram semelhantes. Apenas um paciente, no grupo H. pylori positivo, apresentou eosinofilia duodenal. As medianas dos eosinófilos duodenais/CGA foram 4,6 [P25-75: 2,8-7,2] nos pacientes H. pylori negativos e 4,7 [P25-75: 3,4-8,4] nos H. pylori positivos (p= 0,403). O número de eosinófilos 8 duodenais foi significativamente maior em pacientes com sintomas mais intensos: pacientes com escore do PADYQ >22 (>50% da pontuação máxima) apresentaram mediana de eosinófilos duodenais/CGA de 5,4 [P25-75: 3,4–7,6] e pacientes com escore ≤22 de 3,4 [P25-75: 2,2–6,0] (p= 0,018). Os pacientes foram divididos em tercis, de acordo com a intensidade dos sintomas: grupo 1 com 31 pacientes (sintomas leves); grupo 2 com 30 pacientes (sintomas moderados); e grupo 3 com 31 pacientes (sintomas acentuados). A mediana dos eosinófilos duodenais/CGA no grupo 1 foi de 3,4 [P25-75: 2,2 -6,0]; no grupo 2 de 4,7 [P25-75: 3,2-6,4]; e o grupo 3 de 5,8 [P25-75: 3,6-8,2] (P=0,033). Houve diferença estatisticamente significativa no número de eosinófilos duodenais entre fumantes e não fumantes (p= 0,030) e entre pacientes com índice de massa corporal (IMC) <25 kg/m2 e IMC ≥ 25 kg/m2 (p= 0,035). Na análise multivariada por regressão linear, os fatores que tiveram influência sobre o número de eosinófilos duodenais foram o tabagismo (p= 0,026) e a intensidade dos sintomas dispépticos (p= 0,039). Conclusões: Esse estudo não mostrou associação entre a infecção pelo H. pylori e a contagem de eosinófilos duodenais, nessa população de pacientes dispépticos funcionais. Entretanto, foi demonstrada uma relação diretamente proporcional e estatisticamente significativa entre o número de eosinófilos duodenais e a intensidade dos sintomas dispépticos. / Background and Aims: Duodenal eosinophilia is associated with intestinal parasitosis and food allergies. It has also been implicated as a potential factor on the etiology of functional dyspepsia, probably by causing changes in digestive tract motility and sensitivity. The association with Helicobacter pylori is poorly understood, and has been only evaluated as a secondary finding in 9 previous studies, with conflicting results. This study aims to evaluate the potential role of gastric H. pylori infection in the duodenal eosinophil count, and the influence of duodenal eosinophils on symptoms in functional dyspeptic subjects. Methods: One hundred functional dyspeptic subjects, according to Rome III criteria, were evaluated, and 50 were H. pylori positive and 50 H. pylori negative. Patients were submitted to upper gastrointestinal endoscopy with gastric and duodenal biopsies. H. pylori positivity was evaluated by urease test and gastric histology (Hematoxylin-eosin and Giemsa). Duodenal biopsies were evaluated with Hematoxylin-Eosin staining, and the duodenal eosinophil count was determined by the mean of eosinophil by 5 random nonoverlapping high power fields (HPF). Duodenal eosinophilia was defined as >22 eosinophils/HPF. The median of the arithmetic means of the duodenal eosinophils counts per high power field were compared between H. pylori positive and H. pylori negative subjects. The relationship between the number of duodenal eosinophils and the intensity and type of dyspeptic symptoms was determined by validated questionnaire (PADYQ). Duodenal eosinophils counts were also evaluated by demographic variables and endoscopic findings. Results: 88% of the subjects were female and the mean age was 41.7 years. Baseline characteristics were similar between H. pylori positive and H. pylori negative subjects. Only one patient, in the H. pylori positive group, had duodenal eosinophilia. The median duodenal eosinophils/HPF were 4.6 [Percentiles 25-75(P25-75): 2.8-7.2] in H. pylori negative and 4.7 [P25-75: 3.4-8.4] in H. pylori positive subjects (p= 0.403). The duodenal eosinophil count was greater in subjects with higher symptoms severity: patients with PADYQ score more than 22 (>50% of the maximum score) had median duodenal eosinophil/HPF of 5.4 [P25-75: 3,4–7,6] and subjects with PADYQ score ≤22 of 3.4 [P25-75: 2.2–6.0] (p= 0.018). The patients were divided into terciles, according to symptoms severity: group 1 with 31 subjects (mild symptoms); group 2 with 30 subjects (moderate symptoms); and group 3 with 31 subjects (severe symptoms). 10 The median duodenal eosinophils/HPF was 3.4 [P25-75: 2.2-6.0] in group 1; 4.7 [P25-75: 3.2-6.4] in group 2; and 5.8 [P25-75: 3.6-8.2] in group 3 (p=0.033). There was a higher duodenal eosinophils count in smokers (current or former) (p=0.030), and subjects with BMI ≥ 25 kg/m2 (p=0.035). In the multivariate analysis by linear regression, the duodenal eosinophil count were influenced by smoking (p = 0.026) and dyspeptic symptoms severity (p= 0.039). Conclusion: This study did not show an association between H. pylori infection and the number of duodenal eosinophils, in this population of functional dyspeptic patients. However, a directly proportional and statistically significant relationship between the number of duodenal eosinophils and the intensity of dyspeptic symptoms has been demonstrated.

Helicobacter pylori are unique in their ability to colonise the human gastric mucosa. They persist lifelong in untreated individuals despite the presence of a continuous and specific immune response being mounted against it. H. pylori O-antigen is thought to be involved in immune-evasion and subversion by the bacteria and expression has been shown to facilitate colonisation and exacerbate pathology in murine models. This study investigates immuno-relevant roles of H. pylori O-antigen as a pathogen-associated molecular pattern (PAMP) and its interaction with two pattern recognition receptors (PRRs); galectin-3 and DC-SIGN. These PRRs possess distinct carbohydrate recognition domain (CRD) structures and binding affinities. Despite this, we have demonstrated that they compete for adhesion to both Lewis antigen glycoconjugates and whole cell H. pylori 26695 in solid phase binding assays. Galectin-3 significantly reduces DC-SIGN adhesion at a 2:1 stoichiometric ratio in both Lex glycoconjugate and whole cell H. pylori 26695 assays, and abrogates carbohydrate-specific binding in Lex glycoconjugate assays at a 22:1 ratio. These results suggest that galectin-3 may play a role in inhibiting or modulating the interaction between H. pylori O-antigen and DC-SIGN in vivo. Supporting this, we have shown that galectin-3 secreted by AGS cells during competitive infection with H. pylori 26695 is sequestered by H. pylori O-antigen. We have demonstrated that competitive infection of the O-antigen deficient mutant H. pylori 26695 galE in DC-SIGN expressing THP-1 cells reveals a significant reduction in intracellular survival at 8 hours compared to H. pylori 26695 Wt. Co-incubation of H. pylori 26695 Wt with 10 µg ml-1 galectin-3 reduced intracellular survival to the levels of H. pylori 26695 galE at 8 hours. Furthermore, H. pylori 26695 galE displayed rapid association of the endocytic markers Rab5 and Rab7 at 15 minutes compared to H. pylori 26695 Wt. Monoclonal antibody-mediated blocking of DC-SIGN in H. pylori 26695 Wt-THP-1 infections resulted in rapid association of the endocytic markers Rab5 and Rab7, corresponding to that of H. pylori 26695 galE, indicating that DC-SIGN-O-antigen interactions alters intracellular processing of the bacteria and reduces the rate at which these markers are recruited. Together these results elucidate novel mechanisms of H. pylori O-antigen and its interaction with galectin-3 and DC-SIGN that warrant further investigation in vivo. The identification of two PRRs competing for the same PAMP is unconventional and inspires a re-evaluation of PRRs in innate immune recognition.

Orientadora: Márcia Aparecida Sperança / Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do ABC, Programa de Pós-Graduação em Biossistemas, 2013

Helicobacter pylori (hereinafter referred to as H. pylori) is a gram-negative bacteria which colonises the human stomach mucosa. Its role in the aethiopathogenesis of chronic gastritis, ulcer disorders of the gastroduodenum and MALT-lymphoma has been clearly demonstrated, and in connection with the occurrence of stomach cancer it has been indicated by the World Health Organisation (WHO) as a class I carcinogen. H. pylori infection can be detected from samples of stomach mucosa taken in an endoscopic examination (rapid urease test, microscopic examination, culture), or the non-invasive method can be used (13 C-Urea Breath Test or H. Pylori stool antigen test - HpSA). Effective therapy of H. pylori infection resides in the administration of a combination of antibiotics and a proton pump inhibitor. In recent years the resistance of bacterial strains to used antibiotics has been increasing on a worldwide scale, and we can also observe this trend in the case of H. pylori. If the level of resistance exceeds 20 % for clarithromycin and 40 % for metronidazole, these antibiotics are not recommended for the treatment of an infection caused by this bacteria. In a group of 61 patients at the Department of Internal Medicine at the University Hospital Motol who had undergone an endoscopic examination of the...