LANDIM, Patrícia Gadelha de Castro. Produção em Pichia pastoris de uma quitinase de feijão-de-corda com atividade antifúngica. 2011. 155 f. Tese (Doutorado em bioquímica)- Universidade Federal do Ceará, Fortaleza-CE, 2011. / Submitted by Elineudson Ribeiro (elineudsonr@gmail.com) on 2016-07-20T19:42:36Z No. of bitstreams: 1 2011_tese_pgclandim.pdf: 3599090 bytes, checksum: 2cf77e164a49e44c17edc739f713b302 (MD5) / Approved for entry into archive by José Jairo Viana de Sousa (jairo@ufc.br) on 2016-07-26T18:17:14Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2011_tese_pgclandim.pdf: 3599090 bytes, checksum: 2cf77e164a49e44c17edc739f713b302 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-07-26T18:17:14Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2011_tese_pgclandim.pdf: 3599090 bytes, checksum: 2cf77e164a49e44c17edc739f713b302 (MD5) Previous issue date: 2011 / Chitinases are enzymes that hydrolyze the β-(1,4) glycosidic bonds present in biopolymers of N-acety-β-D-glucosamine, mainly chitin, a structural polysaccharide which is found in cell walls of several fungi. In plants, chitinases play a role as defense proteins against the attack of pests and pathogens. In this work, a class I chitinase from cowpea (Vigna unguiculata) was expressed in heterologous systems. The recombinant protein (rVuChi) was purified, and characterized biochemically and in relation to its effects on mycelial growth and germination of spores/conidia of filamentous fungi. The DNA coding sequence of the cowpea chitinase was amplified by PCR and the products cloned in the expression vectors pET32a(+) and pPICZαA, for heterologous expression in Escherichia coli and Pichia pastoris, respectively. In E. coli cells, the recombinant fusion protein occurred mainly as inclusion bodies. On the other hand, in six strains of P. pastoris, the recombinant cowpea chitinase was secreted in a soluble form into the culture medium. The highest chitinase activity was detected in the extracellular fraction of KM71H strain, 72 hours after induction. The recombinant VuChi was detected by SDS-PAGE and Invision His-Tag stain kit, which identified two protein bands with apparent molecular masses of 30 and 33 kDa. These two protein bands showed the same N-terminal sequence, and an absence of N-glycosylation. Most recombinant chitinase secreted into the culture medium was recovered in the fraction F0/40, precipitated with ammonium sulfate. The expressed protein was purified to homogeneity by affinity chromatography on chitin matrix (yield of 18.31 mg per liter of culture medium), or by hydrophobic interactions chromatography on a column of Phenyl Sepharose CL-4B (yield = 13.2 mg/L), followed by ultrafiltration in a membrane with exclusion limit of 50 kDa. The purified rVuChi was able to hydrolyze colloidal chitin (in solution) as well as glycol chitin (in SDS-PAGE), although it did not show enzymatic activity against synthetic substrates containing p-nitrophenol. The purified chitinase showed molecular masses of 32 and 33.1 kDa by size exclusion chromatography on columns of Superose 12 HR and Superdex 200, respectively. When submitted to 2D electrophoresis, rVuChi presented a set of six spots with pI values between 4.44 and 5.15. The chitinase was thermostable at temperatures up to 50 ° C and the enzyme activity was highest at pH 5. In general, the presence of metal ions caused a reduction of its enzymatic activity. The chelating agent EDTA (0.5%) stimulated the enzyme activity, whereas in the presence of the detergent SDS (0.5%) the rVuChi activity was completely inhibited. The recombinant chitinase showed 37% of alpha helix and 26% of beta sheet, as determined by circular dichroism spectroscopy. Denaturing of 50% of the rVuChi molecules occurs at 54.41 ° C. The fluorescence spectra showed that the protein produced in P. pastoris was in its fully folded conformation. The recombinant cowpea chitinase was able to completely inhibit the germination of spores of Penicillium herquei, after 48 hours, at a dose of 100 mg, and caused 68% inhibition at doses of 50, 25 and 12.5 mg. At a dose of 150 mg, there was 55% inhibition on conidial germination of Rhizoctonia solani and a slight effect on spore germination of Colletotrichum lindemuthianum and C. musae. There was no effect of rVuChi on spore germination of C. gloeosporioides, Fusarium solani and F. oxysporum. In addition, the recombinant protein delayed the mycelial growth of P. herquei in approximately 50% (at the dose of 100 mg) but had no effect on mycelial growth of the other fungi. Therefore, the cowpea class I chitinase is a protein with anti-fungal activity. / As quitinases são enzimas capazes de hidrolisar as ligações β-(1,4)-glicosídicas presentes em biopolímeros de N-acetil-β-D-glucosamina, principalmente quitina, um polissacarídeo estrutural presente na parede celular de diversos fungos. No presente trabalho, uma quitinase de classe I de feijão-de-corda (Vigna unguiculata) foi expressa em sistemas heterólogos e a proteína recombinante (rVuChi) foi caracterizada bioquimicamente bem como em relação ao seu efeito sobre o crescimento micelial e germinação de esporos/conídios de fungos filamentosos. A seqüência de DNA codificando a proteína foi amplificada por PCR e clonada nos vetores de expressão pET32a(+) e pPICZαA, para expressão heteróloga em Escherichia coli e Pichia pastoris, respectivamente. A expressão de rVuChi em células de E. coli ArticExpress DE3 se deu em corpos de inclusão. Em seis estirpes de P. pastoris a proteína recombinante foi secretada, de forma solúvel, para o meio de cultura. Na fração extracelular da estirpe KM71H foi observada a maior atividade quitinolítica, após 72 horas de indução. A detecção de rVuChi foi feita por SDS-PAGE e com o kit Invision His-Tag stain, onde foram identificadas duas bandas protéicas de massas moleculares aparentes de 30 e 33 kDa. Ambas as bandas apresentaram a mesma sequência N-terminal e a ausência de N-glicosilação foi verificada. A quitinase recombinante estava presente principalmente na fração F0/40 precipitada com sulfato de amônio e foi purificada a homogeneidade tanto por cromatografia de afinidade em matriz de quitina (com rendimento de 18,31 mg por litro de meio de cultura), quanto por cromatografia de interações hidrofóbicas em coluna de Phenyl Sepharose CL-4B (rendimento de 13,2 mg/L), seguidas de ultrafiltração em membrana com limite de exclusão de 50 kDa. A rVuChi apresentou atividades endo e exo-quitinolítica frente a quitina coloidal e hidrolisou glicol-quitina em gel de SDS-PAGE, embora não tenha apresentado atividade contra substratos sintéticos contendo p-nitrofenol. A quitinase purificada apresentou massa molecular de 32 e 33,1 kDa por cromatografia de exclusão molecular em colunas de Superose 12 HR e Superdex 200, respectivamente. Em gel bidimensional, rVuChi apresentou um conjunto de seis ‘spots’ com pI entre 4,44 e 5,15. A quitinase mostrou-se ainda termoestável em temperaturas até 50 °C e sua atividade enzimática máxima ocorreu em pH 5. Em geral, a presença de íons metálicos causou uma redução de sua atividade enzimática. O agente quelante EDTA (0,5%) estimulou a atividade enzimática enquanto que o detergente SDS (0,5%) a inibiu totalmente. A quitinase recombinante apresentou 37% de hélice alfa e 26% de folha beta, como determinado por espectroscopia de dicroísmo circular. A desnaturação de 50% das moléculas de rVuChi ocorreu a 54,41 °C. Os espectros de fluorescência revelaram que a proteína produzida em P. pastoris estava em sua conformação totalmente enovelada. A quitinase recombinante de feijão-de-corda foi capaz de inibir totalmente a germinação de esporos de Penicillium herquei até 48 horas, na dose de 100 μg e causou inibição de 68%, nas doses de 50, 25 e 12,5 μg. Na dose de 150 μg, houve uma inibição de 55% na germinação dos conídios de Rhizoctonia solani e um leve efeito sobre a germinação dos esporos de Colletotrichum lindemuthianum e C. musae. Nenhum efeito da rVuChi foi observado sobre a germinação de esporos dos fungos C. gloeosporioides, Fusarium solani e F. oxysporum. Além disso, a proteína recombinante retardou o crescimento micelial de P. herquei em aproximadamente 50% (100 μg), porém não apresentou efeito sobre o crescimento micelial dos demais fungos. Desta forma, a quitinase classe I de V. unguiculata é uma proteína com atividade antifúngica.

JEREISSATI, E. S. Transformação genética de feijão-caupi [Vigna unguiculata (L.) Walp] e tabaco (Nicotiana tabacum) com uma quitinase de classe I. 2012, Transformação genética de feijão-caupi [Vigna unguiculata (L.) Walp] e tabaco (Nicotiana tabacum) com uma quitinase de classe I. 120 f. Tese (Doutorado em Bioquímica) - Centro de Ciências, Universidade Federal do Ceará, Fortaleza, 2012. / Submitted by Francisco Lacerda (lacerda@ufc.br) on 2015-01-15T18:58:02Z No. of bitstreams: 1 2012_tese_esjereissati.pdf: 8084916 bytes, checksum: 05dd57f88cba77dba6c72ab53b984f08 (MD5) / Approved for entry into archive by José Jairo Viana de Sousa(jairo@ufc.br) on 2015-01-19T17:21:31Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2012_tese_esjereissati.pdf: 8084916 bytes, checksum: 05dd57f88cba77dba6c72ab53b984f08 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-01-19T17:21:31Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2012_tese_esjereissati.pdf: 8084916 bytes, checksum: 05dd57f88cba77dba6c72ab53b984f08 (MD5) Previous issue date: 2012 / Heterologous expression of genes encoding pathogenesis related proteins (PR-proteins) represents a promising alternative for the development of plants resistant to fungi. Among the PR-proteins with great biotechnological potentials are the chitinases, a class of hydrolases which catalyze the degradation of chitin, a polymer constituent of cell wall of several species of pathogenic fungi. Besides their function related to defense mechanisms, it is believed that these enzymes may play other roles, such as regulation of growth and development processes in plants. Using two approaches, this study sought to investigate the role of a class I chitinase of cowpea (VuChiI) in defense and plant development. The first approach consisted of silencing of the gene encoding for VuChiI in cowpea. Apical meristems excised from cowpea seeds were bombarded with microparticles containing a silencing vector (pKANNIBAL), which was cloned with a construct harboring an intron harpin of the gene VuChiI. Plants regenerated in a Murashige and Skoog (MS) media containing imazapyr as a selection agent, were analyzed by PCR, resulting in confirmation of genetic transformation of five plants from the 1092 apical meristems bombarded. Northern blot analysis of total RNA extracted from the putative transgenic plants allowed for the detection of siRNAs. Upon regeneration and germination, only one of the five transformed plants produced a pod containing six seeds. Of these, only one germinated when further planted. The transformed plants exhibited a life cycle of over 365 days, as against the normal cycle of 65-70 days. Based on these results we posit that silencing of class I cowpea chitinase may have led to changes in plant development. The second strategy consisted of co-cultivation of tobacco leaf discs with Agrobacterium tumefaciens strain LB4404 suspension to express recombinant protein in the extracellular space of the regenerated plants in order to expose the protein fungus even before its penetration into the plant cell. To achieve this, a sequence of cowpea chitinase insert was cloned into the binary vector pCAMBIA1305.2 under the control of CaMV35S promoter and signal peptide fused to glycine-rich protein of Oryza sativa (GRP), which allowed the secretion of recombinant protein via apoplast. This led to the generation of three strains as confirmed by PCR. Seeds obtained from transformed R1 generation of the plants were germinated and analyzed for transmission of the transgene using X2 test, which confirmed its transmission to the progeny in a Mendelian fashion. The experimental models developed in this work may serve to further assess the biological roles of class I chitinase from cowpea. / A expressão heteróloga de genes que codificam proteínas relacionadas à patogênse (PR-proteínas) representa uma alternativa promissora para o desenvolvimento de plantas resistentes ao ataque de fungos. Dentre as PR-proteínas com grande potencial biotecnológico, estão as quitinases, hidrolases que catalisam a degradação da quitina, que é um polímero constituinte da parede celular de muitas espécies de fungos fitopatogênicos. Além da função relacionada aos mecanismos de defesa, acredita-se que essas enzimas podem desempenhar outros papéis, como a regulação de processos de crescimento e desenvolvimento em plantas. O objetivo deste trabalho foi estudar o papel de uma quitinase de classe I de feijão-caupi (VuChiI) na defesa e no desenvolvimento vegetal e para isso duas abordagens foram conduzidas. A primeira consistiu no silenciamento do gene que codifica esta proteína em plantas de feijão-caupi. Nos experimentos de silenciamento gênico foram utilizados meristemas apicais de plântulas de feijão-caupi, que foram então bombardeados com micropartículas portando um vetor de silenciamento (pKANNIBAL), onde foi clonada uma construção em grampo (intron harpin) do gene de VuChiI. As plantas regeneradas em meio de cultura de Murashige e Skoog (MS) contendo o herbicida imazapyr, como agente de seleção, foram analisadas por PCR, o que resultou na confirmação da transformação genética de cinco plantas, a partir de 1.092 meristemas apicais bombardeados. O RNA foi extraído das plantas transformadas e utilizado em análises de Northern blot que possibilitou a detecção de siRNAs no RNA total extraído das plantas putativamente transgênicas. Apenas uma das plantas transformadas produziu uma vagem contendo seis sementes, das quais apenas uma germinou. As plantas transformadas apresentaram ciclo de vida de mais de 365 dias enquanto que o esperado é de 65-70 dias. Com base nos resultados sugere-se que o silenciamento da quitinase de classe I de feijão-caupi pode ter promovido alteração no desenvolvimento da planta. A segunda estratégia de transformação genética consistiu no co-cultivo de discos foliares de tabaco com suspensão de Agrobacterium tumefaciens LB4404, com o intuito de expressar a proteína recombinante no espaço extracelular das plantas regeneradas. Essa estratégia tem como objetivo fazer com que a proteína entre em contato com o fungo antes mesmo que este agente patogênico penetre na célula vegetal. Para tanto, o inserto referente à quitinase de feijão-caupi foi clonado no vetor binário pCAMBIA1305.2 sob controle do promotor CaMV35S e fundido ao peptídeo sinal GRP (glycine-rich protein de Oryza sativa), que permite a secreção da proteína recombinante via apoplasto. Foram produzidas três linhagens de plantas que tiveram a transformação genética confirmada por PCR. As sementes obtidas das plantas transformadas, geração R1, foram semeadas em meio seletivo para a análise da transmissão do transgene. O teste de X2 indicou que o transgene foi transmitido para a progênie em proporções Mendelianas. Os modelos experimentais desenvolvidos neste trabalho poderão contribuir para a elucidação dos papéis biológicos da quitinase de classe I de feijão-caupi.

Submitted by Marco Antônio de Ramos Chagas (mchagas@ufv.br) on 2018-04-19T12:33:37Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 2096061 bytes, checksum: bc307da4c22fbfa9e0230bdede6f8c29 (MD5) / Made available in DSpace on 2018-04-19T12:33:37Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 2096061 bytes, checksum: bc307da4c22fbfa9e0230bdede6f8c29 (MD5) Previous issue date: 2018-03-02 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Fungos e plantas produzem enzimas que possuem as mais diversas aplicações biotecnológicas. Uma possível e promissora aplicação dessas enzimas é o controle de nematoides, em substituição aos nematicidas químicos prejudiciais à saúde humana e animal, ao meio ambiente e à microbiota do solo. Outra possível aplicação das enzimas de fungos é o uso da dextranase na redução de dextrana na indústria sucroalcooleira. Dessa forma, o presente trabalho teve como objetivo investigar a produção de enzimas pelo fungo Pleurotus eryngii e pelas plantas Euphorbia milii e E. trigona, purificar e caracterizar as enzimas de E. milii, E. trigona e Pochonia chlamydosporia, e testar a atividade nematicida das enzimas das plantas E. milii, E. trigona e do fungo P. eryngii. O fungo P. eryngii e seu extrato reduziram significativamente (p<0,01) o número de larvas intactas de Panagrellus sp. após 24 horas de tratamento em 60 e 90%, respectivamente. Este efeito não está relacionado à atividade enzimática, mas sim à presença de outros metabólitos. Os ovos de Meloidogyne javanica, quando tratados com o extrato de P. eryngii, mostraram redução de 53% (p<0,01) no número de ovos intactos. A redução de ovos intactos de M. javanica é atribuída à atividade enzimática, uma vez que o extrato apresentou atividade quitinolítica e proteolítica de, respectivamente, 32,74 e 3,57 U/mL. A purificação do látex de E. trigona por cromatografia de exclusão molecular permitiu a purificação de três proteases distintas. O peso molecular das proteases foi estimado em aproximadamente: 36, 31 e 29 kDa, para a trigonina 1, 2 e 3, respectivamente. O pH e a temperatura que proporcionaram maior atividade de protease foram 4,0, 6,0 e 9,0, e temperatura de 70 °C. As proteases foram inibidas por fluoreto de fenilmetilsulfonila e iodoacetamida. O pool das três proteases presentes no látex de E. trigona reduziram significativamente (p<0,01) o número de J 2 vivas de M. incognita em 96% após 24 horas de tratamento. A purificação parcial das proteases presentes no látex de E. milii indicou que estas proteases correspondem à milina e miliina. Estas enzimas reduziram em 65,59% e 96,46% o número de larvas de Panagrellus redivivus após 24 e 48 h, respectivamente (p<0,01). A dextranase produzida pelo fungo P. chlamydosporia foi purificada à homogeneidade em duas etapas, com rendimento de 152%, fator de purificação de 6,84 e atividade específica de 358,63 U/mg. Seu peso molecular foi estimado por SDS-PAGE em 64 kDa. A enzima apresentou maior atividade a 50 °C e pH 5,0, usando tampão citrato-fosfato 100 mM, foi inibida por Ag 1+ , Hg 2+ , Cu 2+ , Mg 2+ , e apresentou K M de 1,77 g/L. A dextranase madura é composta por 585 resíduos de aminoácidos, com peso molecular predito de 64,38 kDa e pI 5,96. Esta dextranase demonstrou forte semelhança filogenética em comparação à dextranase de Trichoderma harzianum. Sua estrutura consiste de dois domínios: o primeiro composto por 15 cadeias beta, e o segundo composto por uma β-hélice paralela. Esses resultados evidenciam o potencial biotecnológico desses fungos, plantas e suas enzimas extracelulares informações acerca no da controle dextranase de nematoides, produzida pelo e fornecem fungo P. chlamydosporia, que podem ser utilizadas para futuras aplicações industriais desta enzima. / Fungi and plants produce enzymes that have several biotechnological applications. A possible and promising application of these enzymes is the control of nematodes, replacing chemical nematicides harmful to human and animal health, to the environment and to the soil microbiota. Another possible application of fungi enzymes is the use of dextranase to reduce dextran content in sugar industry. The objective of this work was to investigate the production of enzymes by Pleurotus eryngii, Euphorbia milii and E. trigona, to purify and characterize the enzymes from E. milii, E. trigona and Pochonia chlamydosporia, and to test the nematicidal activity of E. milii, E. trigona and P. eryngii. P. eryngii fungus and its extract significantly reduced (p<0.01) the number of intact Panagrellus sp. larvae after 24 hours treatment in 60 and 90%, respectively. This effect is not related to enzymatic activity, but to the presence of other metabolites. M. javanica eggs, when treated with P. eryngii extract, showed a 53% reduction (p<0.01) in the number of intact eggs. The M. javanica intact eggs reduction is attributed to enzymatic activity, once the extract showed proteolytic and chitinolytic activities of, respectively, 32.74 and 3.57 U/mL. The purification of E. trigona latex with size-exclusion chromatography allowed partially purification of three distinct proteases. The molecular weight of proteases was estimated at approximately: 36, 31 and 29 kDa, for trigonin 1, 2 and 3, respectively. The pH and temperature that provided highest protease activity were 4.0, 6.0 and 9.0, and temperature of 70 °C. The proteases were inhibited by phenylmethylsulfonyl fluoride and iodoacetamide. The pool of three proteases present in E. trigona latex reduced significantly (p<0.01) the number of live M. incognita J 2 in 96% after 24 hours treatment. The partial purification of the proteases present in E. milii latex indicated that these proteases are milin and miliin. These enzymes reduced the Panagrallus redivivus larvae number by 65.59 % and 96.46 % after 24 and 48 hours, respectively (p<0.01). Dextranase produced by the fungus P. chlamydosporia was purified to homogeneity in two steps, with a yield of 152 %, purification factor of 6.84 and specific activity of 358.63 U/mg. Its molecular weight was estimated by SDS-PAGE at 64 kDa. The enzyme presented higher activity at 50 °C and pH 5.0, using 100 mM citrate-phosphate buffer, was inhibited by Ag 1+ , Hg 2+ , Cu 2+ , Mg 2+ , and presented K M of 1.77 g/L. Mature dextranase is composed of 585 amino acids residues, with a predicted molecular weight of 64.38 kDa and pI 5.96. This dextranase showed a strong phylogenetic similarity when compared to Trichoderma harzianum dextranase. Its structure consists of two domains: the first composed by 15 β strands, and the second composed by a right-handed parallel β-helix. These results evidence the biotechnological potential of these fungi, plants and their extracellular enzymes to nematodes control, and provide information about the dextranase produced by P. chlamydosporia fungus, which can be used for future industrial applications of this enzyme.

Submitted by THIAGO TREVISOLI AGOSTINI null (ttrevisoli@gmail.com) on 2017-08-03T21:35:36Z No. of bitstreams: 1 Dissertação Thiago Trevisoli Agostini.doc: 4358656 bytes, checksum: e54359117ba09655fd5253a011dacfcb (MD5) / Rejected by LUIZA DE MENEZES ROMANETTO (luizamenezes@reitoria.unesp.br), reason: Solicitamos que realize uma nova submissão seguindo as orientações abaixo: O arquivo submetido não contém o certificado de aprovação. A versão submetida por você é considerada a versão final da dissertação/tese, portanto não poderá ocorrer qualquer alteração em seu conteúdo após a aprovação. A versão final da dissertação/tese deve ser submetida no formato PDF (Portable Document Format). O arquivo PDF não deve estar protegido e a dissertação/tese deve estar em um único arquivo, inclusive os apêndices e anexos, se houver. Por favor, corrija estas informações e realize uma nova submissão. Agradecemos a compreensão. on 2017-08-04T17:14:48Z (GMT) / Submitted by THIAGO TREVISOLI AGOSTINI null (ttrevisoli@gmail.com) on 2017-08-04T17:30:14Z No. of bitstreams: 1 Versão Definitiva.pdf: 738534 bytes, checksum: 55f3aca1bc91c3ffe18c2eb2056d21ea (MD5) / Approved for entry into archive by LUIZA DE MENEZES ROMANETTO (luizamenezes@reitoria.unesp.br) on 2017-08-07T19:30:43Z (GMT) No. of bitstreams: 1 agostini_tt_me_jabo.pdf: 738534 bytes, checksum: 55f3aca1bc91c3ffe18c2eb2056d21ea (MD5) / Made available in DSpace on 2017-08-07T19:30:43Z (GMT). No. of bitstreams: 1 agostini_tt_me_jabo.pdf: 738534 bytes, checksum: 55f3aca1bc91c3ffe18c2eb2056d21ea (MD5) Previous issue date: 2017-07-04 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / A exigência da sociedade por alimentos produzidos com baixos riscos de contaminação aos consumidores e ao meio ambiente tem aumentado constantemente. Nesse cenário, a identificação de novas formas eficazes e seguras para o controle de insetos-praga se mostra como uma tarefa contínua e as quitinases aparecem como uma interessante ferramenta. As quitinases são enzimas com ação de hidrólise sobre quitina e podem interferir no desenvolvimento de pragas visto que esse polímero constitui estruturas como a cutícula e a membrana peritrófica dos insetos. No presente trabalho, foi realizada a produção de um extrato quitinolítico a partir do cultivo da actinobactéria Streptomyces sp. ENT-21 em meio contendo quitina e avaliaram-se os efeitos desse extrato sobre o desenvolvimento de lagartas de Spodoptera frugiperda (J.E. Smith, 1797) (Lepidoptera: Noctuidae), importante praga da cultura do milho. O extrato quitinolítico produzido resultou na interferência do desenvolvimento larval de S. frugiperda, no aumento da mortalidade e na redução do ganho de peso das lagartas em relação a lagartas mantidas como controle. Após fervura, o extrato produzido teve sua atividade quitinolítica inativada e não exerceu influência sobre a mortalidade larval de S. frugiperda em relação ao controle na concentração avaliada. Os resultados indicam que o extrato quitinolítico produzido pelo cultivo de Streptomyces sp. ENT-21 possui atividade inseticida sobre lagartas de S. frugiperda e que a atividade quitinolítica é um fator importante para a atividade inseticida do extrato. / Society's demand for food production at low contamination risks to consumers and to the environment is in constant increase. In this scenario, the identification of new effective and safe forms for the control of insect pests come into sight as a continuous task and chitinases are considered an interesting promisse. Chitinases are enzymes that hydrolyze chitin and can disrupt the development of insect pests since this polymer constitutes vital structures such as the cuticle and peritrophic membrane of insects. In the present work, we produced a chitinolytic extract using the actinobacterium Streptomyces sp. ENT-21 and evaluated the effects of this extract on larval development of an important pest of maize, Spodoptera frugiperda (J.E. Smith, 1797) (Lepidoptera: Noctuidae) larvae. The chitinolytic extract interfered in the larval development of S. frugiperda affecting parameters such as larval mortality and larval weight gain. After boiling, no chitinolytic activity was detected in the extract and no influence of boiled extract was observed over S. frugiperda larval development at the evaluated concentration. The results suggest that the evaluated chitinolitic extract has insecticidal activity against S. frugiperda larvae and indicate the chitinolytic activity as an important component of the insecticidal activity of the extract. / CNPq: 132363/2015-1

CoordenaÃÃo de AperfeÃoamento de Pessoal de NÃvel Superior / O cajueiro (Anacardium occidentale L.) à uma planta nativa do Brasil com grande valor comercial. Isso contribui com a geraÃÃo de milhares de empregos diretos e indiretos, especialmente na RegiÃo Nordeste, em Ãpoca de estiagem. Programas de melhoramento genÃtico vem selecionando cultivares de cajueiro melhores adaptados ao ambiente semiÃrido a fim de colocÃ-lo em um mercado cada vez mais competitivo. Entre os tipos de proteÃnas de sementes vÃrias tÃm funÃÃo de reserva, estrutural ou metabÃlica. AlÃm disso, as plantas sÃo dispostas de uma variedade de mecanismos de defesa contra o ataque de patÃgenos. Uma das respostas de defesa mais estudada diz respeito à expressÃo de proteÃnas relacionadas com a patogÃnese nas quais se inclui o grupo das quitinases. A enzima quitinase (EC 3.2.1.14) hidrolisa o polÃmero de quitina para a N-acetil glucosamina por qualquer uma das endo ou exo clivagens da ligaÃÃo &#946; (1-4). As respostas moleculares nos perfis das plantas a nÃvel transcricional tÃm demonstrado serem cruciais para o estabelecimento de um conjunto de mecanismos de defesa contra patÃgenos invasores. Usando ferramentas de bioinformÃtica foram identificados, no transcriptoma de cajueiro CCP076, dez contigs apresentando alto grau de semelhanÃa com quitinases, endoquitinases, e quitinases-like das famÃlias GH18 e GH 19 de Ricinus communis, Cicer arietinum, Mangifera indica, Citrus sinensis, Euonymus europaeus, Vitis vinifera, Aegilops tauschii e Hevea brasiliensis. Os ensaios enzimÃticos das proteÃnas da castanha confirmaram a presenÃa quitinases em seu proteoma. Ainda revelaram uma atividade catalÃtica Ãtima em pH 5. Um perfil de proteÃnas com sitio de ligaÃÃo à quitina tambÃm foi encontrado. Dessa forma, à demonstrado um grande potencial biotecnolÃgico nas quitinases provenientes da castanha de cajueiro CCP76. / The cashew (Anacardium occidentale L.) is a plant native to Brazil with high market value. This contributes to the generation of thousands of direct and indirect jobs, especially in the Northeast, in the dry season. Breeding program has been selecting the best cashew cultivars adapted to semi-arid environment in order to put it in an increasingly competitive market. Among the types of seed proteins have several reservation function, structural or metabolic. Furthermore, plants are arranged in an array of defense mechanisms against pathogen attack. One of the most studied defense response with respect to the expression of pathogenesis related proteins which are included in the group of chitinases. The enzyme chitinase (EC 3.2.1.14) hydrolyse the polymer chitin to N-acetyl glucosamine by either endo or exo cleavage of &#946; connection (1-4). The molecular profiles of responses in plants transcriptional level have been shown to be crucial for the establishment of a set of defense mechanisms against invading pathogens. Using bioinformatics tools were identified in the transcriptome cashew CCP076 ten contigs having high degree of similarity with chitinases, endoquitinases and chitinase-like the GH18 family and GH 19 of Ricinus communis, Cicer arietinum, Mangifera indica, Citrus sinensis, Euonymus europaeus , Vitis vinifera, Aegilops tauschii and Hevea brasiliensis. The enzyme assays of chestnut chitinase protein confirmed the presence in their proteome. Also revealed a great catalytic activity at pH 5. A protein profile with chitin-binding site was also found. Of these, it is demonstrated great potential in biotechnological chitinase from CCP76 cashew nuts.

Submitted by (lucia.rodrigues@ufrpe.br) on 2016-06-10T12:50:24Z No. of bitstreams: 1 Talita Camila Evaristo da Silva Nascimento.pdf: 924627 bytes, checksum: e31eef0acccfe262c282d8536f058023 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-06-10T12:50:24Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Talita Camila Evaristo da Silva Nascimento.pdf: 924627 bytes, checksum: e31eef0acccfe262c282d8536f058023 (MD5) Previous issue date: 2012-07-27 / Sustainability is a theme that has been raised steadily in recent years, the production and use of enzymes in an efficient alternative recycling of industrial and agricultural waste. The chitinase acts in the hydrolysis of chitin, the substance can be found in large quantities in the shells of crustaceans. The objective of this research was to select Streptomyces spp. with the greatest potential in the production of chitinase, to characterize the crude and partially purified. For selection we used 30 strains of Streptomyces spp. isolated from lichen in the Amazon region. Parameters such as pH and temperature optima, stability to pH and temperature from the crude enzymatic extract. Partial purification of the enzyme was performed by precipitation in ammonium sulfate in the range of 0-80% and the electrophoresis profile by SDS-PAGE. Streptomyces sp. DPUA1581 chitinase produced by submerged fermentation with 1% of chitin, agitation 150 rpm, at 28 °C for 96 hours. The enzyme characterization showed the best activity in sodium phosphate buffer 100 mM, pH 7.0 and was stable after 180 minutes in all pHs tested. The optimum temperature was 80 °C chitinase, remained stable between 30 and 100 °C for 180 minutes. The activity was enhanced in the presence of Fe2+ (134%), Mn2+ (71%) and the anionic surfactant SDS (59%), however, Pb2+ (99%) and EDTA (62%) inhibited the enzyme function. After fractionation with ammonium sulfate showed the enzymatic extract purification factor equal to 7 and 108% yield. The chitinase produced by Streptomyces sp. DPUA1581 under the conditions described in this work, has a great industrial viability, demonstrating catalytic activity even when subjected to high temperatures for prolonged periods. / Sustentabilidade é um tema abordado constantemente nos últimos anos, sendo a produção e utilização de enzimas uma eficiente alternativa na reciclagem de resíduos industriais e agrícolas. A quitinase atua na hidrólise da quitina, esta substância pode ser encontrada em grande quantidade na carapaça de crustáceos. O objetivo desta pesquisa foi selecionar Streptomyces spp. com maior potencial na produção da quitinase, caracterizar o extrato bruto e purificar parcialmente. Para seleção foram utilizadas 30 linhagens de Streptomyces spp. isoladas de líquens da região Amazônica. Foram avaliados parâmetros como pH e temperatura ótimos, estabilidade ao pH e a temperatura a partir do extrato bruto enzimático. A purificação parcial da enzima foi realizada por precipitação em sulfato de amônio na faixa de 0-80% e o perfil eletroforético em SDS-PAGE. Streptomyces sp. DPUA1581 produziu quitinase por fermentação submersa com 1% de quitina, agitação de 150 rpm, a 28 °C por 96h. A caracterização enzimática demonstrou melhor atividade no tampão fosfato de sódio 100 mM, no pH 7,0 e manteve-se estável após 180 minutos em todas as variações de pH testadas. A temperatura ótima da quitinase foi 80 °C, mantendo-se estável entre 30 e 100 °C durante 180 minutos. A atividade foi potencializada na presença de Fe2+ (134%), Mn2+ (71%) e do surfactante aniônico SDS (59%), entretanto, Pb2+ (99%), e EDTA (62%) inibiram a função da enzima. Após o fracionamento com sulfato de amônio o extrato enzimático apresentou fator de purificação igual a 7 e rendimento de 108%. A quitinase produzida por Streptomyces sp. DPUA1581 nas condições descritas neste trabalho, apresenta grande viabilidade industrial, demonstrando atividade catalítica mesmo quando submetida a altas temperaturas por período prolongado.

N-acetil-glucosamina é um composto de importância biotecnológica com grande potencial de aplicação nas áreas de farmácia, medicina e dermatologia. É atualmente produzido pela hidrólise química da quitina, o polissacarideo mais abundante no ambiente marinho e o principal constituinte do exoesqueleto dos artrópodes. No entanto, os processos geralmente utilizados são prejudiciais ao meio ambiente, têm baixo rendimento e alto custo. Este estudo demonstra um dos mais eficientes processos de produção enzimática de N-acetil-glucosamina a partir de -quitina utilizando quitinases bacterianas como uma alternativa sustentável aos processos atuais e isolados de A. caviae com grande potencial para produção de quitinases e derivados de quitina. / N-acetyl-glucosamine (GlcNAc) is a compound of biotechnological importance with great application potential in the areas of pharmacy, medicine and dermatology. GlcNAc is currently produced by the chemical hydrolysis of chitin, the polysaccharide most abundant in the marine environment and the principal constituent of the exoskeleton of arthropods. However, the processes generally used are environmentally unfriendly, have low yield and high cost. This study demonstrates the most efficient processes for enzymatic production of N-acetyl-glucosamine from -chitin using bacterial chitinases as a sustainable alternative to the current processes and A. caviae isolates with great potential for chitinases and chitin derivatives production.

Os fungos entomopatogênicos, como Metarhizium anisopliae, têm despertado grande interesse como agentes no controle de insetos-pragas. Estas espécies de fungos são especializadas na secreção de um complexo enzimático constituído de proteases, lipases e quitinases, entre outras, estando relacionadas com patogenicidade e virulência. Neste contexto a foi analisada a secreção de quitinases pelos isolados IBCB 167, IBCB 360, IBCB 384 e IBCB 425 de M. anisopliae var. anisopliae, como identificado molecularmente. Contudo, alguns aspectos morfológicos analisados mostram pequenas diferenças entre estes isolados. Para produção de quitinases, os isolados foram cultivados em fermentação submersa na presença e ausência de indutores e em fermentação em estado sólido, tendo crisálida como substrato. A maior síntese de quitinase intracelular foi obtida para IBCB 425 no meio contendo extrato de levedura mais glicose (EG). Visando a produção da enzima extracelular e disponibilidade de fonte de carbono, o meio extrato de levedura mais crisálida (EC), sob agitação foi padronizado para fermentação submersa (FSbm). Os maiores níveis enzimáticos intracelulares para os isolados IBCB 167, IBCB 360, IBCB 384 e IBCB 425 foram obtidos entre 72 h e 216 h e para a forma extracelular entre 96h e 144h. A produção quitinásica em fermentação sólida (FSS) utilizando crisálida como fonte de carbono foi otimizada por delineamento composto central rotacional (DCCR, tendo como variáveis o tempo de crescimento e umidade. O melhor produtor de quitinase em FSS foi o isolado IBCB 360. A análise do secretoma mostrou um maior número de proteínas quando os isolados foram cultivados na presença do indutor, com destaque para o isolado IBCB 425. A maioria das proteínas secretadas pelos isolados IBCB 167 e IBCB 384, foram identificadas, estando entre elas a endo-N-acetyl--D-glucosaminidase, enzima do complexo quitinolítico. As quitinases produzidas pelos quatro isolados foram parcialmente purificadas em DEAE Celulose, obtendo-se dois picos de atividade quitinásica. O processo de purificação foi continuado para o IBCB 384 em coluna de exclusão molecular, obtendo se um único pico de atividade quitinásica, analisado por electrospray. A temperatura ótima de atividade para as quitinases produzida em FSS pelos isolados IBCB 167, IBCB 360, IBCB 384 e IBCB 425 variou de 50ºC a 60ºC e pH ótimo de atividade ficou na faixa de 5,0 - 5,5. As quitinases dos isolados mantiveram-se estáveis nas temperaturas de 30ºC e 40ºC e em uma ampla faixa de pH. Os sais BaCl2 e MnCl2 ativaram as quitinases dos isolados IBCB 167 e IBCB 425. Além disso, todas as quitinases foram tolerantes ao - mercaptoetanol. O comportamento cinético de todas as quitinases foi Michaeliano e a maior afinidade pelo substrato foi para a quitinase do isolado IBCB 360. Já os experimentos in vivo e in vitro mostraram que o isolado IBCB 425 foi melhor na fase pré-infecção e isolado IBCB 384 foi melhor na fase pós infecção, sendo o mais virulento. Portanto, os isolados M. anisopliae têm se mostrado como bons produtores de quitinases, com boa estabilidade a temperatura e pH além de outras características distintas que provavelmente estão relacionadas com o potencial de patogenicidade e virulência de cada isolado. / Entomopathogenic fungi such as Metarhizium anisopliae, have been attracting great interest as agents to control insect pests. These species of fungi are specialized in the secretion of an enzymatic complex consisting of proteases, lipases and chitinases, among others which are related to pathogenicity and virulence. In this context the secretion of chitinase by IBCB 167, IBCB 360, IBCB 384 and IBCB 425 isolated from M. anisopliae var. anisopliae molecularly identified, were analyzed. However, some structural features analyzed showed small differences among these isolates. For chitinase production, the isolates were grown in submerged culture in the presence and absence of inducers and under solid state fermentation with chrysalis as substrate. The enhanced synthesis of intracellular chitinase was obtained with IBCB 425 using yeast extract plus glucose (EG). Aiming to produce the extracellular enzyme and the carbon source available, the medium yeast extract and chrysalis (EC), was standardized to SbmF. The high intracellular enzymes levels produced by IBCB 167, IBCB 360, IBCB 384 and IBCB 425 isolates were obtained between 72 h and 216 h and for the extracellular form between 96h and 144h. The chitinase production in SSF using chrysalis as carbon source was optimized by CCRD, having the time of growth and moisture as variables. The best producer of chitinase in SSF was the isolated IBCB 360. The analysis of the secretome showed a great number of proteins when the isolates were grown in the presence of the inducer, especially for the isolated IBCB 425. Most of the proteins secreted by IBCB 167 and IBCB 384 isolates were identified. Among these proteins the endo-N-acetyl--D-glucosaminidase was identified, enzyme that participates in the chitinulitic complex. Chitinases produced by the isolates were partially purified on DEAE - cellulose, yielding two peaks of chitinase activity. The purification process was continued for IBCB 384 isolated using molecular exclusion chromatographic column, yielding only one peak of chitinase activity, analyzed by electrospray. The optimal temperature for the chitinase activity from IBCB 167, IBCB 360, IBCB 384 and IBCB 425 isolates obtained in SSF, ranged from 50 ºC to 60 ºC and the optimum pH of activity was 5.0 to 5.5. All chitinases were stable at 30 ºC and 40 ºC, and wide pH range. The BaCl2 and MnCl2 salts activated the chitinases of IBCB 167 and IBCB 425 isolates. In addition, all chitinases were mercaptoethanol tolerant. The kinetic behavior of all chitinases was Michaelian with the highest affinity to the substrate observed for the chitinase of isolated IBCB 360. The in vivo and in vitro experiments showed that isolated IBCB 425 was better in pre -infection phase and the isolated IBCB 384 was better in the post infection phase. Therefore, the M. anisopliae isolates were good producers of chitinases with interesting temperature and pH stability, and other different characteristics that are probably related to the potential pathogenicity and virulence of each isolate.

A maior parte dos insetos possui uma estrutura anatômica em forma de filme (membrana peritrófica, MP) composta de quitina e proteínas (peritrofinas), que separa o alimento do epitélio do intestino médio. A MP protege o epitélio de microorganismos e da abrasão, e possui outras funções baseadas no fato de que a MP promove a compartimentalização de enzimas, que incluem: aumento da eficiência digestiva através da diminuição da taxa de excreção das enzimas e de outros mecanismos postulados que são testados nesta tese. A síntese das peritrofinas é mais conhecida do que a da quitina componente da MP, tornando desejável um esforço no detalhamento dessa última. Foram realizadas a caracterização e expressão de genes de S. frugiperda que codificam uma peritrofina e enzimas responsáveis pela síntese e degradação de quitina (quitina sintases 1 (SfCHS1) e 2 (SfCHS2), e quitinase (SfCHI), respectivamente). As sequências dos cDNAs correspondentes foram determinadas através da amplificação de fragmentos de PCR que se sobrepõem. Os padrões de expressão dos genes envolvidos no metabolismo da quitina da MP foram analisados durante o desenvolvimento do inseto por RT-PCR. SfCHS2 é expresso no intestino médio durante os estágios de alimentação da larva, enquanto que SfCHI é expresso durante as fases de pós-alimentação, pré-pupa, e pupa. Ambos os genes são predominantemente expressos na região anterior no intestino médio com um gradiente decrescente de expressão ao longo do tubo digestivo. A citolocalização da quitina revelou que o polissacarídeo está presente somente quando SfCHS2 é expresso e não há quitina no intestino médio quando SfCHI é expresso. Esses resultados levaram a formulação da hipótese de que SfCHS2 é responsável pela síntese da quitina da MP durante o estágio larval e SfCHI degrada a quitina da MP durante a muda larva-pupa, sugerindo padrões inversos de expressão desses genes. Em Spodoptera frugiperda, Tenebrio molitor e Musca domestica é possível prever o sítio de secreção das enzimas digestivas (ventrículo anterior, médio ou posterior) a partir da distribuição antero-posterior das enzimas no espaço endoperitrófico. Também foi possível mostrar, usando vários modelos experimentais, que a separação de compartimentos luminais pela MP: a) impede a inibição de despolimerazes por remover oligômeros do espaço endoperitrófico; b) evita a inibição de oligômero hidrolases restringindo-as ao espaço ectoperitrófico e impedindo que entrem em contato com o alimento e c) anula a inibição de enzimas envolvidas na digestão terminal presentes na superfície do epitélio, impedindo que o alimento entre em contato com elas. / Most insects have a film-like anatomical structure (peritrophic membrane, PM) composed of chitin and proteins (peritrophins), which separates food from midgut tissue. It protects the epithelium against food abrasion and microrganisms and has other functions based on compartmentalization of enzymes, which include: increasing digestive efficiency by decreasing enzyme excretion and by other mechanisms that were tested in this thesis. The peritrophin synthesis is less known than PM chitin synthesis, which needs to be better understood. The characterization and expression of S. frugiperda genes encoding a peritrophin and enzymes responsible for the synthesis and degradation of chitin, chitin synthases 1(SfCHS1) and 2 (SfCHS2), and chitinase (SfCHI), respectively, were analysed. Sequences of corresponding cDNAs were determined by amplification of overlapping PCR fragments and the expression patterns of chitin metabolism genes were analyzed during insect development by RT-PCR. SfCHS2 is expressed in the midgut during the feeding stages, whereas SfCHI is expressed during the wandering and pupal stages. Both genes are predominantly expressed in the anterior portion of the midgut with a decreasing gradient of transcript levels in the medial and posterior portions. Chitin staining revealed that the polysaccharide is present in the PM only when SfCHS2 is expressed. There is little or no chitin in the midgut when SfCHI is expressed. These results support the hypothesis that SfCHS2 is responsible for PM chitin synthesis during the larval stage and SfCHI for PM chitin degradation during larval-pupal molting, suggesting inverse patterns of expression of these genes. The secretion site (anterior, middle or posterior midgut) of digestive enzymes can be predicted in Spodoptera frugiperda, Tenebrio molitor and Musca domestica based on enzyme activity distribution along the endoperitrophic space. We also have shown, using several experimental models, that the luminal compartment separation by PM: a) avoid the polimer hidrolases inhibition by removing oligomer from endoperitrophic space; b) decrease the oligomer hidrolases inhibition by restricting them to the ectoperitrophic space (by avoiding their contact with food); and c) block the inhibition of enzymes located at the cell surface involved in terminal digestion by avoiding their contact with food.

A maior parte dos insetos possui uma estrutura anatômica em forma de filme (membrana peritrófica, MP) composta de quitina e proteínas (peritrofinas), que separa o alimento do epitélio do intestino médio. A MP protege o epitélio de microorganismos e da abrasão, e possui outras funções baseadas no fato de que a MP promove a compartimentalização de enzimas, que incluem: aumento da eficiência digestiva através da diminuição da taxa de excreção das enzimas e de outros mecanismos postulados que são testados nesta tese. A síntese das peritrofinas é mais conhecida do que a da quitina componente da MP, tornando desejável um esforço no detalhamento dessa última. Foram realizadas a caracterização e expressão de genes de S. frugiperda que codificam uma peritrofina e enzimas responsáveis pela síntese e degradação de quitina (quitina sintases 1 (SfCHS1) e 2 (SfCHS2), e quitinase (SfCHI), respectivamente). As sequências dos cDNAs correspondentes foram determinadas através da amplificação de fragmentos de PCR que se sobrepõem. Os padrões de expressão dos genes envolvidos no metabolismo da quitina da MP foram analisados durante o desenvolvimento do inseto por RT-PCR. SfCHS2 é expresso no intestino médio durante os estágios de alimentação da larva, enquanto que SfCHI é expresso durante as fases de pós-alimentação, pré-pupa, e pupa. Ambos os genes são predominantemente expressos na região anterior no intestino médio com um gradiente decrescente de expressão ao longo do tubo digestivo. A citolocalização da quitina revelou que o polissacarídeo está presente somente quando SfCHS2 é expresso e não há quitina no intestino médio quando SfCHI é expresso. Esses resultados levaram a formulação da hipótese de que SfCHS2 é responsável pela síntese da quitina da MP durante o estágio larval e SfCHI degrada a quitina da MP durante a muda larva-pupa, sugerindo padrões inversos de expressão desses genes. Em Spodoptera frugiperda, Tenebrio molitor e Musca domestica é possível prever o sítio de secreção das enzimas digestivas (ventrículo anterior, médio ou posterior) a partir da distribuição antero-posterior das enzimas no espaço endoperitrófico. Também foi possível mostrar, usando vários modelos experimentais, que a separação de compartimentos luminais pela MP: a) impede a inibição de despolimerazes por remover oligômeros do espaço endoperitrófico; b) evita a inibição de oligômero hidrolases restringindo-as ao espaço ectoperitrófico e impedindo que entrem em contato com o alimento e c) anula a inibição de enzimas envolvidas na digestão terminal presentes na superfície do epitélio, impedindo que o alimento entre em contato com elas. / Most insects have a film-like anatomical structure (peritrophic membrane, PM) composed of chitin and proteins (peritrophins), which separates food from midgut tissue. It protects the epithelium against food abrasion and microrganisms and has other functions based on compartmentalization of enzymes, which include: increasing digestive efficiency by decreasing enzyme excretion and by other mechanisms that were tested in this thesis. The peritrophin synthesis is less known than PM chitin synthesis, which needs to be better understood. The characterization and expression of S. frugiperda genes encoding a peritrophin and enzymes responsible for the synthesis and degradation of chitin, chitin synthases 1(SfCHS1) and 2 (SfCHS2), and chitinase (SfCHI), respectively, were analysed. Sequences of corresponding cDNAs were determined by amplification of overlapping PCR fragments and the expression patterns of chitin metabolism genes were analyzed during insect development by RT-PCR. SfCHS2 is expressed in the midgut during the feeding stages, whereas SfCHI is expressed during the wandering and pupal stages. Both genes are predominantly expressed in the anterior portion of the midgut with a decreasing gradient of transcript levels in the medial and posterior portions. Chitin staining revealed that the polysaccharide is present in the PM only when SfCHS2 is expressed. There is little or no chitin in the midgut when SfCHI is expressed. These results support the hypothesis that SfCHS2 is responsible for PM chitin synthesis during the larval stage and SfCHI for PM chitin degradation during larval-pupal molting, suggesting inverse patterns of expression of these genes. The secretion site (anterior, middle or posterior midgut) of digestive enzymes can be predicted in Spodoptera frugiperda, Tenebrio molitor and Musca domestica based on enzyme activity distribution along the endoperitrophic space. We also have shown, using several experimental models, that the luminal compartment separation by PM: a) avoid the polimer hidrolases inhibition by removing oligomer from endoperitrophic space; b) decrease the oligomer hidrolases inhibition by restricting them to the ectoperitrophic space (by avoiding their contact with food); and c) block the inhibition of enzymes located at the cell surface involved in terminal digestion by avoiding their contact with food.