Conselho Nacional de Desenvolvimento CientÃfico e TecnolÃgico / As quitinases sÃo enzimas capazes de hidrolisar as ligaÃÃes β-(1,4)-glicosÃdicas presentes em biopolÃmeros de N-acetil-β-D-glucosamina, principalmente quitina, um polissacarÃdeo estrutural presente na parede celular de diversos fungos. No presente trabalho, uma quitinase de classe I de feijÃo-de-corda (Vigna unguiculata) foi expressa em sistemas heterÃlogos e a proteÃna recombinante (rVuChi) foi caracterizada bioquimicamente bem como em relaÃÃo ao seu efeito sobre o crescimento micelial e germinaÃÃo de esporos/conÃdios de fungos filamentosos. A seqÃÃncia de DNA codificando a proteÃna foi amplificada por PCR e clonada nos vetores de expressÃo pET32a(+) e pPICZαA, para expressÃo heterÃloga em Escherichia coli e Pichia pastoris, respectivamente. A expressÃo de rVuChi em cÃlulas de E. coli ArticExpress DE3 se deu em corpos de inclusÃo. Em seis estirpes de P. pastoris a proteÃna recombinante foi secretada, de forma solÃvel, para o meio de cultura. Na fraÃÃo extracelular da estirpe KM71H foi observada a maior atividade quitinolÃtica, apÃs 72 horas de induÃÃo. A detecÃÃo de rVuChi foi feita por SDS-PAGE e com o kit Invision His-Tag stain, onde foram identificadas duas bandas protÃicas de massas moleculares aparentes de 30 e 33 kDa. Ambas as bandas apresentaram a mesma sequÃncia N-terminal e a ausÃncia de N-glicosilaÃÃo foi verificada. A quitinase recombinante estava presente principalmente na fraÃÃo F0/40 precipitada com sulfato de amÃnio e foi purificada a homogeneidade tanto por cromatografia de afinidade em matriz de quitina (com rendimento de 18,31 mg por litro de meio de cultura), quanto por cromatografia de interaÃÃes hidrofÃbicas em coluna de Phenyl Sepharose CL-4B (rendimento de 13,2 mg/L), seguidas de ultrafiltraÃÃo em membrana com limite de exclusÃo de 50 kDa. A rVuChi apresentou atividades endo e exo-quitinolÃtica frente a quitina coloidal e hidrolisou glicol-quitina em gel de SDS-PAGE, embora nÃo tenha apresentado atividade contra substratos sintÃticos contendo p-nitrofenol. A quitinase purificada apresentou massa molecular de 32 e 33,1 kDa por cromatografia de exclusÃo molecular em colunas de Superose 12 HR e Superdex 200, respectivamente. Em gel bidimensional, rVuChi apresentou um conjunto de seis âspotsâ com pI entre 4,44 e 5,15. A quitinase mostrou-se ainda termoestÃvel em temperaturas atà 50 ÂC e sua atividade enzimÃtica mÃxima ocorreu em pH 5. Em geral, a presenÃa de Ãons metÃlicos causou uma reduÃÃo de sua atividade enzimÃtica. O agente quelante EDTA (0,5%) estimulou a atividade enzimÃtica enquanto que o detergente SDS (0,5%) a inibiu totalmente. A quitinase recombinante apresentou 37% de hÃlice alfa e 26% de folha beta, como determinado por espectroscopia de dicroÃsmo circular. A desnaturaÃÃo de 50% das molÃculas de rVuChi ocorreu a 54,41 ÂC. Os espectros de fluorescÃncia revelaram que a proteÃna produzida em P. pastoris estava em sua conformaÃÃo totalmente enovelada. A quitinase recombinante de feijÃo-de-corda foi capaz de inibir totalmente a germinaÃÃo de esporos de Penicillium herquei atà 48 horas, na dose de 100 μg e causou inibiÃÃo de 68%, nas doses de 50, 25 e 12,5 μg. Na dose de 150 μg, houve uma inibiÃÃo de 55% na germinaÃÃo dos conÃdios de Rhizoctonia solani e um leve efeito sobre a germinaÃÃo dos esporos de Colletotrichum lindemuthianum e C. musae. Nenhum efeito da rVuChi foi observado sobre a germinaÃÃo de esporos dos fungos C. gloeosporioides, Fusarium solani e F. oxysporum. AlÃm disso, a proteÃna recombinante retardou o crescimento micelial de P. herquei em aproximadamente 50% (100 μg), porÃm nÃo apresentou efeito sobre o crescimento micelial dos demais fungos. Desta forma, a quitinase classe I de V. unguiculata à uma proteÃna com atividade antifÃngica. / Chitinases are enzymes that hydrolyze the β-(1,4) glycosidic bonds present in biopolymers of N-acety-β-D-glucosamine, mainly chitin, a structural polysaccharide which is found in cell walls of several fungi. In plants, chitinases play a role as defense proteins against the attack of pests and pathogens. In this work, a class I chitinase from cowpea (Vigna unguiculata) was expressed in heterologous systems. The recombinant protein (rVuChi) was purified, and characterized biochemically and in relation to its effects on mycelial growth and germination of spores/conidia of filamentous fungi. The DNA coding sequence of the cowpea chitinase was amplified by PCR and the products cloned in the expression vectors pET32a(+) and pPICZαA, for heterologous expression in Escherichia coli and Pichia pastoris, respectively. In E. coli cells, the recombinant fusion protein occurred mainly as inclusion bodies. On the other hand, in six strains of P. pastoris, the recombinant cowpea chitinase was secreted in a soluble form into the culture medium. The highest chitinase activity was detected in the extracellular fraction of KM71H strain, 72 hours after induction. The recombinant VuChi was detected by SDS-PAGE and Invision His-Tag stain kit, which identified two protein bands with apparent molecular masses of 30 and 33 kDa. These two protein bands showed the same N-terminal sequence, and an absence of N-glycosylation. Most recombinant chitinase secreted into the culture medium was recovered in the fraction F0/40, precipitated with ammonium sulfate. The expressed protein was purified to homogeneity by affinity chromatography on chitin matrix (yield of 18.31 mg per liter of culture medium), or by hydrophobic interactions chromatography on a column of Phenyl Sepharose CL-4B (yield = 13.2 mg/L), followed by ultrafiltration in a membrane with exclusion limit of 50 kDa. The purified rVuChi was able to hydrolyze colloidal chitin (in solution) as well as glycol chitin (in SDS-PAGE), although it did not show enzymatic activity against synthetic substrates containing p-nitrophenol. The purified chitinase showed molecular masses of 32 and 33.1 kDa by size exclusion chromatography on columns of Superose 12 HR and Superdex 200, respectively. When submitted to 2D electrophoresis, rVuChi presented a set of six spots with pI values between 4.44 and 5.15. The chitinase was thermostable at temperatures up to 50  C and the enzyme activity was highest at pH 5. In general, the presence of metal ions caused a reduction of its enzymatic activity. The chelating agent EDTA (0.5%) stimulated the enzyme activity, whereas in the presence of the detergent SDS (0.5%) the rVuChi activity was completely inhibited. The recombinant chitinase showed 37% of alpha helix and 26% of beta sheet, as determined by circular dichroism spectroscopy. Denaturing of 50% of the rVuChi molecules occurs at 54.41  C. The fluorescence spectra showed that the protein produced in P. pastoris was in its fully folded conformation. The recombinant cowpea chitinase was able to completely inhibit the germination of spores of Penicillium herquei, after 48 hours, at a dose of 100 mg, and caused 68% inhibition at doses of 50, 25 and 12.5 mg. At a dose of 150 mg, there was 55% inhibition on conidial germination of Rhizoctonia solani and a slight effect on spore germination of Colletotrichum lindemuthianum and C. musae. There was no effect of rVuChi on spore germination of C. gloeosporioides, Fusarium solani and F. oxysporum. In addition, the recombinant protein delayed the mycelial growth of P. herquei in approximately 50% (at the dose of 100 mg) but had no effect on mycelial growth of the other fungi. Therefore, the cowpea class I chitinase is a protein with anti-fungal activity.

Submitted by Chaylane Marques (chaylane.marques@ufpe.br) on 2015-03-13T19:12:41Z No. of bitstreams: 2 Daniel_Tese - Fevereiro 2012.pdf: 2496504 bytes, checksum: 0a41c4b620d4bc11a409448f39581a21 (MD5) license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-03-13T19:12:41Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Daniel_Tese - Fevereiro 2012.pdf: 2496504 bytes, checksum: 0a41c4b620d4bc11a409448f39581a21 (MD5) license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) Previous issue date: 2012-02 / A murcha de fusário, causada por Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici (Fol), é uma importante doença para a cultura do tomate, sendo a utilização de cultivares resistentes a melhor estratégia para o controle desse patógeno. A transformação genética de plantas constitui instrumento biotecnológico essencial para o melhoramento, pela introdução de genes exógenos, manutenção das características originais da variedade e encurtamento do tempo para obtenção de uma nova cultivar. Um dos maiores obstáculos para a manutenção dessa resistência reside na busca de genes alvos envolvidos na defesa em plantas e monitoramento da variabilidade dos fitopatógenos. Assim, este estudo foi conduzido com o objetivo de determinar a variabilidade genética de diferentes isolados das três raças de Fol, mediante marcadores moleculares, caracterizar um gene diferencialmente expresso isolado de um genótipo resistente não comercial submetido ao ataque de fusário e de transferir, via transformação genética, esse gene para uma cultivar comercial sensível ao fungo. Analisando a variabilidade genética de isolados pertencentes às três raças de Fol utilizando marcadores moleculares RAPD e IGS, foi demonstrado que a raça 3 é distinta das demais raças, estabelecendo um agrupamento das raças 1 e 2. Devido ao fato das cultivares comerciais com resistência às raças 2 e 3 de Fol, ainda não estarem amplamente disponíveis, com o objetivo de identificar genes envolvidos em defesa, foi construída uma biblioteca de cDNA usando hibridização subtrativa supressiva (Suppresive Subtractive Hybridization, SSH) a partir de um genótipo resistente (genótipo BRH) desafiado com a raça 2 de Fol. Dentre os genes identificados, uma quitinase (SolChi) foi selecionada para verificar respostas no nível da expressão gênica das plantas BRH submetidas à inoculação com a raça 2 de Fol, utilizando a técnica de PCR em tempo real (qRT-PCR), em que a normalização da expressão desse gene foi feita a partir da expressão do fator de elongação α1 (EF-1α) de tomate, classificado como gene housekeeping. Observou-se o aumento da expressão do gene SolChi após 24 horas da inoculação do fitopatógeno em tecido radicular quando comparado com as plantas controles. O gene SolChi foi transferido para a cultivar comercial Santa Clara, sensível à murcha de fusário, por transformação genética via Agrobacterium tumefaciens, estirpe EHA 105, sob o controle do promotor 35S de CaMV duplicado, superexpressando esse gene. Mudas transgênicas (T0) foram confirmadas por PCR, usando primers específicos, para o transgene e a frequência de transformação obtida foi de 7%. A transformação e transcrição dos transgenes foram confirmadas em T1 por PCR e transcrição reversa- PCR (RT-PCR) respectivamente. A resistência ao patógeno será, posteriormente, avaliada pela inoculação de isolado da raça 2 de Fol em plantas mantidas in vivo. Isolado da raça 2 de Fol induz a expressão diferenciada do gene de SolChi em raízes de tomateiro genótipo BRH, sugerindo uma possível participação no mecanismo de defesa do tomateiro contra o fusário, indicando um importante alvo para programas de melhoramento, em que também faz-se necessário o estudo constante da variabilidade genética do patógeno.

Orientador: Helia Harumi Sato / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Engenharia de Alimentos / Made available in DSpace on 2018-08-06T15:33:09Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Fleuri_LucianaFrancisco_D.pdf: 2217112 bytes, checksum: 6e5410649f00f4a57c5ec78f758b6ebb (MD5) Previous issue date: 2006 / Resumo: O presente trabalho visou o estudo da produção, purificação e aplicação de b-1,3 glucanases, proteases e quitinases. A linhagem Cellulosimicrobium cellulans 191 foi utilizada para o estudo da produção de b-1,3 glucanases e quitinases e as linhagens B26 e C. cellulans 191 foram utilizadas para a produção de proteases, em meios de cultivo contendo diferentes indutores. Foram realizados planejamentos fatorias 23, e os fatores estudados foram: pH inicial, temperatura (oC) e agitação dos frascos. No planejamento experimental para a produção de b-1,3 glucanase foi verificado maior produção da enzima (0,64 U/mL) em meio de cultivo A composto por 2,0 g/L de (NH4)2SO4; 0,2 g/L de MgSO4.7H2O e 10 g/L de parede celular de levedura em tampão fosfato 0,2 M, pH 8,5, após 24 h de fermentação, a 33oC e 200 rpm. Nos planejamentos experimentais para a produção de protease pelas linhagens B26 e 191 foi verificado maior produção da enzima em meio de cultivo B composto por 2,0 g/L de (NH4)2SO4; 0,2 g/L de MgSO4.7H2O e 80 g/L de levedura seca utilizada como indutor em tampão fosfato 0,15 M, pH 6,5, após 30 h de fermentação a 20oC e 200 rpm, sendo obtido 5,01 U/mL e 4,25 U/mL, respectivamente. No planejamento experimental para a produção de quitinase foi verificado maior produção da enzima (7,06 U/mL) em meio de cultivo C composto por 4,0 g/L de extrato de levedura; 2,0 g/L de triptona; 4,0 g/L de MgSO4.7H2O; 1,2 g/L de KH2PO4; 2,8 g/L de K2HPO4 e 15 g/L de quitina neutralizada utilizada como indutor, com pH inicial de 5,5 após 72 h de fermentação a 25oC e 200 rpm. Todos os modelos obtidos foram preditivos e significativos a um nível de confiança de 95%. No estudo de produção das enzimas da linhagem C. cellulans 191 em fermentador de 5 L, a maior produção de b-1,3 glucanase, utilizando meio de cultivo A e 1,5 vvm e 3 vvm, foi respectivamente 0,32 U/mL e 0,72 U/mL, após 24 h de fermentação a 30oC. Na produção de protease em fermentador de 5 L, utilizando meio de cultivo B e 1,5 vvm foi obtido 1,87 U/mL e 2,34 U/mL, respectivamente, após 6 h e 30 h de fermentação a 30oC; enquanto que com 3 vvm, foi obtido 4,89 U/mL e 6,14 U/mL de protease após 6 h e 33 h de fermentação, a 30oC. Em fermentador de 5 L, a maior produção de quitinase em meio de cultivo C foi de 4,19 U/mL com 1,5 vvm após 168 h de fermentação e 4,38 U/mL de quitinase após 144 h de fermentação com 3 vvm, a 25oC. No estudo de produção de b-1,3 glucanases, proteases e quitinases da linhagem C. cellulans 191 em frascos agitados, em meios de cultivo A, B e C, foram produzidos respectivamente, 1,12 U/mL de b-1,3 glucanase; 4,2 U/mL de protease e 6,9 U/mL de quitinase. A b-1,3 glucanase (45 KDa) foi purificada 11,83 vezes com rendimento de 25% em resina de troca iônica DEAE-Sephadex A50. Na purificação das proteases em resina de troca iônica DEAE-Sephadex A50 foram obtidas três frações de proteases denominadas P1, P2 e P3. A fração P3 apresentou duas bandas de massas moleculares de 14 e 16 KDa em eletroforese SDS-PAGE. A quitinase (61 KDa) foi purificada cerca de 6,65 vezes com rendimento de 46,61% em resina de filtração em gel Sepharose CL4B200. A b-1,3 glucanase purificada apresentou atividade de lise de diversas leveduras e foi capaz de formar protoplastos da levedura Saccharomyces cerevisiae KL-88. O pré-tratamento das leveduras com protease P3 purificada não aumentou a lise das leveduras com a ß-1,3 glucanase. A quitinase purificada foi capaz de lisar células de algumas espécies de fungos em suspensão aquosa, mas não foi capaz de inibir, o crescimento dos fungos em placas de ágar batata dextrose. A preparação bruta de quitinase apresentou halo de inibição do crescimento de alguns fungos estudados. Os produtos formados pela reação da b-1,3 glucanase purificada sobre a laminarina e da protease purificada sobre a levedura seca apresentaram capacidade antioxidante / Abstract: The aim of this work was to study the production, purification and application of b-1,3 glucanases, proteases and chitinases. The strain Cellulosimicrobium cellulans 191 was used to study the production of b-1,3 glucanases and chitinases and strains B26 and C. cellulans 191 for the production of proteases, using culture media containing different inductors. 23 factorial experimental designs were performed and the factors studied were: initial pH, temperature (oC) and flask rotatory speed. In the experimental design for the production of b-1,3 glucanase, greater enzyme production (0.64 U/mL) was obtained in culture medium A containing 2.0 g/L (NH4)2SO4; 0.2 g/L MgSO4.7H2O and 10 g/L cell wall yeast in 0.2 M phosphate buffer, pH 8.5, after 24 h of fermentation at 33oC and 200 rpm. In the experimental design for the production of protease by strains B26 and 191, greater enzyme production was obtained in culture medium B containing 2.0 g/L (NH4)2SO4; 0.2 g/L de MgSO4.7H2O and 80 g/L dry yeast in 0.15 M phosphate buffer, pH 6.5, after 30 h of fermentation at 20oC and 200 rpm, with yields of 5.01 U/mL and 4.25 U/mL, respectively. In the experimental design for the production of chitinase, greater enzyme production (7.06 U/mL) was obtained in culture medium C containing 4.0 g/L yeast extract; 2.0 g/L tryptone; 4.0 g/L MgSO4.7H2O; 1.2 g/L KH2PO4; 2.8 g/L K2HPO4 and 15 g/L of neutralized chitin with an initial pH of 5.5, after 72 h of fermentation at 25oC and 200 rpm. All models obtained were predictive and significant at a confidence level of 95%. In the study on the production of enzymes from C. cellulans strain 191 in a 5 L fermenter, the highest productions of b-1,3 glucanase in medium A with 1.5 vvm and 3.0 vvm were 0.32 U/mL and 0.72 U/mL respectively, after 24 h of fermentation at 30oC. In the production of protease in a 5 L fermenter using culture medium B and 1.5 vvm, 1.87 U/mL and 2.34 U/mL were obtained after 6 h and 30 h respectively of fermentation at 30oC, whilst with 3 vvm, 4.89 U/mL and 6.14 U/mL of protease were obtained after 6 h and 33 h respectively of fermentation at 30oC. In a 5 L fermenter, the highest production of chitinase from C. cellulans strain 191 using 1.5 vvm was 4.19 U/mL after 168 h of fermentation, whilst with 3 vvm, the production was 4.38 U/mL of chitinase after 144 h of fermentation at 25oC. In the study on the production of b-1,3 glucanases, proteases and chitinases from C. cellulans strain 191 in shaken flasks and culture media A, B and C, 1.12 U/mL of b-1,3 glucanase; 4.2 U/mL of protease and 6.9 U/mL of chitinase were produced respectively. In the purification study, the b-1,3 glucanase (45 KDa) was purified 11.83 times with a yield of 25% using a DEAE-Sephadex A50 ion-exchange resin. In the purification of the proteases using the DEAE-Sephadex A50 ion-exchange resin, three protease fractions were obtained named P1, P2 and P3. Fraction P3 presented two proteins with molecular weights of 14 and 16 KDa in SDS-PAGE electrophoresis. The chitinase (61 KDa) was purified about 6.65 times with a yield of 46.61% in a Sepharose CL4B200 gel filtration resin. The purified b-1,3 glucanase presented lysis activity against several yeasts and was able to form protoplasts from the Saccharomyces cerevisiae KL-88 yeast. Pre-treatment of the yeasts with the purified protease P3 did not increase cell lysis by the b-1,3 glucanase. The purified chitinase was able to lyse the cell walls of some fungal species in aqueous suspension, but was not able to inhibit the growth of these fungi on potato dextrose agar plates. The crude chitinase preparation presented growth inhibition halos for some of the fungi studied. The products formed from the reaction between the purified b-1,3 glucanase and laminarin and between the purified protease and the dry yeast presented antioxidant power / Doutorado / Doutor em Ciência de Alimentos

Made available in DSpace on 2014-07-29T15:16:35Z (GMT). No. of bitstreams: 1 dissertacao parte 1 lidiane biologia.pdf: 35041 bytes, checksum: c58f88ce1be4655ee71c7b5ab0bef247 (MD5) Previous issue date: 2008-04-03 / Paracoccidoides brasiliensis is a human pathogenic dimorphic fungus. The recombinant chitinase from P. brasiliensis, Pbcts1r, was overexpressed in Escherichia coli using pET-32a (+) as vector. The enzyme was produced as inclusion bodies and became soluble by Sarkosyl being purified by a single step using a Ni-NTA resin. Pbcts1r showed activity against 4-MU-(GlcNAc)3 and 4-MU-(GlcNAc)2, presenting a endochitinase activity. Immunoblot reaction with anti-Pbcts1r identified two proteins in yeast crude extract. A partial purification of P. brasiliensis yeast crude extract by cationic-exchange chromatography on HPLC revealed two different chitinases, Pbcts1 and Pbcts2, with molecular mass of 45 kDa and 34 kDa, respectively. Pbcts2 has exochitinase activity and Pbcts1 has endochitinase activities. Reactions with anti- Pbcts1r showed the presence of Pbcts1 and Pbcts2 in crude extracts of yeast and transition from mycelium to yeast. On mycelium crude extracts was found only Pbcts1 and on yeast cell wall extract only Pbcts2. Both proteins were found to be secreted by yeast parasitic phase showing their probable importance in the permanence of the fungus in the human host. Phylogenetic relationships between the orthologs Pbcts1 and the putative Pbcts2 indicated the presence of a common ancestral. During evolution, P. brasiliensis could have acquired Pbcts2 and Pbcts1 playing distinct roles in order to growth and survive in diverse environment on saprophytic and parasitic phases / Paracoccidioides brasiliensis é um fungo dimórfico patogênico humano. A quitinase recombinante de P. brasiliensis, Pbcts1r, foi superexpressa em Escherichia coli utilizando pET-32(a)+ como vetor. A enzima foi produzida em corpos de inclusão e se tornou solúvel pela adição de sarkosyl, sendo purificada em um único passo com a utilização da resina Ni-NTA. Pbcts1r mostrou atividade diante de 4-MU-(GlcNAc)3 e 4- MU-(GlcNAc)2, apresentando atividade de endoquitinase. A reação de imunoblot com anti-Pbcts1r identificou duas proteínas no extrato bruto de levedura. A purificação parcial do extrato bruto de P. brasiliensis por cromatografia de troca-catiônica em HPLC revelou duas quitinases diferentes, Pbcts1 e Pbcts2, com massas moleculares de 45 e 34 kDa, respectivamente. Pbcts2 tem atividade de exoquitinase e Pbcts1 de endoquitinase. Reações com anti-Pbcts1r mostraram a presença de Pbcts1 e Pbcts2 no extrato bruto de levedura e transição de micélio para levedura. No extrato bruto de micélio foi encontrado somente Pbcts1 e no extrato de parede celular de levedura somente Pbcts2. Ambas as proteínas foram encontradas secretadas pela fase parasitária (levedura), mostrando a provável importância dessas proteínas na permanência do fungo no hospedeiro. Relações filogenéticas entre os ortólogos Pbcts1 e a provável Pbcts2 indicam a presença de um ancestral comum. Durante a evolução, P. brasiliensis poderia ter adquirido Pbcts2 e Pbcts1 desempenhando diferentes papéis para o crescimento e sobrevivência do fungo na fase saprofítica e parasitária

CoordenaÃÃo de AperfeiÃoamento de NÃvel Superior / Conselho Nacional de Desenvolvimento CientÃfico e TecnolÃgico / No presente trabalho, foi realizado um estudo preliminar sobre a expressÃo de um gene de quitinase de classe I de feijÃo-de-corda (Vigna unguiculata L.Walp), a clonagem e expressÃo desse gene em cÃlulas de Escherichia coli BL21(λ)DE3 e a determinaÃÃo via modelagem por homologia da estrutura tridimensional dessa proteÃna. A expressÃo do gene da quitinase de classe I de feijÃo-de-corda foi obtida a partir de RT-PCR com oligonucleotÃdeos iniciadores especÃficos. Nessas reaÃÃes, foram usadas amostras de RNA total de sementes e vagens em diferentes estÃgios de crescimento (2, 4, 6, 8 , 10, 12, 14, 16 e 18 dias), pertencentes a dois genÃtipos contrastantes quanto a infecÃÃo pelo Callosobruchus maculatus, IT81D-1053 (resistente) e TE97-419-07F (suscetÃvel). A expressÃo foi avaliada tambÃm em folhas, raÃzes, epicÃtilo e hipocÃtilo de dois genÃtipos contrastantes quanto a infecÃÃo pelo nematÃide das galhas Meloidogyne incongnita, CE-31 (resistente) e TE97-411-1F (suscetÃvel). A clonagem do gene VuChiI foi realizada a partir do produto amplificado da RT-PCR de sementes de IT81D-1053, e do produto amplificado a partir do DNA genÃmico de MONTEIRO. Foram obtidos 11 clones confirmados, dos quais 9 foram seqÃenciados. A subclonagem do clone R7 foi realizada em pET15b e a expressÃo da proteÃna recombinante foi induzida na presenÃa de IPTG 1mM. A proteÃna recombinante, com aproximadamente 30 kDa, foi visualizada atravÃs de um SDS-PAGE. A proteÃna purificada atravÃs de uma cromatografia de afinidade em coluna de Sepharose com NÃquel imobilizado nÃo apresentou atividade quitinÃsica significativa. Os modelos gerados para os clones obtidos e para a quitinase nativa, indicam que as mutaÃÃes ocorridas nÃo alteram os sÃtios ativos das molÃculas. Dessa forma, a quitinase de classe I do feijÃo-de-corda parece apresentar expressÃo constitutiva em todas as partes da planta. A quitinase recombinante obtida foi pouco ativa. As mutaÃÃes pontuais nos clones obtidos sugerem a ocorrÃncia de isoformas dessa proteÃna, o que ainda deve ser elucidado no futuro / In this work we have made a preliminary study on the expression of a class I chitinase gene from cowpea (Vigna unguiculata L.Walp), cloning and expression of this gene in Escherichia coli BL21(λ)DE3 cells and, through homology modeling, we determined the three dimensional structure of this protein. The expression of the class I quitinase gene from cowpea was performed by RTÂPCR from the total RNA, with specific primers, from seeds and pods in distinct stages of development (2, 4, 6, 8 , 10, 12, 14, 16 and 18 days), belonging to two contrasting genotypes regarding to infection by Callosobruchus maculatus, IT81DÂ1053 (resistant) e TE97Â419Â07F (susceptible). The gene expression in leaves, roots, epicotyls and hipocotyls from two contrasting genotypes considering the infection by the nematoid Meloidogyne incongnita, CEÂ31(resistant) e TE97Â411Â1F (susceptible). The VuChiI gene cloning was accomplished from the amplified product on RTÂPCR with IT81DÂ1053 seeds, and the amplified product from the genomic DNA of MONTEIRO. Eleven clones were obtained, from which nine were sequenced. The cloning of R7 clone was accomplished in pET15b vector and the expression of the recombinant protein was induced in the presence of IPTG 1mM. The protein, with 30 kDa, was visualized through a SDSÂPAGE. The protein purified through an affinity chromatography in Sepharose column with immobilized Nickel did not had a significative hydrolytic activity. The models generated for the clones and for the native chitinase, have indicated that mutations that occurred did not changed the molecule's active sites. Thus, the class I chitinase gene from feijÃo de corda seems to present constitutive expression in all parts of the plant. The recombinant chitinase obtained was inactive. The specific mutations in the resulting clones suggests the occurrence of isoforms of this protein, what should be elucidated in the future.

Os fungos entomopatogênicos, como Metarhizium anisopliae, têm despertado grande interesse como agentes no controle de insetos-pragas. Estas espécies de fungos são especializadas na secreção de um complexo enzimático constituído de proteases, lipases e quitinases, entre outras, estando relacionadas com patogenicidade e virulência. Neste contexto a foi analisada a secreção de quitinases pelos isolados IBCB 167, IBCB 360, IBCB 384 e IBCB 425 de M. anisopliae var. anisopliae, como identificado molecularmente. Contudo, alguns aspectos morfológicos analisados mostram pequenas diferenças entre estes isolados. Para produção de quitinases, os isolados foram cultivados em fermentação submersa na presença e ausência de indutores e em fermentação em estado sólido, tendo crisálida como substrato. A maior síntese de quitinase intracelular foi obtida para IBCB 425 no meio contendo extrato de levedura mais glicose (EG). Visando a produção da enzima extracelular e disponibilidade de fonte de carbono, o meio extrato de levedura mais crisálida (EC), sob agitação foi padronizado para fermentação submersa (FSbm). Os maiores níveis enzimáticos intracelulares para os isolados IBCB 167, IBCB 360, IBCB 384 e IBCB 425 foram obtidos entre 72 h e 216 h e para a forma extracelular entre 96h e 144h. A produção quitinásica em fermentação sólida (FSS) utilizando crisálida como fonte de carbono foi otimizada por delineamento composto central rotacional (DCCR, tendo como variáveis o tempo de crescimento e umidade. O melhor produtor de quitinase em FSS foi o isolado IBCB 360. A análise do secretoma mostrou um maior número de proteínas quando os isolados foram cultivados na presença do indutor, com destaque para o isolado IBCB 425. A maioria das proteínas secretadas pelos isolados IBCB 167 e IBCB 384, foram identificadas, estando entre elas a endo-N-acetyl--D-glucosaminidase, enzima do complexo quitinolítico. As quitinases produzidas pelos quatro isolados foram parcialmente purificadas em DEAE Celulose, obtendo-se dois picos de atividade quitinásica. O processo de purificação foi continuado para o IBCB 384 em coluna de exclusão molecular, obtendo se um único pico de atividade quitinásica, analisado por electrospray. A temperatura ótima de atividade para as quitinases produzida em FSS pelos isolados IBCB 167, IBCB 360, IBCB 384 e IBCB 425 variou de 50ºC a 60ºC e pH ótimo de atividade ficou na faixa de 5,0 - 5,5. As quitinases dos isolados mantiveram-se estáveis nas temperaturas de 30ºC e 40ºC e em uma ampla faixa de pH. Os sais BaCl2 e MnCl2 ativaram as quitinases dos isolados IBCB 167 e IBCB 425. Além disso, todas as quitinases foram tolerantes ao - mercaptoetanol. O comportamento cinético de todas as quitinases foi Michaeliano e a maior afinidade pelo substrato foi para a quitinase do isolado IBCB 360. Já os experimentos in vivo e in vitro mostraram que o isolado IBCB 425 foi melhor na fase pré-infecção e isolado IBCB 384 foi melhor na fase pós infecção, sendo o mais virulento. Portanto, os isolados M. anisopliae têm se mostrado como bons produtores de quitinases, com boa estabilidade a temperatura e pH além de outras características distintas que provavelmente estão relacionadas com o potencial de patogenicidade e virulência de cada isolado. / Entomopathogenic fungi such as Metarhizium anisopliae, have been attracting great interest as agents to control insect pests. These species of fungi are specialized in the secretion of an enzymatic complex consisting of proteases, lipases and chitinases, among others which are related to pathogenicity and virulence. In this context the secretion of chitinase by IBCB 167, IBCB 360, IBCB 384 and IBCB 425 isolated from M. anisopliae var. anisopliae molecularly identified, were analyzed. However, some structural features analyzed showed small differences among these isolates. For chitinase production, the isolates were grown in submerged culture in the presence and absence of inducers and under solid state fermentation with chrysalis as substrate. The enhanced synthesis of intracellular chitinase was obtained with IBCB 425 using yeast extract plus glucose (EG). Aiming to produce the extracellular enzyme and the carbon source available, the medium yeast extract and chrysalis (EC), was standardized to SbmF. The high intracellular enzymes levels produced by IBCB 167, IBCB 360, IBCB 384 and IBCB 425 isolates were obtained between 72 h and 216 h and for the extracellular form between 96h and 144h. The chitinase production in SSF using chrysalis as carbon source was optimized by CCRD, having the time of growth and moisture as variables. The best producer of chitinase in SSF was the isolated IBCB 360. The analysis of the secretome showed a great number of proteins when the isolates were grown in the presence of the inducer, especially for the isolated IBCB 425. Most of the proteins secreted by IBCB 167 and IBCB 384 isolates were identified. Among these proteins the endo-N-acetyl--D-glucosaminidase was identified, enzyme that participates in the chitinulitic complex. Chitinases produced by the isolates were partially purified on DEAE - cellulose, yielding two peaks of chitinase activity. The purification process was continued for IBCB 384 isolated using molecular exclusion chromatographic column, yielding only one peak of chitinase activity, analyzed by electrospray. The optimal temperature for the chitinase activity from IBCB 167, IBCB 360, IBCB 384 and IBCB 425 isolates obtained in SSF, ranged from 50 ºC to 60 ºC and the optimum pH of activity was 5.0 to 5.5. All chitinases were stable at 30 ºC and 40 ºC, and wide pH range. The BaCl2 and MnCl2 salts activated the chitinases of IBCB 167 and IBCB 425 isolates. In addition, all chitinases were mercaptoethanol tolerant. The kinetic behavior of all chitinases was Michaelian with the highest affinity to the substrate observed for the chitinase of isolated IBCB 360. The in vivo and in vitro experiments showed that isolated IBCB 425 was better in pre -infection phase and the isolated IBCB 384 was better in the post infection phase. Therefore, the M. anisopliae isolates were good producers of chitinases with interesting temperature and pH stability, and other different characteristics that are probably related to the potential pathogenicity and virulence of each isolate.

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A malária é uma parasitose endêmica da região amazônica causada por protozoários do gênero Plasmodium cujos sintomas incluem febre, dor de cabeça e vômitos, o que induz a uma resposta imunológica característica com o objetivo de combater essa patologia. Os objetivos deste trabalho foram avaliar o comportamento da enzima quitotriosidase em pacientes acometidos por malária no estado do Pará e determinar a frequência da duplicação de 24pb no gene da quitotriosidase em uma amostra representativa. Foi realizada dosagem de quitotriosidase em 100 indivíduos sadios e 47 pacientes com malária para a análise. A análise molecular da duplicação de 24 pb foi realizada em 100 voluntários através de protocolo que incluiu as técnicas de extração de DNA, PCR e depois visualização em gel de agarose 2,5% para verificação dos fragmentos normais (homozigoto normal: 195pb) e com a duplicação de 24pb (homozigoto mutante: 219pb; heterozigoto: 219pb e 195pb). Este trabalho descreveu pela primeira vez na literatura científica a elevação dos níveis plasmáticos de quitotriosidase em pacientes acometidos por malária vivax em comparação com um grupo de indivíduos sadios. Não houve associação entre a parasitemia e os níveis plasmáticos de quitotriosidase nos pacientes com Malária. A análise molecular apresentou uma frequência de 72% de indivíduos homozigotos normais, 24% de indivíduos heterozigotos e 4% de homozigotos mutantes para duplicação de 24 pb. As frequências alélicas ficaram em torno de 84% para o alelo selvagem e 16% para o alelo mutante. Não foi encontrada correlação entre o genótipo e o fenótipo bioquímico (representado pelos níveis de quitotriosidase) no grupo controle. / Chitotriosidase was the first described chitinase and its physiologic role is not entirely clear, although many studies have been showed its participation as a component of human immune response. A 24pb duplication on exon 10 of chit1 gene results on RNAm frameshift, leading to a 87 nucleotides deletion. This alteration generates a protein with no catalytic activity at all. This condition is called chitotriosidase deficiency and presents a frequency close to 6% of homozygosis duplication in different ethnical groups. Malaria is an amazon endemic parasitosis caused by protozoaries of genus Plasmodium and causes symptoms as fever, headache and vomit, which leads to a characteristic immune response. The objective of this study was to evaluate the chitotriosidase enzyme behavior in patients suffering of malaria in Pará state and to determine the frequency of 24pb duplication on chitotriosidase gene in a representative sample. Chitotriosidase measurement was made in 100 healthy individual and in 47 malarial patients. The molecular analysis of the 24pb duplication was realized in 100 volunteers trough a protocol which included DNA extraction techniques, PCR and 2,5% agarose gel visualization to verify normal fragments (normal homozygote: 195pb) and the 24pb duplication (mutant homozygote: 219pb; heterozygote: 219pb e 195pb). This study described at first time on scientific literature the chitotriosidase plasmatic levels increasing in patients suffering of malaria vivax compared to healthy individual. No association was observed between parasitemia and plasmatic chitotriosidase levels in malarial patients. Molecular analysis showed a frequency of 72% normal homozygotes, 24% heterozygotes and 4% mutant homozygotes to 24pb duplication. Allelic frequencies were around 84% to wild allele and 16% to mutant allele. No correlation was found between genotype and biochemical phenotype (represented by chitotriosidase levels) on control group.

P. americana e T. molitor são capazes de secretar β-1,3-glucanases no tubo digestivo, pelas glândulas salivares e pelo epitélio do ventrículo, respectivamente. As laminarinases majoritárias de P. americana (LIQ1, 42kDa; LAM_P, 45kDa), A. flavolineata (LAM_A, 45kDa) e T. molitor (LAM_T, 50kDa) foram purificadas até a homogeneidade. Essas enzimas têm diferentes especificidades, padrões de ação e resíduos envolvidos em catálise, fazendo parte dos E.C. 3.2.1.6 - endo-β-1,3(4)-glucanase (LIQ1), E.C. 3.2.1.39 - endo-β-1,3-glucanase (LAM_P) ou E.C. 3.2.1.58 - exo-β-1,3-glucanase (LAM_A e LAMT). O papel dessas enzimas é digerir β-glucanas de fungos e de cereais. LAM_P e LAMA são inibidas por laminarina, pela formação de complexos enzima-substrato não-produtivos. LIQ1, LAM_P e LAM_A são enzimas processivas, com diferentes graus de ataque múltiplo e produzem série distintas de oligossacarídeos. LAM_A possui um sítio acessório de ligação para laminarina, o qual pode estar envolvido no mecanismo de processividade. Quitinases digestivas de insetos podem ser diferentes das descritas até o momento. A. flavolineata e T. molitor possuem sistemas celulásicos completos. Os três insetos apresentam proteínas de baixo peso molecular capazes de ligar-se a celulose ou a pachyman. O ancestral dos hexapoda provavelmente possuía β-1,3 e β-1,3(4) glucanases digestivas associadas a um hábito detritívoro. / P. americana salivary glands and T. molitor midgut epithelium actively secrete laminarinases into the midgut. The major laminarinases from P. americana (LIQ1, 42kDa and LAM_P, 45kDa), A. flavolineata (LAM_A, 45kDa) and T molitor (LAM_T, 50kDa) were purified until homogeneity. These enzymes have different specificities, action patterns and activesite catalytic groups, and correspond to E.C.s 3.2.1.6 - endo-β-1,3(4)-glucanase (LIQ1), 3.2.1.39 - endo-β-1,3-glucanase (LAM_P) or 3.2.1.58 -exo-β-1,3-glucanase (LAM_A and LAM_T). Their physiological role is fungai and cereal β-glucan digestion. LAM_P and LAM_A are inhibited by excess substrate (non-productive enzyme-substrate complexes). LIQ1, LAM_P and LAMA have different multiple attack degrees and produce different oligosaccharides. LAM_A has a second substrate binding site, probably involved with processivity. T. molitor digestive chitinase is different from other insect chitinases. A. flavolineata and T. molitor can hydrolyse cristalline cellulose efficiently. The three studied insects have cellulose or pachyman-binding proteins with low molecular weights. Hexapoda ancestors probably had digestive β-1,3 and β-1,3(4)-glucanases and a detritivore habit.

Bactérias quitinolíticas são autóctones do ecossistema marinho e tem um importante papel no processo de degradação de quitina. Relativamente pouco é conhecido sobre a diversidade e potencial enzimático de bactérias quitinolíticas isoladas de ambientes tropicais costeiros. Amostras de água do mar e de plâncton foram coletadas no Canal de São Sebastião, Baixada Santista e Ubatuba. As bactérias quitinolíticas foram enumeradas e isoladas em meio mínimo contendo quitina coloidal e caracterizadas através de métodos fenotípicos e genotípicos. As maiores contagens de bactérias quitinolíticas foram observadas em amostras de água do mar e plâncton coletadas na Baixada Santista. A diversidade de bactérias quitinolíticas e o potencial de produção de quitinases foram influenciados pelo nível de contaminação fecal presente no ecossistema marinho. Uma maior diversidade foi encontrada em ambiente com médio e baixo impacto antropogênico, mas bactérias quitinolíticas isoladas de ambiente com alta atividade antropogênica mostraram os maiores valores de produção de quitinases. / Chitinolytic bacteria are autochthonous in marine ecosystems and have an important role in chitin degradation process. A very little is know about the diversity and enzymatic potential of chitinolytic bacteria isolated from coastal tropical environments. Seawater and plankton samples were collected at Canal de São Sebastião, Baixada Santista and Ubatuba. Chitinolytic bacteria were counted and isolated in minimal media containing colloidal chitin and characterized using phenotypic and genotypic methods. Highest counts of chitinolytic bacteria were observed in seawater and plankton samples collected at Baixada Santista. The diversity of chitinolytic bacteria and the potential of chitinases production were influenced by the level of fecal contamination present in the marine ecosystem. Highest diversity was found in environment with medium and low anthropogenic impact, but chitinolytic bacteria isolated from environment with high anthropogenic influences showed highest chitinases production.

Agricultores e técnicos envolvidos na citricultura orgânica procuram desenvolver sistemas de produção com maior atividade microbiana no solo. Dessa maneira, esperam obter benefícios dos processos que ocorrem no solo, entre eles, o controle natural de pragas e doenças. Porém, são poucos os estudos sobre a influência desse tipo de manejo sobre a microbiota do solo, em especial sobre os fungos micorrízicos arbusculares (FMAs) e o patógeno Phytophthora parasitica. Os objetivos dessa tese foram: avaliar a colonização micorrízica e conhecer a diversidade de FMAs nos sistemas de produção convencional e orgânico de citros; avaliar a aplicação de benomyl e da radiação γ na obtenção de testemunhas não micorrizadas para estudo de interação de comunidade de FMAs nativos e P. parasitica; verificar a capacidade indutora de resistência local e sistêmica dos FMAs nativos a P. parasitica; estudar atividade da quitinase no sistema radicular de limão 'Cravo' colonizado por fungos micorrízicos nativos. Foram realizadas amostragens em dois sistemas de produção de citros em São Paulo, um convencional e um orgânico. A riqueza e a diversidade de espécies de FMAs foram maiores no manejo orgânico. No entanto, a porcentagem de colonização micorrízica nas plantas no campo não variou com o tipo de manejo. Em casa de vegetação, experimentos com plantas de limão 'Cravo' (Citrus limonia) mostraram que a radiação γ foi mais adequada que a aplicação de benomyl na obtenção de testemunhas não micorrizadas para estudo de interação P. parasitica- FMAs nativos de agroecossistemas de produção de laranja. Também em casa de vegetação, foi realizado um experimento com raiz dividida de plantas de limão 'Cravo'. Não foi possível avaliar a capacidade indutora de resistência dos fungos micorrízicos arbusculares nativos porque não houve desenvolvimento da podridão de raízes nas plantas de limão 'Cravo' após a infestação com P. parasitica. Discute-se a interação de patógenos de raiz do solo natural e os FMAs nativos porque o solo natural dos sistemas de produção convencional e orgânico promoveram diferentes respostas de crescimento local e sistêmico das raízes das plantas micorrizadas. A atividade de quitinase foi igual nas raízes de plantas micorrizadas e não micorrrizadas cultivadas em solos dos sistemas de produção convencional e orgânico. Porém, a associação micorrízica aumentou localmente a proteína total nas raízes das plantas. / Farmers and technicians involved with organic citriculture try to develop systems with high microbial activity in soil. In this way, they expect to obtain benefits from processes that occur in soil, as natural control of pests and diseases. However, there are few studies about the influence of this type of management on soil microbiota, specially on the arbuscular mycorrhizal fungi (AMF) and the pathogen Phytophthora parasitica. The objectives of this thesis were: to evaluate mycorrhizal colonization and diversity of AMF in citrus conventional and organic farming; to evaluate benomyl application and γ radiation to obtain non-mycorrhizal controls for study of interaction between indigenous AMF and P. parasitica; to verify local and systemic capacity of indigenous AMF to induce resistance against P. parasitica; to study chitinase activity in roots of 'Rangpur' lime colonized by indigenous AMF. Samplings were carried out in two citrus systems in São Paulo, one conventional and one organic farming. The richness and the diversity of AMF species were higher in the organic farming. In greenhouse, experiments with 'Rangpur' lime (Citrus limonia) showed that γ radiation was better than benomyl to obtain non-mycorrhizal control for studies of interaction between P. parasitica-indigenous AMF from orange agroecosystems. In greenhouse also, a split root experiment with 'Rangpur' lime was carried out. It was not possible to evaluate the indigenous AMF capacity to induce resistance because no root rot developed in 'Rangpur' lime plants after inoculation with P. parasitica. We discuss the interaction between root pathogens in natural soil and indigenous AMF because natural soil from conventional e organic farming promoted different local and systemic root growth responses in mycorrhizal plants. Chitinase activity was similar in roots of mycorrhizal and non-mycorrhizal plants grown in conventional and organic farming soils. However, mycorhizal association increased local protein content in roots.