Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

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Les antidépresseurs de type Inhibiteur Sélectif de la Recapture de la Sérotonine (SSRI pour Selective Serotonin Reuptake Inhibitor), dont fait partie la fluoxétine (Prozac), ont été décrits comme capables de déclencher l'apoptose de cellules tumorales in vitro et in vivo, suggérant une potentielle utilisation de ces molécules pour le traitement des cancers. Cependant, leur mécanisme apoptotique n’a pas été élucidé à ce jour. Nous avons donc entrepris de déterminer les étapes de l'apoptose induite par la fluoxétine et les SSRI, en choisissant comme modèle d'étude des lignées cellulaires de lymphomes non-Hodgkiniens agressifs. Nous avons identifié plusieurs étapes de la signalisation apoptotique de la fluoxétine et des SSRI. Ainsi, via une inhibition de la chaîne respiratoire, la fluoxétine induit la production d'espèces réactives de l'oxygène conduisant à la surexpression des récepteurs de mort DR4 et DR5 ; la fluoxétine induit également l'activation de la caspase-8. DR4 et DR5 sont très probablement la cause de l'apoptose induite par la fluoxétine, de façon indépendante de leur ligand, TRAIL (TNF-Related Apoptosis-Inducing Ligand). Partant du constat que l'utilisation de TRAIL comme antitumoral pour le traitement des lymphomes présente des résultats prometteurs mais encore insuffisants, nous avons envisagé que la fluoxétine puisse augmenter l’apoptose induite par TRAIL dans ce type de tumeurs. Nous montrons en effet qu'une association de la fluoxétine avec TRAIL conduit à une augmentation de l'action apoptotique de TRAIL dans les lignées de lymphomes non-Hodgkiniens agressifs. De plus, nos résultats montrent que la fluoxétine induit la mort cellulaire d'une façon indépendante de la caspase-8. Cet effet semble trouver son origine dans une surcharge en calcium de la mitochondrie, alimentée par une stimulation maintenue de l'entrée de calcium par les canaux CRAC (Calcium Release Activated Calcium). En conclusion, les éléments de la signalisation calcique et apoptotique de la fluoxétine et des SSRI que nous avons identifiés encouragent leur utilisation en thérapie, et notamment dans le cadre d'associations avec TRAIL et d'autres molécules pour permettre une augmentation de l'apoptose des cellules tumorales, voire des cellules résistantes à l'apoptose induite par TRAIL. / Selective Serotonin Reuptake Inhibitor (SSRI) antidepressants, such as fluoxetine (Prozac), have been shown to induce apoptosis in cancer cells in vitro and in vivo, suggesting a potential use for cancer treatment. However, their apoptotic mechanism has remained undetermined until now. Therefore, we have undertaken the determination of fluoxetine- and SSRIs-induced apoptotic signalling, our study model being aggressive Non-Hodgkin's Lymphoma (NHL) cell lines. We have identified several steps of the apoptotic signalling of fluoxetine and the SSRIs. Thus, via an inhibition of the respiratory chain, fluoxetine induces a reactive oxygen species production leading to the overexpression of the death receptors DR4 and DR5; fluoxetine also induces caspase-8 activation. DR4 and DR5 are probably the cause of fluoxetine-induced apoptosis, independently of their ligand TRAIL (TNF-Related Apoptosis-Inducing Ligand). Knowing that TRAIL as an antitumoral agent for lymphoma treatment has shown promising but insufficient results, we have hypothesized that fluoxetine could increase TRAIL-induced apoptosis in these tumors. Indeed, we show that fluoxetine in association with TRAIL leads to an increase in TRAIL-induced apoptosis in aggressive NHL cell lines. Furthermore, our results show that fluoxetine induces cell death in a caspase-8–independent manner. This effect seems to originate from a mitochondrial calcium overload fueled by a sustained calcium entry from the CRAC (Calcium Release Activated Calcium) channels. In conclusion, the calcium pathway and the apoptotic steps of the fluoxetine's and the SSRIs' signalling that we have delineated encourage their use in therapy, especially in association with TRAIL and other molecules in order to enable an increase in cancer cells' apoptosis, or even in cancer cells which are resistant to TRAIL-induced apoptosis.

Le système de l’immunité innée cérébrale module le fonctionnement du cerveau et les processus comportementaux tout au long de la vie d'un individu. Parmi les différents protagonistes de ce système de l'immunité innée cérébrale, les cellules gliales jouent un rôle majeur notamment en régulant la synthèse de facteurs inflammatoires tels que les cytokines. Ces dernières, outre leur rôle dans la coordination de l'action des différents partenaires cellulaires de ce système, modifient l'activité neuronale. Lors d'un épisode inflammatoire, le système de l'immunité innée s'active et l'ensemble des signaux mis en place par les processus immunitaires est regroupé sous le terme de neuroinflammation. Plus particulièrement, les cytokines proinflammatoires et l’ATP libérés dans ce cadre ont été décrits comme étant capables de moduler la plasticité synaptique d'une part et les capacités d’apprentissages et de mémorisation d'autre part. Cependant, la compréhension de l’impact d’un épisode inflammatoire sur le système nerveux central et les capacités d’apprentissage n’est pas totale. Une cible potentielle de ces facteurs est le système de neurotransmission glutamatergique. En effet, les facteurs proinflammatoires peuvent augmenter ou diminuer l’expression ou l’activité de certaines sous-unités des récepteurs glutamatergiques. Mon objectif a été de déterminer dans quelle mesure la transmission glutamatergique est altérée en condition neuroinflammatoire et comment cela pouvait induire des altérations des capacités d’apprentissage chez le rongeur. Pour cela nous avons choisi comme tâche comportementale l’aversion gustative conditionnée, dont les mécanismes moléculaires nécessaire à sa mise en place sont connus et reposent sur la transmission glutamatergique dans une structure corticale particulière chez les rongeurs: le cortex insulaire. Notre étude visait à déterminer les mécanismes cellulaires et moléculaires par lesquels une inflammation localisée à ce cortex peut induire des modifications comportementales et biochimiques. Nous avons pu montrer que l’infusion de lipopolysaccharide, un puissant agent inflammatoire, dans le cortex insulaire induisait une augmentation de l'aversion conditionnée. Ceci était corrélé à une augmentation d’expression des récepteurs AMPA au glutamate dans cette structure, plus particulièrement dans le compartiment synaptique. Nous avons également pu montrer que l’infusion de LPS dans le cortex insulaire induisait la synthèse et la libération de cytokines proinflammatoires localement, sans stimuler le système de l’immunité périphérique. Même si ces cytokines sont connues comme étant des agents modulateurs de la neurotransmission glutamatergique, leur infusion dans le cortex insulaire n’a pas reproduit dans notre cas les effets de l’infusion du LPS. Par contre, nous avons montré que l’ATP était impliqué dans les effets du LPS sur l’apprentissage aversif, puisque le blocage des récepteurs purinergiques dans le cortex insulaire a permis de reverser les effets du LPS sur l’acquisition de l’aversion gustative. En conclusion, nos résultats suggèrent qu'une inflammation localisée dans le cortex insulaire conduit à la libération et à l'action d’ATP sur les cellules gliales et/ou neuronales, aboutissant à une hausse de l’acquisition de l’aversion gustative conditionnée. / The cerebral innate immune system is activated under pathophysiological conditions and can consequently modulate brain functioning and cognitive processes. This modulation is exerted by signals produced by immune-like processes grouped under the term of neuroinflammation and involving neuro-glial communication within the brain. In particular, proinflammatory cytokines and ATP, all produced during this immune system activation have been directly linked to modulation of synaptic plasticity and/or learning and memory functions in animals models. However, the cellular mechanisms by which neuroinflammation modulates neural plasticity and cognitive processes are still unclear. One candidate is the glutamatergic system. Indeed, pro-inflammatory factors can increase or decrease glutamatergic receptors expression and/or activity. Our study was dedicated at deciphering to what extent glutamatergic transmission is altered under neuroinflammation and how this may lead to learning and memory alteration. To this aim, we used the conditioned taste aversion, a task highly dependent on glutamatergic transmission into the insular cortex. Indeed, blockade of NMDA or AMPA receptors in this cortical area before acquisition greatly impairs conditioned taste aversion. The aim of our study was thus to investigate the behavioral and cellular impact of an inflammation restricted to the insular cortex on glutamatergic receptors expression and CTA memory formation. Here we show that a cortical inflammation, induced by LPS infusion into the insular cortex, prior to CTA acquisition enhances the aversion strength presumably through LPS-induced increase of glutamatergic AMPA, but not NMDA, receptor expression/trafficking at the insular synapses. Moreover, we show that ATP release, but not pro-inflammatory cytokines, is responsible for LPS-induced CTA enhancement. In conclusion we propose that inflammation restricted to the insular cortex enhances CTA acquisition through an ATP-dependent mechanism presumably involving an increase of glutamatergic AMPA receptor expression at the neuronal synapses.

L’action physiologique des glucocorticoïdes (GC) est de mobiliser certaines ressources de l’organisme pour s’adapter à des changements d’origine endogène ou exogène susceptibles de perturber l’homéostasie de l’organisme. Des facteurs métaboliques/nutritionnels modifient l’intensité d’action des GC. Ils agissent au niveau i) de l’activation de l’axe corticotrope, ii) de leur biodisponibilité des GC (régulation « pré-récepteur »), iii) de l’activation transcriptionnelle des récepteurs des GC (régulation « post-récepteur »). L’objectif général de ce travail repose sur l’exploration du rôle de certains facteurs métaboliques/nutritionnels dans la modulation pré- et post-récepteur de l’action des GC sur l’organisme. Dans une approche clinique, notre attention s’est tout d’abord focalisée sur le rôle de l’équilibre diabétique et/ou l’état inflammatoire des patients atteints de diabète de type I et le métabolisme pré-récepteur du cortisol. Par l’étude en spectrométrie de masse des métabolites du cortisol, nous montrons une augmentation significative de l’activité de la hydroxystéroïde-déshydrogenase 1, principale enzyme de régénération intracellulaire du cortisol. Cette augmentation est corrélée à des marqueurs de l’inflammation chez les enfants diabétiques. Ces résultats suggèrent un lien entre le diabète et l’existence d’une inflammation à bas bruit et l’augmentation de l’exposition cellulaire aux GC. Dans une approche expérimentale, nous nous sommes ensuite intéressés à l’action de l’acide rétinoïque all trans (atAR), métabolite actif de la vitamine A, sur l’activité transcriptionnelle des GC. Nous avons choisi un modèle in vitro de cellules hippocampiques en raison d’effets contrastés de l’atAR et des GC sur les fonctions mnésiques in vivo. Nous observons une interaction entre les voies de signalisation transcriptionnelle de l’atAR et des GC sur leurs propres récepteurs et sur des protéines de la plasticité synaptique. Par ailleurs, l’atAR est responsable de modifications de la phosphorylation du récepteur aux GC altérant ainsi ses fonctions transcriptionnelles. Enfin atAR et GC modifient différemment l’organisation du cytosquelette d’actine sans modification transcriptionnelle ou traductionnelle. La compréhension du rôle de certains facteurs environnementaux dans la signalisation des GC pourrait permettre de réduire certains des effets délétères du stress. L’utilisation de certains nutriments, vitamine A par exemple, pourrait atténuer certaines conséquences d’un tonus glucocorticoïde excessivement prolongé. / Rôles to mobilize body resources and to adapt to endogenous or exogenous changes that might disrupt the homeostasis of the body. Nutritional & metabolic factors may modify the intensity of GC action in: i) the activation of the corticotrope axis and their secretion by the adrenals, ii) their bioavailability ("pre-receptor" regulation), iii) the transcriptional activation of their receptors ("post-receptor" regulation). The main target of this work is to explore the role of some metabolic/nutritional endogenous or exogenous factors in modulating pre- and post-receptor action of GC. Our attention first focused on the role of diabetes and the related inflammation in patients with type I diabetes, and pre-receptor metabolism of cortisol. We showed that a significant increase in the activity of hydroxysteroid dehydrogenase 1, the main enzyme of intracellular cortisol regeneration, is correlated with markers of inflammation in diabetic children. This suggests a link between diabetes and the low-level chronic inflammation and increased cellular exposure to GC . Then, we focused on the action of all-trans retinoic acid (atRA), the active metabolite of vitamin A on the transcriptional activity of GC. We used an in vitro model of hippocampal cells as GC and atRA have contrasted effects on mnesic processes in vivo. We observed a transcriptional interaction between the GC and retinoic pathways targeting their receptors and genes involved in neuronal plasticity. atRA also affects the phosphorylation of the GC receptor and modifies its transcriptional activity. Lastly, both atRA and GC affect cellular organisation of actin cytoskeleton. The knowledge acquired by studying the action of nutritional molecules on GC action could be used to easily reduce the deleterious effects of GC in chronic stress. Clinical studies have started in this direction.

Les récepteurs ionotropiques AMPA (AMPAR) activés par le glutamate sont les principaux acteurs de la transmission synaptique excitatrice rapide du cerveau. Ils jouent également un rôle crucial dans les processus de plasticité synaptique, reconnus pour être à la base des fonctions cognitives. Les récepteurs canaux P2X sont activés par l'adénosine-5'-triphosphate (ATP) extracellulaire libéré par les neurones ou les cellules gliales. Ils sont exprimés dans le cerveau en périphérie des synapses glutamatergiques, où ils participent à l’excitabilité neuronale et modulent la transmission synaptique ainsi que la plasticité synaptique. Bien que la signalisation purinergique ait de multiples effets sur la transmission et la plasticité synaptique, la fonction des récepteurs P2X au niveau des synapses du cerveau reste à établir. Ici, nous montrons dans les neurones d'hippocampe en culture que l'activation des récepteurs P2X postsynaptiques par l'ATP exogène ou via la libération d'ATP endogène par les cellules gliales diminue l'amplitude des courants miniatures et évoqués des AMPAR postsynaptiques. En utilisant des approches d’électrophysiologie, de biochimie et d'imagerie en temps réel, nous démontrons que l'afflux de calcium passant par les canaux P2X déclenche l’internalisation des AMPAR par un mécanisme d’endocytose clathrine et dynamine dépendante. Cette diminution de surface altère par conséquent la transmission synaptique médiée par les AMPAR. Nous avons aussi démontré par des approches moléculaires et pharmacologiques la cascade de signalisation engagée dans l’altération du trafic des AMPAR de surface après activation des récepteurs P2X. Cette inhibition par les récepteurs P2X, serait dépendante de l’activation de kinases et des phosphatases qui régulent le niveau de phosphorylation des AMPAR. Nos travaux de recherche suggèrent ainsi, que les récepteurs postsynaptiques P2X jouent un rôle essentiel dans la régulation de l'expression de surface des AMPAR et régulent ainsi la force et la plasticité synaptique. / Ionotropic AMPA receptors (AMPAR) activated by glutamate are the main actors of the fast excitatory synaptic transmission in the brain. They also play a crucial role in the process of synaptic plasticity that are widely recognized to be the basis cognitive functions. P2X receptors are ATP-gated cation channels widely expressed in the brain where they mediate action of extracellular adenosine-5’-triphosphate (ATP) released by neurons or glia. P2X receptors are located et the periphery of glutamatergic synapses and although purinergic signaling has multiple effects on synaptic transmission and plasticity, the function of P2X receptors at brain synapses remains to be established.Here, we show in cultured hippocampal neurons that activation of postsynaptic P2X receptors by exogenous ATP or glial release of endogenous ATP decreases the amplitude of miniature excitatory postsynaptic currents and AMPA-evoked currents. Using a combination of electrophysiology, surface or internalization assays and real time imaging, we demonstrate that the calcium influx through the ATP-gated channels triggers AMPA receptor internalization through clathrin-mediated dynamin-dependent endocytosis leading to reduced surface AMPA receptors and therefore, altered AMPA-mediated current. We also identified by molecular and pharmacological approaches the signaling cascade involved in the P2X-mediated alteration of surface AMPAR trafficking. P2X-mediated AMPAR internalization is dependent on the activation of kinases CamKII and phosphatases which regulate the phosphorylation level of AMPARs. Our finding indicates that postsynaptic P2X receptors play a critical role in regulating the surface expression of AMPAR and thereby regulate the synaptic strength.