Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Les récepteurs couplés aux protéines G (RCPGs) constituent la plus grande famille de récepteurs membranaires et sont impliqués dans le contrôle de la majorité des processus physiologiques. Dans le modèle classique, la signalisation par les RCPGs se résumait à l'activation de protéines G hétérotrimériques capables de moduler l'activité d'effecteurs, qui, à leur tour, contrôlent la concentration intracellulaire de seconds messagers tels que l'AMPc ou le calcium. Cette vision classique de la signalisation s'est par contre complexifiée au fil des années et l'on sait maintenant que les RCPGs interagissent avec une multitude d'autres protéines afin de transmettre de façon spécifique les signaux extracellulaires. Ainsi, pour bien comprendre comment est régulé un RCPG, il devient primordial de connaître les protéines interagissant avec celui-ci. Nous avons donc entrepris d'identifier de nouveaux partenaires d'interaction pour les récepteurs DP (récepteur de la prostaglandine D[indice inférieur 2]), TP[bêta] (récepteur du thromboxane A[indice inférieur 2]) et [bêta][indice inférieur 2]-adrénergique, puis, de déterminer le rôle de ces complexes protéiques dans la fonction des récepteurs. Lors d'un criblage par double-hybride visant à identifier de nouveaux partenaires d'interaction pour DP, nous avons identifié la protéine ankyrin repeat domain-containing protein 13C (ANKRD13C), une protéine n'ayant pas encore été caractérisée jusqu'à maintenant. Des études de localisation ont montré qu'ANKRD13C est associée à la membrane du réticulum endoplasmique (RE), où elle interagit avec DP. Cette interaction facilite d'abord la biogenèse du récepteur en ralentissant la dégradation des récepteurs nouvellement synthétisés. Elle régule aussi le transport de DP vers la membrane plasmique en induisant la rétention dans le RE des formes immatures du récepteur. Elle facilite finalement la dégradation par le protéasome des formes de récepteurs retenues dans le RE. Ces expériences suggèrent donc un rôle de chaperonne pour ANKRD13C dans la biogenèse du récepteur DP. La protéine adaptatrice RACK1 (Receptor for Activated C-Kinase 1) a ensuite été identifiée comme nouveau partenaire d'interaction pour l'isoforme [bêta] du récepteur du thromboxane A[indice inférieur 2] (TP[bêta]).Les résultats présentés dans cette étude montrent que les deux protéines interagissent directement et qu'elles forment un complexe au niveau du RE. L'interaction entre TP[bêta] et RACK1 s'est d'ailleurs avérée essentielle pour que le récepteur puisse être exporté du RE vers la membrane plasmique. Ces travaux ont donc révélé un rôle majeur de RACK1 dans la fonction de TP[bêta], plus précisément au niveau de son transport vers la surface cellulaire. Finalement, une nouvelle interaction entre le récepteur [bêta][indice inférieur 2]-adrénergique ([bêta][indice inférieur2]-AR) et la petite protéine G Rab11 a été caractérisée.Les expériences réalisées démontrent que les deux protéines s'associent en cellules via une interaction directe. Une construction du [bêta][indice inférieur 2]-AR où les sites d'interaction avec Rab11 sont mutés a été générée. La mise en évidence d'un défaut de recyclage de ce mutant suite à une stimulation avec un agoniste spécifique a permis d'établir que l'interaction directe avec Rab11 est essentielle pour que le [bêta][indice inférieur 2]-AR puisse recycler de façon adéquate.Les résultats présentés dans cette thèse illustrent le rôle joué par trois nouveaux complexes protéiques dans la synthèse, l'export et le recyclage de RCPGs. L'identification et la caractérisation de ces nouvelles interactions permettra de mieux comprendre comment sont régulés les récepteurs DP, TP[bêta] et [bêta][indice inférieur 2]-adrénergique, et permettra éventuellement d'améliorer les connaissances quant à la régulation de l'ensemble des récepteurs couplés aux protéines G.

Les récepteurs couplés aux protéines G (GPCR) constituent la plus grande famille de protéines localisées à la membrane plasmique. Toutefois, les mécanismes moléculaires régissant leur liaison avec leurs ligands et la transduction du signal qui s’ensuit sont encore mal compris. Nous avons donc cherché à mieux comprendre le mécanisme de liaison d’un ligand avec son récepteur, et ainsi caractériser le premier événement de la cascade pharmacologique déclenché par ces GPCR. Nous nous sommes intéressés au récepteur de l’urotensine-II (UT), car celui-ci fait partie de la catégorie des récepteurs peptidergiques qui demeure encore à ce jour peu comprise au niveau de leur structure et de leur mode de liaison. D’un point de vue physiologique, ce récepteur joue notamment un rôle important au niveau cardiovasculaire ainsi que dans certaines pathologies comme l’hypertension ou le diabète. Nous avons donc cherché à identifier l’ensemble des résidus participant à la pochette de liaison du récepteur UT en appliquant la méthode SCAM (Substituted Cysteine Accessibility Method) et en procédant à la substitution individuelle des résidus des TM1, TM2, TM3, TM4 et TM5 avec une cystéine. Par la suite, les paramètres pharmacologiques de ces mutants ont été mesurés à l’aide d’études de radioliaison avec le ligand [[indice supérieur 125]I]UII. Suite au traitement avec de l’hydrobromure de 2-aminoethyl-méthanethiosulfonate (MTSEA), nous avons ainsi pu mettre en évidence que les mutants I54C[indice supérieur (1.35)] du TM1, Y100C[indice supérieur (2.53)], S103C[indice supérieur (2.56)], F106C[indice supérieur (2.59)], I107C[indice supérieur (2.60)], T110C[indice supérieur (2.63)] et Y111C[indice supérieur (2.64)] du TM2, L126C[indice supérieur (3.28)], F127C[indice supérieur (3.29)], F131C[indice supérieur (3.33)] et M134C[indice supérieur (3.36)] du TM3 et M184C[indice supérieur (4.60)] et I188C[indice supérieur (4.64)] du TM4, n’étaient plus capables de lier [indice supérieur 125]I-UII, démontrant ainsi une orientation de ces positions face à la pochette de liaison du récepteur UT. L’ensemble de ces travaux nous ont permis d’acquérir une meilleure compréhension des déterminants moléculaires de la liaison menant à l’activation du récepteur UT. En associant ces résultats avec nos travaux précédents, nous sommes en mesure de présenter un modèle moléculaire complet de la pochette de liaison du récepteur UT de rat en complexe avec le ligand UII. Cette étude permet ainsi d’offrir une meilleure compréhension du processus de liaison et d’activation des GPCR peptidergiques de la classe A. En absence de structure cristalline du récepteur UT, ce modèle constitue un outil pharmacologique de choix qui pourra servir notamment à la conception rationnelle de nouveaux ligands thérapeutiques ciblant le système urotensinergique.

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

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Le récepteur des oestrogènes (RE) peut moduler l’expression de gènes impliqués dans les processus de prolifération et d’apoptose cellulaires. Cette régulation est possible par le recrutement de complexes corégulateurs. Dans ces complexes, l’activité répressive s’explique essentiellement par la présence d’histones désacétylases (HDAC). Cette famille de protéines est composée de 18 membres classés en 4 groupes. Cette répartition est due aux similarités structurales et de fonctions de ces enzymes. Il y a la classe I (HDAC 1, -2, -3, -8), la classe II (HDAC 4, -5, -6, -7, -9, -10) et la classe IV (HDAC 11) qui ont une activité Zn2+ dépendante alors que la classe III (Sirt1-7) recense les HDAC avec une activité NAD+ dépendante. Des résultats récents du laboratoire ont montré, qu’au niveau ARNm, il y avait un important différentiel d’expression de HDAC9 entre les lignées cellulaires de cancer du sein RE positive et négative ou résistante au tamoxifène. Durant ma thèse, j’ai démontré que la régulation de HDAC9, au niveau de son expression, comme au niveau de ses fonctions, affecte la signalisation oestrogénique en modulant l’expression et l’activité transcriptionnelle de REα. De plus, de nombreuses études ont montré l’activité antiangiogénique d’inhibiteurs de HDAC (HDI) à large spectre comme la TSA (Tricostatin A). La conception et l’identification de HDI, potentiellement sélectifs, comme agents anti-tumoraux et/ou anti-métastatique représente une nouvelle approche de thérapie seule ou combinée avec les produits déjà utilisés dans le traitement du cancer. Ainsi, afin d’identifier et caractériser de nouveaux HDI, j’ai établi un outil bioluminescent pour la détection d’inhibiteurs sélectifs de HDAC. Plusieurs lignées cellulaires Gal4-VP16-HDAC ont été générées dans ce but / The estrogen receptor (ER) can modulate the gene expression with consequences in the cell proliferation, apoptosis. This modulation is possible by the recruitment of coactivator or corepressor complexes. The repression activity is in particular explained by the histones deacetylases (HDACs). This protein family is composed by eighteen members who have been classified in four groups. These HDACs are subdivided on structural and functional similarities. The class I isoforms (HDACs 1, 2, 3 and 8), class II (HDACs 4, 5, 6, 7, 9, 10) and class IV (HDAC11) are Zn-dependent enzymes, whereas class III HDACs (Sirtuins 1-7) are NAD+-dependent. Recent data from the laboratory have shown, at the mRNA level, there is an enormous expression differential of HDAC9 between breast cancer cell line ER positive and negative or OHT resistant cell line. During my thesis, I demonstrated that the regulations of the HDAC9 on the level of its expression as of its role in the various breast cancer cell lines were implicated in the estrogen signaling. This regulation takes place at the transcriptional level and in the ERet#945; activity.In addition, using broad spectrum HDAC inhibitors (HDIs) such as TSA (Tricostatin A), many studies have shown that these inhibitors had antiangiogenic activity. Thus, the design or the identification of selective and potent HDAC inhibitors as agents anti-tumoral and/or anti-metastatic can emerge in a novel opportunity used alone or in combination with the already existing agents for the treatment of cancers. In order to identify and characterize new HDIs, my thesis works consisted to establish bioluminescent cell lines for screening HDAC inhibitors. Different cell GAL4-VP16-HDACs chimeras' models were generated to determine the selectivity of HDIs for the different HDACs.

Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Thèse numérisée par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal.

Mémoire numérisé par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal.

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