Les bactéries intracellulaires Wolbachia ont développé une vaste gamme d’interactions symbiotiques, du parasitisme reproductif au mutualisme chez les arthropodes terrestres et les nématodes filaires, devenant ainsi les endosymbiotes les plus répandus sur terre. Bien qu’elles se développent lentement dans les cultures cellulaires d’insectes pour lesquelles les marqueurs sont limités et qu’elles ne sont génétiquement pas manipulables, il existe un intéret croissant de déchiffrer leur mode de vie intracellulaire pour 2 raisons. Premièrement, Wolbachia intervient dans le développement et la transmission des arbovirus et deuxièmement, les filarioses lymphatiques sont traitables grâce à la susceptibilité des Wolbachia qui infectent les nématodes filaires aux antibiotiques. Au début de ce projet, j’ai infecté 2 lignées cellulaires de Drosophila melanogaster qui sont transcriptomiquement divergentes par une même souche de Wolbachia pouvant naturellement infecter Drosophila melanogaster. J’ai utilisé ces 2 lignées cellulaires qui sont différentiellement permissive à l’infection pour explorer l’interaction de Wolbachia avec le réticulum endoplasmique. Les observations par microscopie à fluorescence en temps réel et par microscopie électronique prouvent que cet organite est une source de membranes pour Wolbachia et possiblement, une source de nutriments. Pourtant, les analyses d’expression génique et les approches d’immunofluorescence démontrent que Wolbachia n’induit ni un stress au niveau du réticulum endoplasmique ni une protéolyse via la voie de signalisation ERAD suggérant dès lors, que Wolbachia subvertissent d’autres mécanismes pour assurer leur besoin en acides aminés. Au cours de ce projet, j’ai commencé à mettre en place une technique pour transformer Wolbachia par biolistique. La validation de cette technique de transformation a ouvert la voie vers l’optimisation de la procédure de sélection des transformants pour enfin pouvoir génétiquement manipuler Wolbachia. / The intracellular bacteria Wolbachia have developed a wide range of symbiotic interactions, from being opportunistic reproductive parasites to mutualists with terrestrial arthropods and filarial nematode species, making them the most common endosymbionts on earth. The discovery that they interfere with arboviruses development and transmission by mosquito vectors and that filarial diseases can be cured by targeting Wolbachia, have created a strong interest in deciphering the mechanisms underlying their intracellular lifestyle. However, being obligate intracellular endosymbionts, Wolbachia remain genetically intractable. They grow slowly in insect cell cultures, for which markers are limited. Despite these obstacles, and to limit cell line-specific phenotypes, I chose to infect 2 Drosophila melanogaster cell lines presenting different sets of expressed genes, with a unique Wolbachia strain, naturally hosted by Drosophila melanogaster. Using these 2 cell lines that are differently permissive to the infection, I explored the interaction of Wolbachia with the endoplasmic reticulum (ER). Through fluorescence time-lapse confocal and electron microscopy observations, I provide strong evidence that this organelle is the source of membrane for Wolbachia, and possibly a source of nutrients. However, gene expression analyses and immunofluorescence approaches demonstrate that Wolbachia do not induce ER stress nor an increased ERAD- induced proteolysis, suggesting; unlike previously reported, that Wolbachia salvage amino acids by other subversion mechanisms. Additionally, I pioneered biolistic bombardement of Wolbachia-infected cells and the validation of this transformation technique has paved the way towards optimization of transformant selection steps and ultimately to the genetic engineering of Wolbachia.

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Le facteur de transcription Androgen Induced-bZIP (AlbZIP) est un membre de la famille ATF/CREB, plus précisément de la sous-famille CREB3. Sa découverte remonte au début des années 2000 où sa régulation par les androgènes fut démontrée, de même que son expression abondante dans le tissu prostatique. À l'image des facteurs ATF/CREB, AlbZIP possède un domaine d'activation de la transcription en N-terminal, un domaine bZIP et un domaine transmembranaire lui permettant de s'ancrer dans la membrane du reticulum endoplasmique. La structure et la localisation d'AIbZIP suggèrent qu'il puisse être clivé par le mécanisme Regulated Intramembrane Proteolysis (RIP) un mécanisme de clivage auquel sont soumis des facteurs ATF/CREB tels qu'ATF6. Ce clivage survient suite à un stress du reticulum endoplasmique (RE) qui peut être causé par différents stimuli qui perturbent l'homéostasie du RE. Les travaux présentés dans cette thèse visent l'identification de la fonction d'AIbZIP dans le stress du reticulum endoplasmique des cellules prostatiques cancéreuses. Mes objectifs étaient de découvrir des stimuli capables d'induire son clivage et d'identifier et de caractériser ses cibles transcriptionnelles suite à sa translocation au noyau. J'ai d'abord modifié le système d'expression inductible RheoSwitch et j'ai caractérisé son effet sur les cellules prostatiques cancéreuses LNCaP. Ce système s'est avéré être un outil efficace puisqu'il n'affecte pas le phénotype des LNCaP et il a été essentiel à la réalisation des travaux sur AlbZIP. J'ai ensuite mis en évidence le clivage d'AIbZIP par des agents qui causent une diminution de la concentration calcique au RE. Le système RheoSwitch modifié a permis de produire des cellules exprimant une forme active recombinante d'AIbZIP qui ont servi à la réalisation de micropuces Affymetrix. Ces puces ont permis l'identification des gènes cibles d'AIbZIP tel que le facteur de transcription CREB3. AlbZIP active l'expression de CREB3 par le biais d'éléments de réponse similiares à ERSE et CRE situés dans le promoteur du gène. Lors du traitement des cellules LNCaP avec l'ionophore de calcium A23187, on observe successivement le clivage d'AIbZIP, l'induction de l'expression de CREB3 et son clivage, ce qui suggère une chronologie dans l'activation des deux facteurs. La réponse au stress débute donc avec la forme active d'AIbZIP, suivie d'une co-existence des formes nucléaires d'AIbZIP et CREB3 pour se terminer par la présence de CREB3. CREB3 est en mesure d'activer sa propre transcription. Le stress causé par A23187 est en mesure d'activer AlbZIP et CREB3 qui se trouvent alors seuls ou simultanément au noyau. Il est donc possible qu'ils partagent des cibles communes, tout en ayant leurs cibles uniques, ce qui devra être élucidé pour clarifier leurs rôles respectifs dans la réponse au stress des LNCaP.

La sclérose latérale amyotrophique (SLA) est une maladie neurodégénérative incurable. Environ 10% des cas de SLA sont familiaux (SLAF) et 90% sont sporadiques (SLAS). À l'heure actuelle, des mutations dans les gènes SOD1 et TARDBP demeurent parmi les principales causes de SLAF. Plusieurs évidences tendent à attribuer aux facteurs environnementaux une place de plus en plus importante dans l'identification de causes probables de la SLAS. Cependant, notre compréhension des mécanismes menant à des anomalies dans ces gènes ou à l’exposition à divers facteurs environnementaux et à la mort des neurones moteurs reste limitée. À ce jour, aucun traitement efficace n’a encore été décrit pour la SLA. C’est pourquoi le développement d’une immunothérapie avec des anticorps anti-SOD1 mal repliée spécifiques nous permettra de mieux comprendre les mécanismes et les causes environnementales susceptibles d’être impliqués dans la SLAS. Ceci ouvrira de nouvelles perspectives diagnostiques et thérapeutiques pour le traitement de cette maladie encore incurable. / Amyotrophic lateral sclerosis (ALS) is a fatal neurodegenerative disease. About 10% of cases are familial (FALS) and 90% are sporadic (SALS). Currently, mutations in SOD1 and TARDBP genes are among the main causes of FALS. Many evidences suggest that environmental factors can be an important element in the identification of probable SALS causes. However, our comprehension of mechanisms leading to mutations in these genes or exposure to different environmental factors, to the death of motor neurons is still limited. Currently, there is not efficient cure for ALS. The development of an immunotherapy with specific anti-misfolded SOD1 antibodies will therefore help us to understand the mechanisms and environmental factors that may be involved. This can lead to new perspectives for early diagnosis and prognosis, and new therapeutic approaches for this yet incurable disease.

Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

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