Le récepteur hypophysaire de la GnRH (RGnRH) joue un rôle crucial dans le contrôle de la fonctionde reproduction. Dans le promoteur distal du Rgnrh, j'ai caractérisé un élément de réponsebifonctionnel répondant aux protéines LIM à homéodomaine ISL1/LHX3 et à GATA2. D'autre part,deux motifs TAAT situés dans la région plus proximale confèrent à ce gène la capacité de répondreaux facteurs Paired-like PROP1 et OTX2. Tous ces facteurs, exprimés précocement au cours del'ontogenèse hypophysaire, pourraient participer à l'émergence de l'expression du Rgnrh. Hors del'hypophyse, j'ai découvert que le Rgnrh est exprimé au cours du développement postnatal dansl'hippocampe de rat, où il module la plasticité synaptique. Par ailleurs, j'ai identifié deux nouveauxsites d'expression, la rétine et la glande pinéale. Ces résultats mettent en lumière l'importancefonctionnelle de ce récepteur et de son ligand et les rôles multiples qu'il ont acquis au cours del'évolution des Vertébrés.

Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Les neuropathies optiques héréditaires se caractérisent par une dégénérescence des cellules ganglionnaires de la rétine entraînant une perte visuelle modérée voire la cécité. L'atrophie optique dominante (AOD) ou maladie de Kjer et la neuropathie optique de Leber (NOHL), sont les deux formes les plus fréquentes. Il existe quatre loci d'AOD mais seulement deux gènes identifiés : OPA1 et OPA3 codant des protéines mitochondriales. La NOHL est due à des mutations de l'ADN mitochondrial (ADNmt). Aucun traitement n'existe pour soigner ces pathologies ou ralentir leur progression. Nous nous sommes intéressés au gène YWHAH, situé au locus OPA5, codant la protéine 14-3-3eta, un des gènes majoritairement exprimés dans les GCRs. Le criblage de YWHAH dans des banques d'ADNs de patients exempts de mutation dans OPA1, OPA3 et l'ADNmt a permis d'identifier deux mutations hétérozygotes chez des patients présentant une AOD et une surdité profonde.14-3-3eta joue un rôle de protection dans l'apoptose. En effet, les fibroblastes de patients et des cellules surexprimant une 14-3-3eta mutée s'avèrent moins résistants à un stress apoptotique. Pour évaluer l'effet des mutations de 14-3-3eta sur la fonction visuelle et auditive nous avons généré une souris reproduisant une mutation humaine. Les souris 14-3-3eta hétéro et homozygotes ont une atteinte auditive de 15 à 20 décibels dès 2 mois, et seules les souris homozygotes présentent une altération de la fonction visuelle à partir de 12 mois affectant les interneurones et les photorécepteurs de la rétine. La souris mutante présente un phénotype moins grave que chez l'homme, mais son étude permet d'impliquer 14-3-3eta dans des atteintes neurosensorielles / Inherited Optic Neuropathies (ION) are characterized by the degeneration of the Retinal Ganglion Cells (RGCs), leading to moderate visual loss or legal blindness. Dominant Optic Atrophy or Kjer disease (DOA) and Leber Hereditary Optic Neuropathy (LHON) are the most common forms of IONs. There are four loci for DOA, but only two genes have been identified: OPA1 and OPA3 encoding mitochondrial proteins. LHON is caused by mitochondrial DNA (mtDNA) mutations. There is no treatment to cure these diseases or slow down their progression. In order to identify new genes responsible for DOA, our team was interested in the YWHAH gene localized at the OPA5 locus, coding the 14-3-3eta protein, a gene strongly expressed in RGCs. The screening of YWHAH in DNAs without mutation in OPA1, OPA3 and mtDNA allowed us to identify two heterozygous mutations in patients presenting a DOA associated to a severe deafness.As 14-3-3eta plays a role in apoptosis, we studied patient fibroblasts and found that they present a marked susceptibility to apoptosis. Moreover, the mutated alleles of 14-3-3eta lost their ability to confer resistance to cell death. In order to evaluate the effects of the 14-3-3eta mutations on the visual and auditory functions, we have generated an animal model mimicking a human mutation. The 14-3-3eta hetero and homozygous mice present a stable auditory impairment of 15 to 20 decibels, whereas only the homozygous mice present an alteration of the visual function at 12 months, with affected interneurones and photoreceptors. Even if the mutant mouse does not present a phenotype as dramatic as in human, its study shed light on 14-3-3eta involvement in neuronsensorial functions

La division cellulaire asymétrique est un des processus clefs pour générer la diversité cellulaire au cours du développement. La régulation de l’orientation du fuseau mitotique est essentielle pour la production de divisions asymétriques. Elle détermine l’héritage asymétrique des déterminants cellulaires entre les cellules filles. Les mécanismes qui contrôlent l’orientation du fuseau mitotique sont bien caractérisés chez le nématode C. elegans et la mouche Drosophile. Ces modèles ont permis d'identifier les protéines clefs impliquées dans ce processus et conservées chez les mammifères, comme celles du complexe d’orientation du fuseau mitotique : Gαi-LGN-NuMA, et celles du complexe de polarité apicale : PAR3-PAR6-aPKC. Chez les vertébrés, la localisation cortico-latérale de LGN-NuMA dans les progéniteurs neuraux en division est déterminante pour l'orientation planaire du fuseau mitotique, mais son mécanisme de régulation reste inconnu. Nous utilisons la rétine de souris en développement comme modèle expérimental pour sa simplicité et son accessibilité. Des résultats antérieurs de notre laboratoire ont démontré que l'asymétrie de la division dépend de l’orientation du fuseau mitotique, et que cette orientation change au cours au développement. Les rares divisions verticales apparaissent surtout aux stades tardifs de la rétinogenèse. Le but de cette thèse est d'élucider les mécanismes régulateurs du changement d'orientation au cours de la rétinogenèse, et de déterminer le rôle des divisions asymétriques dans les phases prolifératives et neurogéniques du développement de la rétine. Avec nos collaborateurs, le laboratoire du Dr Stéphane Angers, nous avons identifié SAPCD2 (suppressor APC domain containing 2), comme un nouvel interacteur des protéines Gαi, LGN et PAR3. Le rôle du gène Sapcd2 est peu décrit jusqu'à ce jour. Son expression protéique varie au cours du cycle cellulaire, avec un pic d'expression en mitose, et sa surexpression est observée dans plusieurs cas de cancers. Dans un premier temps, nous avons analysé l'expression de Sapcd2 et Lgn dans la rétine de souris en développement. Leur expression varie selon les phases de la mitose et du stade développemental. À P0, soit le premier jour postnatal, SAPCD2 et LGN ont une localisation cellulaire complémentaire dans les progéniteurs en division, avec un enrichissement à la membrane apicale et au cortex cellulaire latéral respectivement, dans des proportions corrélées au nombre de divisions planaires. Tandis qu'au jour embryonnaire 14.5 (E14.5), SAPCD2 et LGN sont toutes deux localisées aux pôles du fuseau mitotique, suggérant des rôles dynamiques au cours du développement rétinien. Nous avons ensuite analysé l’orientation du fuseau mitotique à E14.5 et P0, dans des souris en absence de Sapcd2 et/ou Lgn. En parallèle de l'étude de la souris mutante Sapcd2, j'ai participé à l'étude de la souris mutante Lgn à P0, menée par Dre Marine Lacomme, post-doctorante au laboratoire. En absence de Lgn à P0, les divisions horizontales augmentent, à l'inverse de l'absence de Sapcd2, où les divisions verticales augmentent. Pour savoir si ces changements d’orientation affectent le destin cellulaire, nous avons réalisé une analyse clonale des divisions terminales dans des explants rétiniens. Cette approche permet de suivre l'effet d'une délétion clonale d'un gène dans le lignage d’un seul progéniteur. Comme attendu, l'ablation clonale de Sapcd2 augmente les divisions asymétriques terminales, produisant deux cellules postmitotiques différentes, et inversement sans Lgn. En termes de mécanisme, SAPCD2 compétitionne avec NuMA pour se lier à LGN, dont elle régule négativement la localisation au cortex de la cellule. Le phénotype rétinien des souris doubles mutantes Lgn;Sapcd2 est sévère, avec une quasi-exclusivité de divisions verticales, une augmentation de la prolifération globale, du nombre de cellules mitotiques non apicales, et une drastique expansion de la population neuronale avec une couche cellulaire supplémentaire, composée de presque tous les types cellulaires rétiniens. Cette hyperprolifération pourrait être due à l'augmentation des divisions verticales, engendrant une asymétrie de l'héritage du déterminant cellulaire NUMB, antagoniste de Notch. Nous faisons l'hypothèse que le progéniteur basal qui n'hérite pas de NUMB, a une capacité proliférative supérieure aux progéniteurs apicaux. Pour la première fois, nous suggérons que les progéniteurs rétiniens ne sont pas équipotents. Ces travaux ont permis d'identifier un nouveau régulateur de l’orientation du fuseau mitotique, et d'élucider la régulation de la localisation cortico-latérale de LGN dans les progéniteurs rétiniens des vertébrés. Ils suggèrent que SAPCD2 et LGN interagissent différemment et changent de rôle au cours de la rétinogenèse. Ces découvertes contribuent à mieux comprendre les mécanismes moléculaires et cellulaires qui contrôlent la taille du lignage neuronal et régulent la formation de la diversité cellulaire au cours du développement du système nerveux central des vertébrés. / The control of cell division orientation is an integral processing during asymmetric cell division, a critical process ensuring cell diversity by asymmetrically distributing cell fate determinants between daughter cells. Cell fate determinants in invertebrate model organisms such as the C. elegans nematode and Drosophila fruit fly have been well characterized, and genetic analyses in these organisms has identified the evolutionarily conserved ternary protein complex Gai-LGN-NuMA as essential molecules involved in mitotic spindle orientation, as well as the polarity protein complex PAR3-PAR6-aPKC. Precisely how the Gai-LGN-NuMA complex achieves proper sub-cellular localization in vertebrate neural progenitors to induce planar cell division remains unclear. We used the developing vertebrate retina as a model system to study the role of cell division orientation in cell fate decisions. We have previously demonstrated a link between cell division orientation and daughter cell outcome in neural retina. Specifically, vertical cell divisions have a tendency to give rise to asymmetric pairs of daughter cells, and appear in later stages of retinogenesis. We wished to elucidate the mechanism underlying the switch from planar to vertical cell divisions over time during the neurogenic vs. proliferative developmental phases of retinogenesis. With our collaborators from the University of Toronto in the lab of Dr Stéphane Angers, we identified a novel Gai, LGN and PAR3 interacting protein, named SAPCD2 (suppressor APC domain containing 2). SAPCD2 is a poorly characterized protein, but known to be expressed in a cell cycle-dependent manner with higher expression during mitosis and elevated expression in many human cancers. We first analyzed Sapcd2 and Lgn expression in the developing retina, and found strong expression during proliferative phases, with its subcellular localization dependent on mitotic phase and developmental stage. During mitoses at P0 (birth), SAPCD2 and LGN display complementary localization with an apical or cortico-lateral enrichment, respectively, suggestive of a role in planar cell division induction. However, at E14.5, SAPCD2 and LGN have a highly similar localization, independent of spindle orientation, suggesting different roles during retinal development. We then analyzed mitotic spindle orientation in Sapcd2 and Sapcd2/Lgn DKO mice at E14.5 and P0, and Lgn mutant mice studied in parallel by Dre Marine Lacomme, post-doc in the Cayouette lab. In the absence of Sapcd2, vertical divisions drastically increased, whereas in the absence of Lgn, horizontal cell divisions increased. To test if this reorientation affects cell fate outcome, we analyzed the lineage of individual progenitor cells. As expected, in absence of Sapcd2, we observed a drastic increase in terminal asymmetric cell divisions, leading to two different neurons; whereas in the absence of Lgn, we observed an increase in terminal symmetric cell divisions, leading to two photoreceptors. Mechanistically, we showed that SAPCD2 negatively regulates LGN cortical localization, by competing with NuMA for its binding. In Lgn;Sapcd2 DKO mice, the mitotic spindle reorientation phenotype is even more drastic, containing almost exclusively vertical cell divisions, combined with an increase of proliferation and non-apical mitoses. This leads to a drastic expansion of the neuronal population, which forms an extra-layer containing many different retinal cell types. This over-proliferation could be due to the increase of vertical cell divisions, leading to an asymmetrical distribution of cell fate determinant, NUMB, an antagonist of Notch, between daughter cells. We hypothesize that the retinal basal progenitor, without NUMB, has a higher proliferative potential than the apical progenitor. Contrary to previous studies, this suggests that retinal progenitors are not equipotent. This work identifies a new regulator of mitotic spindle orientation and clarifies the sub-cellular localization of the LGN-NuMA complex. Our results also suggest that SAPCD2 and LGN change their role and the way they interact throughout the course of retinogenesis. This research contributes to an understanding of both how neural number is regulated, and how cell diversity is generated during vertebrate central nervous system development.

La rétinogésèse des vertébrés est la culmination de processus biologiques complexes parfaitement exécutés. Cette délicate orchestration est principalement contrôlée par les facteurs de transcription qui permettent aux progéniteurs rétiniens de proliférer, de s’auto-renouveler et de se différencier de façon appropriée. Les facteurs de transcription à homéodomaine sont les protéines qui sont responsables de la démarcation du site du primordium optique et participeront même à la différenciation tardive des différents types cellulaires de la rétine. Le contrôle génétique concernant l‘activation de l’expression de facteurs de transcription est peu connu. Nous avons étudié les séquences génomique avoisinant le gène Six6 afin d’identifier et mieux comprendre son promoteur. Des expériences d’immunoprécipitation de chromatine et des essais luciférases ont confirmé la liaison et la transactivation synergique du promoteur potentiel de Six6 par Lhx2 et Pax6 in vitro. Cette présente étude confirme et précise également le rôle de Lhx2 au niveau du développement précoce de l’oeil. La compréhension détaillée des réseaux génétiques régulant les progéniteurs rétiniens à former une rétine fonctionnelle est essentielle. En effet, lorsque ces connaissances seront acquises, nous serons en mesure d’appliquer les thérapies cellulaires pour rétablir les fonctions rétiniennes lors de pathologies dégénératives. / Vertebrate eye developement is the result of multiple perfectly executed biological process. This tight orchestration is principaly controled by transcription factors. Homeobox-containing transcription factors are expressed in the presumptive eye field and are required to initiate eye development and for final retinal cell differenciation. The genetic control of these transcription factors are poorly understood. We analysed Six6’s nearby genomic sequence to caracterise potential promoter regions. Chromatin immunoprecipitations and luciferase assays confirmed the binding and the in vitro synergic trans-activation of Six6 potential promoter by Lhx2 and Pax6. This study also demonstrate the contribution of Lhx2 for the establishment of presumptive retina field at the neural plate stage. The detailed knowledge of genetic networks regulating the formation of a fonctional retina by retinal progenitor is crucial. Indeed, when these mecanisms will be eluciated, we will be able to establish regenerative retinal cell therapy.

Les cellules gliales sont essentielles au fonctionnement du système nerveux. Dans la rétine, les cellules gliales de Müller assurent à la fois l’homéostasie du tissu et la protection des neurones, notamment celle des cellules ganglionnaires de la rétine (CGRs). L’hypothèse principale de la thèse est que les cellules de Müller joueraient un rôle primordial dans la survie neuronale tant au plan de la signalisation des neurotrophines/proneurotrophines par suite d’une blessure que lors des mécanismes d’excitotoxicité. Contrairement au brain-derived neurotrophic factor (BDNF), le nerve growth factor (NGF) n’est pas en mesure d’induire la survie des CGRs après une section du nerf optique. Le premier objectif de la thèse a donc été de localiser les récepteurs p75NTR et TrkA du NGF dans la rétine adulte et d’établir leur fonction respective en utilisant des ligands peptidomimétiques agonistes ou antagonistes spécifiques pour chacun des récepteurs. Nos résultats ont démontré que TrkA est surexprimé par les CGRs après l’axotomie, tandis que p75NTR est spécifiquement exprimé par les cellules de Müller. Alors que NGF n’est pas en mesure d’induire la survie des CGRs, l’activation spécifique de TrkA par des ligands peptidomimétique est nettement neuroprotectrice. De façon surprenante, le blocage sélectif de p75NTR ou l’absence de celui-ci protège les CGRs de la mort induite par l’axotomie. De plus, la combinaison de NGF avec l’antagoniste de p75NTR agit de façon synergique sur la survie des CGRS. Ces résultats révèlent un nouveau mécanisme par lequel le récepteur p75NTR exprimé par les cellules gliales de Müller peut grandement influencer la survie neuronale. Ensuite, nous avons voulu déterminer l’effet des proneurotrophines dans la rétine adulte. Nous avons démontré que l’injection de proNGF induit la mort des CGRs chez le rat et la souris par un mécanisme dépendant de p75NTR. L’expression de p75NTR étant exclusive aux cellules de Müller, nous avons testé l’hypothèse que le proNGF active une signalisation cellulaire non-autonome qui aboutit à la mort des CGRs. En suivant cette idée, nous avons montré que le proNGF induit une forte expression du tumor necrosis factor α (TNFα) dans les cellules de Müller et que l’inhibition du TNF bloque la mort neuronale induite par le proNGF. L’utilisation de souris knock-out pour la protéine p75NTR, son co-récepteur sortiline, ou la protéine adaptatrice NRAGE a permis de montrer que la production de TNF par les cellules gliales était dépendante de ces protéines. Le proNGF semble activer une signalisation cellulaire non-autonome qui cause la mort des neurones de façon dépendante du TNF in vivo. L’hypothèse centrale de l’excitotoxicité est que la stimulation excessive des récepteurs du glutamate sensibles au N-Methyl-D-Aspartate (NMDA) est dommageable pour les neurones et contribue à plusieurs maladies neurodégénératives. Les cellules gliales sont soupçonnées de contribuer à la mort neuronale par excitotoxicité, mais leur rôle précis est encore méconnu. Le dernier objectif de ma thèse était d’établir le rôle des cellules de Müller dans cette mort neuronale. Nos résultats ont démontré que l’injection de NMDA induit une activation du nuclear factor κB (NF-κB) dans les cellules de Müller, mais pas dans les CGRs, et que l’utilisation d’inhibiteurs du NF-κB empêche la mort des CGRs. De plus, nous avons montré que les cellules de Müller en réaction à l’activation du NF-κB produisent la protéine TNFα laquelle semble être directement impliquée dans la mort des CGRs par excitotoxicité. Cette mort cellulaire se produit principalement par l’augmentation à la surface des neurones des récepteurs AMPA perméables au Ca2+, un phénomène dépendant du TNFα. Ces donnés révèlent un nouveau mécanisme cellululaire non-autonome par lequel les cellules gliales peuvent exacerber la mort neuronale lors de la mise en jeu de mécanismes excitotoxiques. / Glial cells are essential for the functioning of the nervous system. In the retina, the Müller glial cells ensure the homeostasis of this tissue as well as the protection of neurons including the retinal ganglion cells (RGCs). The main hypothesis of this thesis is that Müller cells play a predominant role in neuronal survival both at the levels of neurotrophin/proneurotrophin signaling following injury and excitotoxic mechanisms. Unlike the brain-derived neurotrophic factor (BDNF), the nerve growth factor (NGF) is unable to induce RGCs survival following optic nerve transection. The first objective of the thesis was therefore to describe the expression of the two receptors of NGF, p75NTR and TrkA, in the adult retina and to address their functional role by using peptidomimetic agonistic or antagonistic ligands specific for each receptor. Our results showed that TrkA is overexpressed by RGCs following axotomy, whereas p75NTR is specifically expressed by Müller cells. While NGF by itself does not promote RGC survival, selective activation of TrkA receptors using peptidomimetic ligands is markedly neuroprotective. Surprisingly, selective blockers of p75NTR, or the absence of p75NTR, protect RGCs from axotomy-induced death. Moreover, combination of NGF or TrkA agonists with p75NTR antagonists functions synergistically to enhance RGC survival. These results reveal a new mechanism by which p75NTR expression by Müller glia may profoundly influence neuronal survival. Next, we wanted to address the effect of proneurotrophins in the adult retina. We showed that injection of proNGF induces the death of RGCs in rats and mice by a p75NTR-dependent signaling mechanism. Expression of p75NTR in the adult retina being confined to Müller glial cells, we tested the hypothesis that proNGF activates a non-cell autonomous signaling pathway to induce RGC death. Consistent with this notion, we showed that proNGF induced a robust expression of tumor necrosis factor α (TNFα) in Müller cells, and that genetic or biochemical ablation of TNFα blocked proNGF-induced death of retinal neurons. Mice rendered null for p75NTR, its co-receptor sortilin, or the adaptor protein NRAGE were defective in proNGF-induced glial TNFα production and did not undergo proNGF-induced retinal ganglion cell death. We concluded that proNGF activates a non-cell autonomous signaling pathway that causes TNFα-dependent death of retinal neurons in vivo. The central hypothesis of excitotoxicity is that excessive stimulation of neuronal N-Methyl-D-Aspartate (NMDA)-sensitive glutamate receptors is harmful to neurons and contributes to a variety of neurological disorders. Glial cells have been proposed to participate in excitotoxic neuronal loss, but their precise role is poorly defined. In this in vivo study, we showed that NMDA induces a strong NF-κB activation in Müller glia, but not in retinal neurons. Intriguingly, NMDA-induced death of retinal neurons was effectively blocked by inhibitors of NF-κB activity. We demonstrated that TNFα protein produced in Müller glial cells via an NMDA-induced NF-κB dependent pathway plays a crucial role in the excitotoxic loss of retinal neurons. This cell loss occurs mainly through a TNFα-dependent increase in Ca2+-permeable AMPA receptors on susceptible neurons. Thus, our data reveal a novel non-cell-autonomous mechanism by which glial cells can profoundly exacerbate neuronal death following excitotoxic injury.

Thèse numérisée par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal.

La détérioration de la barrière hémato rétinienne et l'oedème maculaire consécutif est une manifestation cardinale de la rétinopathie diabétique (RD) et la caractéristique clinique la plus étroitement associée à la perte de la vue. Alors que l'oedème maculaire affecte plus de 25% des patients souffrant de diabète, les modalités de traitement actuellement disponibles tels que les corticostéroïdes administrés localement et les thérapies anti-VEGF récemment approuvés présentent plusieurs inconvénients. Bien que le lien entre une rupture de l’unité neuro-vasculaire et la pathogénèse de la RD ait récemment été établi, l’influence de la signalisation neuro-vasculaire sur la vasculopathie oculaire diabetique a jusqu’à présent reçu peu d’attention. Ici, à l’aide d’ètudes humaines et animales, nous fournissons la première preuve du rôle essentiel de la molécule de guidage neuronale classique Sémaphorine 3A dans l’instigation de la perméabilité vasculaire maculaire pathologique dans le diabète de type 1. L’étude de la dynamique d’expression de Sémaphorine 3A révèle que cette dernière est induite dans les phases précoces hyperglycèmiques du diabète dans la rétine neuronale et participe à la rupture initiale de la fonction de barrière endothéliale. En utilisant le modèle de souris streptozotocine pour simuler la rétinopathie diabétique humaine, nous avons démontré par une série d’approches analogue que la neutralisation de Sémaphorine 3A empêche de façon efficace une fuite vasculaire rétinienne. Nos résultats identifient une nouvelle cible thérapeutique pour l’oedème maculaire diabétique en plus de fournir d’autres preuves de communication neuro-vasculaire dans la pathogènese de la RD. / The deterioration of the blood retinal barrier and consequent macular edema is a cardinal manifestation of diabetic retinopathy (DR) and the clinical feature most closely associated with loss of sight. While macular edema affects over 25% of patients suffering from diabetes, currently available treatment modalities such as locally administered corticosteroids and recently approved anti-VEGF therapies, present several drawbacks. Although recent insight on the pathogenesis of DR points to a breakdown in the neurovascular unit, neurovascular cross-talk and its influence on diabetic ocular vasculopathy has thus far received limited attention. Here we provide the first evidence from both human and animal studies for the critical role of the classical neuronal guidance cue Semaphorin3A in instigating pathological macular vascular permeability in type I diabetes. Investigation of the dynamics of expression reveal that Semaphorin3A is induced in the early hyperglycemic phases of diabetes within the neuronal retina and precipitates initial breakdown of endothelial barrier function. Using the streptozotocin mouse model as a proxy for human diabetic retinopathy, we demonstrate by a series of orthogonal approaches (gene silencing or treatment with soluble Neuropilin-1 employed as a Semaphorin3A trap), that neutralization of Semaphorin3A efficiently prevents retinal vascular leakage. Our findings identify a new therapeutic target for DME and provide further evidence for neurovascular cross-talk in pathogenesis of DR.

Le glaucome est la première cause de cécité irréversible à travers le monde. À présent il n’existe aucun remède au glaucome, et les thérapies adoptées sont souvent inadéquates. La perte de vision causée par le glaucome est due à la mort sélective des cellules rétiniennes ganglionnaires, les neurones qui envoient de l’information visuelle de la rétine au cerveau. Le mécanisme principal menant au dommage des cellules rétiniennes ganglionnaires lors du glaucome n’est pas bien compris, mais quelques responsables putatifs ont été proposés tels que l’excitotoxicité, le manque de neurotrophines, la compression mécanique, l’ischémie, les astrocytes réactifs et le stress oxidatif, parmis d’autres. Indépendamment de la cause, il est bien établi que la perte des cellules rétiniennes ganglionnaires lors du glaucome est causée par la mort cellulaire programmée apoptotique. Cependant, les mécanismes moléculaires précis qui déclenchent l’apoptose dans les cellules rétiniennes ganglionnaires adultes sont mal définis. Pour aborder ce point, j’ai avancé l’hypothèse centrale que l’identification de voies de signalisations moléculaires impliquées dans la mort apoptotique des cellules rétiniennes ganglionnaires offrirait des avenues thérapeutiques pour ralentir ou même prévenir la mort de celles-ci lors de neuropathies oculaires telles que le glaucome. Dans la première partie de ma thèse, j’ai caractérisé le rôle de la famille de protéines stimulatrices d’apoptose de p53 (ASPP), protéines régulatrices de la famille p53, dans la mort apoptotique des cellules rétiniennes ganglionnaires. p53 est un facteur de transcription nucléaire impliqué dans des fonctions cellulaires variant de la transcription à l’apoptose. Les membres de la famille ASPP, soit ASPP1, ASPP2 et iASPP, sont des protéines de liaison de p53 qui régulent l’apoptose. Pourtant, le rôle de la famille des ASPP dans la mort des cellules rétiniennes ganglionnaires est inconnu. ASPP1 et ASPP2 étant pro-apoptotiques, l’hypothèse de cette première étude est que la baisse ciblée de ASPP1 et ASPP2 promouvrait la survie des cellules rétiniennes ganglionnaires après une blessure du nerf optique. Nous avons utilisé un modèle expérimental bien caractérisé de mort apoptotique neuronale induite par axotomie du nerf optique chez le rat de type Sprague Dawley. Les résultats de cette étude (Wilson et al. Journal of Neuroscience, 2013) ont démontré que p53 est impliqué dans la mort apoptotique des cellules rétiniennes ganglionnaires, et qu’une baisse ciblée de ASPP1 et ASPP2 par acide ribonucléique d’interference promeut la survie des cellules rétiniennes ganglionnaires. Dans la deuxième partie de ma thèse, j’ai caractérisé le rôle d’iASPP, le membre anti-apoptotique de la famille des ASPP, dans la mort apoptotique des cellules rétiniennes ganglionnaires. L’hypothèse de cette seconde étude est que la surexpression d’iASPP promouvrait la survie des cellules rétiniennes ganglionnaires après axotomie. Mes résultats (Wilson et al. PLoS ONE, 2014) démontrent que le knockdown ciblé de iASPP exacerbe la mort apoptotique des cellules rétiniennes ganglionnaires, et que la surexpression de iASPP par virus adéno-associé promeut la survie des cellules rétiniennes ganglionnaires. En conclusion, les résultats présentés dans cette thèse contribuent à une meilleure compréhension des mécanismes régulateurs sous-jacents la perte de cellules rétiniennes ganglionnaires par apoptose et pourraient fournir des pistes pour la conception de nouvelles stratégies neuroprotectrices pour le traitement de maladies neurodégénératives telles que le glaucome. / Glaucoma is the leading cause of irreversible blindness worldwide. At present, there is no cure for glaucoma, and current therapies are often inadequate. Loss of vision in glaucoma results from the death of retinal ganglion cells, the neurons that send visual information from the retina to the brain. The principal mechanism leading to retinal ganglion cell damage during glaucoma is not well understood, however, putative culprits have been proposed including excitotoxicity, neurotrophin deprivation, mechanical compression, ischemia, reactive astrocytes and oxidative stress. It is well established that retinal ganglion cell loss during glaucoma is caused by apoptotic programmed cell death, however, the precise mechanisms that lead to apoptotic death of adult retinal ganglion cells are poorly defined. To address this point, I put forth the central hypothesis that the identification of signaling pathways involved in apoptotic retinal ganglion cell death would offer therapeutic avenues to slow or prevent retinal ganglion cell death during ocular neuropathies such as glaucoma. In the first part of my thesis, I characterised the role of Apoptosis Stimulating Protein of p53 family (ASPP) proteins, which are regulators of p53, in the apoptotic death of retinal ganglion cells. p53 is a nuclear transcription factor implicated in cellular functions ranging from transcription to apoptosis. ASPP family members ASPP1, ASPP2 and iASPP are p53 binding proteins that belong to a family of protein regulators of p53-dependent apoptotic death. However, the role of ASPP family members in retinal ganglion cell death is unknown. As ASPP1 and ASPP2 are pro-apoptotic, the hypothesis of our first study was that the knockdown of ASPP1 and ASPP2 gene expression would lead to retinal ganglion cell survival after an optic nerve lesion. We used a well-characterized experimental model of neuronal apoptosis induced by optic nerve axotomy in Sprague Dawley rats. The results of this study (Wilson et al. Journal of Neuroscience, 2013) demonstrated that p53 is implicated in retinal ganglion cell death, and that targeted knockdown of ASPP1 and ASPP2 by short interference ribonucleic acid promotes retinal ganglion cell survival. The knockdown of ASPP2 correlates with a reduction in the levels of pro-apoptotic p53 regulated targets PUMA and Fas/CD95. In the second part of my thesis, I characterized the role of the anti-apoptotic member of the ASPP family, iASPP, in the apoptotic death of retinal ganglion cells. The hypothesis of this second study is that the overexpression of iASPP would promote retinal ganglion cell survival after axotomy. The data (Wilson et al. PLoS ONE, 2014) demonstrate that the targeted knockdown of iASPP by short interference ribonucleic acid exacerbates retinal ganglion cell death, and that the overexpression of iASPP by adeno-associated virus promotes retinal ganglion cell survival. The overexpression of iASPP correlates with a reduction in protein levels of PUMA and Fas/CD95. In conclusion, the findings presented in this thesis contribute to a better understanding of the pathological mechanisms underlying retinal ganglion cell loss by apoptosis and might provide insights into the design of novel neuroprotective treatments for neurodegenerative diseases such as glaucoma.

Le cannabis produit de nombreux effets psychologiques et physiologiques sur le corps humain. Les molécules contenues dans cette plante, désignées comme « phytocannabinoïdes », activent un système endogène qu’on appelle le système endocannabinoïde (eCB). Les effets de la consommation de cannabis sur la vision ont déjà été décrits sans cependant de formulation sur les mécanismes sous-jacents. Ces résultats comportementaux suggèrent, malgré tout, la présence de ce système eCB dans le système visuel, et particulièrement dans la rétine. Cette thèse vise donc à caractériser l’expression, la localisation et le rôle du système eCB dans la rétine du singe vervet, une espèce animale ayant un système visuel semblable à celui de l’humain. Nous avons mis au point un protocole expérimental d’immunohistochimie décrit dans l’article apparaissant dans l’Annexe I que nous avons utilisé pour répondre à notre objectif principal. Dans une première série de quatre articles, nous avons ainsi caractérisé l’expression et la localisation de deux récepteurs eCBs reconnus, les récepteurs cannabinoïdes de type 1 (CB1R) et de type 2 (CB2R), et d’un 3e présumé récepteur aux cannabinoïdes, le récepteur GPR55. Dans l’article 1, nous avons démontré que CB1R et une enzyme clé de ce système, la fatty acid amide hydrolase (FAAH), sont exprimés dans les parties centrale et périphérique de la rétine, et abondamment présents dans la fovéa, une région où l’acuité visuelle est maximale. Dans l’article 2, nous avons localisé le CB2R dans des cellules gliales de la rétine : les cellules de Müller et nous avons proposé un modèle sur l’action de cette protéine dans la fonction rétinienne faisant appel à une cascade chimique impliquant les canaux potassiques. Dans l’article 3, nous avons observé le GPR55 exclusivement dans les bâtonnets qui sont responsables de la vision scotopique et nous avons soumis un deuxième modèle de fonctionnement de ce récepteur par le biais d'une modulation des canaux calciques et sodiques des bâtonnets. Vu que ces 3 récepteurs se retrouvent dans des cellules distinctes, nous avons suggéré leur rôle primordial dans l’analyse de l’information visuelle au niveau rétinien. Dans l’article 4, nous avons effectué une analyse comparative de l’expression du système eCB dans la rétine de souris, de toupayes (petits mammifères insectivores qui sont sont considérés comme l’étape intermédiaire entre les rongeurs et les primates) et de deux espèces de singe (le vervet et le rhésus). Ces résultats nous ont menés à présenter une hypothèse évolutionniste quant à l’apparition et à la fonction précise de ces récepteurs. Dans les articles subséquents, nous avons confirmé notre hypothèse sur le rôle spécifique de ces trois récepteurs par l’utilisation de l’électrorétinographie (ERG) après injection intravitréenne d’agonistes et d’antagonistes de ces récepteurs. Nous avons conclu sur leur influence indéniable dans le processus visuel rétinien chez le primate. Dans l’article 5, nous avons établi le protocole d’enregistrement ERG normalisé sur le singe vervet, et nous avons produit un atlas d’ondes ERG spécifique à cette espèce, selon les règles de l’International Society for Clinical Electrophysiology of Vision (ISCEV). Les patrons électrorétinographiques se sont avérés semblables à ceux de l’humain et ont confirmé la similarité entre ces deux espèces. Dans l’article 6, nous avons démontré que le blocage de CB1R ou CB2R entraine une modification de l’électrorétinogramme, tant au niveau photopique que scotopique, ce qui supporte l’implication de ces récepteurs dans la modulation des ondes de l’ERG. Finalement, dans l’article 7, nous avons confirmé le modèle neurochimique proposé dans l’article 3 pour expliquer le rôle fonctionnel de GPR55, en montrant que l’activation ou le blocage de ce récepteur, respectivement par un agoniste (lysophosphatidylglucoside, LPG) ou un antagoniste (CID16020046), entraine soit une augmentation ou une baisse significative de l’ERG scotopique seulement. Ces données, prises ensemble, démontrent que les récepteurs CB1R, CB2R et GPR55 sont exprimés dans des types cellulaires bien distincts de la rétine du singe et ont chacun un rôle spécifique. L’importance de notre travail se manifeste aussi par des applications cliniques en permettant le développement de cibles pharmacologiques potentielles dans le traitement des maladies de la rétine. / Cannabis produces a range of psychological and physiological effects on the human body. Cannabinoids are the chemical compounds found in cannabis that activate an endogenous system, termed the endocannabinoid (eCB) system. Reports made in the 1970s have noted that cannabis consumption affects vision. It is therefore suggested that the eCB system is present in the visual system, particularly in the retina. This thesis aims at characterizing the expression, localization, and role of the eCB system in the vervet monkey retina. This animal model has a similar visual system as humans. Using immunohistochemistry methods presented in the article of Annexe I, we have established an experimental protocol to answer our goal. In the first series of four articles, we have characterized the expression and localization of the cannabinoid receptor 1 (CB1R), cannabinoid receptor 2 (CB2R), and the putative cannabinoid receptor GPR55. In Article 1, we have demonstrated that CB1R and a key enzyme of this system, FAAH (fatty acid amide hydrolase), are expressed in the central and peripheral retina, but heavily present in the fovea, the retinal region responsible for high acuity vision. In Article 2, we have localized CB2R in the glial Müller cells and hypothesized a possible mechanism of action of CB2R involving potassium buffering. In Article 3, we found that GPR55 is exclusively expressed in rods and have proposed its role through the modulation of calcium and sodium channels in rods. Given that these three receptors are segregated in the vervet monkey retina, we suggested that they might have distinct roles in retinal physiology. In Article 4, we reported a comparative analysis of the expression of the eCB system components in the retina of rodents, tree shrews (small mammals considered as early primates), and monkeys. This paper provides evidence that the eCB system is differently expressed in the retina of these mammals and suggests a distinctive role of eCBs in visual processing. In the subsequent series of three articles, we confirmed their suggested roles in the retina by using electroretinography (ERG) and intravitreal injections of agonist and antagonist of these receptors. We concluded that they indeed play important roles in the retina. In Article 5, we developed a standard protocol for ERG testing in our animal model and have published an ERG atlas with normalized amplitudes and latency values similar to that of humans, following the guidelines of the International Society for Clinical Electrophysiology of Vision. In Article 6, we showed that blockade of CB1R or CB2R with specific antagonists modifies the ERG, both in photopic and scotopic conditions, which confirms the implication of these receptors in normal retinal function. Finally, in Article 7 (expression of GPR55 in rods only), we confirmed the suggest role of GPR55 in rods by showing that activation or blockade of GPR55 with a specific agonist (lysophosphatidylglucoside) or antagonist (CID16020046) increases or decreases the amplitude of the scotopic ERG waveforms. Taken together, these articles demonstrate that CB1R, CB2R, and GPR55 are differentially expressed in the vervet monkey retina and have distinct roles. This work has also clinical relevance in the way that we have discovered new pharmacological targets that can be used for treatment of many retinal diseases.