Osteoclasts are multinucleated cells found exclusively in bone and are derived from the haematopoietic cells of monocytes/macrophage lineage. The cell-to-cell interaction between osteoblastic/stromal cells and osteoclast precursor cells is necessary for osteoclastogenesis. Receptor Activator of NF-κB ligand (RANKL) was identified as a membrane-bound TNF ligand family member that is the ‘master’ cytokine expressed on osteoblastic/stromal cells, which stimulate osteoclastogenesis through cell-to-cell contact with osteoclast precursors. RANKL is considered to be a factor that is necessary and sufficient for the induction of osteoclastogenesis (Lacey, et al., 1998). RANKL is a type II transmembrane cytokine of the TNF ligand superfamily and has an active TNF-like core domain at the extracellular domain. This active TNF-like core domain is thought to be the region through which it binds to it’s active receptor, RANK, for the activation of signal transduction pathways for the initiation of processes leading to osteoclastogenesis (Lacey, et al., 1998; Li, et al., 1999). It was hypothesized that any change in the active TNF-like core domain might affect the ability of RANKL binding to RANK and consequently affect the activation of signal transduction pathways and osteoclastogenesis. Hence, this thesis sought to investigate the effects of changes in the active TNF-like core domain by truncation mutation on the ability of RANKL binding to RANK and consequently affect the activation of signal transduction pathways and osteoclastogenesis. A cDNA fragment encoding the full-length TNF-like core domain of rat RANKL (rRANKL) (aa160-318) was cloned into the bacterial expression pGEX vectors and stably expressed in Eschechia coli as a fusion protein with the C-terminus of glutathione S-transferase (GST). Four mutants (aa160-302, aa160-268, aa239-318 and aa246-318) were also generated by truncation mutation in the TNF-like core domain, and cloned into the pGEX vector to produce GST-rRANKL mutants. The proteins were over-expressed and affinity purified to 95% in purity. GST-rRANKL (160-318) containing the full length TNF-like core domain was able to induced osteoclastogenesis in spleen cells in the presence of M-CSF and in RAW264.7 cells in the absence of M-CSF. It was also found to activate mature osteoclast activity in vitro, ex vivo and in vivo. It has the highest binding affinity to RANK and the greatest potency for NF-κB activation as well as the induction of osteoclastogenesis compared to the truncated mutants. Mutants generated by truncation of the TNF-like core domain revealed that the TNF-like core domain is important for the interaction with the RANK, for high binding affinity, NF-κB activation and induction of osteoclastogenesis. In general, the truncated mutants not only displayed a reduction in the binding affinity to RANK, but also a reduction in NF-κB activation, and significantly reduced potency in the induction of osteoclastogenesis. Interestingly, mutant GST-rRANKL (160-268) showed a higher affectivity than the other mutants did, in that it had greater binding affinity to RANK, and in NF-κB activation than the rest of the truncated mutants. Mutants GST-rRANKL (239-318) and GST-rRANKL (246-318) on the other hand, showed little potency in the induction of osteoclast formation, however, might have an inhibitory effect through competition with full length GST-rRANKL (160-318) as well as inducing a response in vivo resulting in an increase in the serum calcium level. In conclusion, this thesis demonstrated that the TNF-like core domain of RANKL is active, and imperative in the binding to RANK, activating signal transduction pathways and induction of osteoclastogenesis. Changes in the active TNF-like core domain affected the ability, affinity and efficiency of RANKL binding to the receptor, RANK and consequently affected the activation of signal transduction pathways and osteoclastogenesis.

RANKL (ligand du récepteur activateur de NF-KB) est un membre de la famille des TNF dont la signalisation passe par RANK et qui joue un rôle important dans la régulation immunitaire. Chez l'adulte, RANKL est exprimé constitutivement par des cellules réticulaires marginales (MRC) des ganglions lymphatiques. Comme les MRCs sont physiquement proches des lymphocytes B (LB) et ont été proposé d’être des précurseurs de cellules dendritiques folliculaires (FDC), RANKL pourrait jouer un rôle dans la différenciation du stroma associé aux LB et dans la réponse humorale. Afin de mieux comprendre la fonction de RANKL exprimé par les MRC, nous avons généré des souris déficitaires pour RANKL dans les cellules stromales. Nous avons constaté que la formation du follicule B était perturbée ainsi que le réseau FDC. Bien que RANKL ne soit pas requis pour la formation des MRC, il est nécessaire pour l'expression de la chimiokine CXCL13 par ces mêmes cellules. Parmi les TNFRSF dont la signalisation est requise pour l’expression de CXCL13 et la différenciation des FDC, le TNFR1 était significativement réduit dans les cellules stromales des souris dépourvues de RANKL stromal. Ainsi, RANKL pourrait constituer une nouvelle cible thérapeutique contre les immunopathologies des LB en agissant sur son stroma. / RANKL (receptor activator of NF-κB ligand), a member of the TNF family that signals via RANK, plays an important role for immune regulation. In the adult, RANKL is constitutively expressed by marginal reticular cells (MRCs) of the lymph nodes. Because MRCs are positioned in close vicinity to B cells and may be precursors of follicular dendritic cells (FDCs), RANKL could play a role in the differentiation of B cell-associated stroma and the humoral immune response. In order to better understand the role of RANKL expressed by the MRCs, we generated mice with conditional RANKL deficiency in the stromal compartment. We found that the B cell follicle structure was disrupted and FDC network formation was reduced. Although RANKL was not required for MRC formation, it was necessary for the expression of B cell attracting chemokine CXCL13. Among the TNFRSF members known to control CXCL13 expression and FDC formation, we found that TNFR1 was significantly reduced in the RANKL cKO mice. Thus, RANKL may present a novel therapeutic strategy against B cell-mediated immunopathologies by acting on its stroma.

Made available in DSpace on 2014-12-17T15:32:19Z (GMT). No. of bitstreams: 1 MaiaraM_Dissert.pdf: 2968185 bytes, checksum: 105b46ac6fb81afd7b7596a11828a3c8 (MD5) Previous issue date: 2010-03-10 / Coordena??o de Aperfei?oamento de Pessoal de N?vel Superior / Receptor ativador nuclear κappa B (RANK), ligante do receptor ativador nuclear κappa B (RANKL) e osteoprotegerina (OPG) s?o membros da fam?lia do fator de necrose tumoral relacionados com o metabolismo ?sseo. A forma??o, diferencia??o e atividade dos osteoclastos s?o reguladas por estas tr?s prote?nas. RANK ? um receptor transmembrana presente em diversos tipos celulares, principalmente em c?lulas de linhagem macrof?gica, linf?citos, c?lulas dendr?ticas e fibroblastos e quando ativado pelo seu ligante, RANKL, promove a diferencia??o e ativa??o de c?lulas osteocl?sticas respons?veis pelo processo de reabsor??o ?ssea. A OPG impede a liga??o RANK/RANKL atuando como um receptor inibit?rio para a atividade osteol?tica. O objetivo deste estudo foi comparar a express?o imuno-histoqu?mica destes biomarcadores em cistos radiculares (n=20) e cistos dent?geros (n=20). A express?o imuno-histoqu?mica destes marcadores foi avaliada no epit?lio e na c?psula dos cistos por escores e percentuais m?dios de imunomarca??o. Para o epit?lio, a an?lise semi-quantitativa revelou um padr?o similar dos escores de imunomarca??o de RANK, RANKL e OPG nas les?es, n?o havendo diferen?a estat?stica significante (p=0.589, p=0.688, p=0.709, respectivamente). Para a c?psula c?stica a an?lise quantitativa, mostrou diferen?a estat?stica significante entre os percentuais m?dios de imunomarca??o do RANK e RANKL (p=0,001 e p=0,005, respectivamente) nos cistos. A correla??o dos escores de imunomarca??o de RANKL e OPG no epit?lio do CR e do CD revelou diferen?a estat?stica significante (p=0,029, p=0,003, respectivamente). No epit?lio dos CRs e dos CDs observou-se uma maior imunoexpress?o da OPG comparada a do RANKL. Os resultados apontam a presen?a de RANK, RANKL e OPG nos cistos radiculares e cistos dent?geros, sugerindo a atua??o destas prote?nas no desenvolvimento e expans?o das les?es no osso adjacente / Receptor ativador nuclear κappa B (RANK), ligante do receptor ativador nuclear κappa B (RANKL) e osteoprotegerina (OPG) s?o membros da fam?lia do fator de necrose tumoral relacionados com o metabolismo ?sseo. A forma??o, diferencia??o e atividade dos osteoclastos s?o reguladas por estas tr?s prote?nas. RANK ? um receptor transmembrana presente em diversos tipos celulares, principalmente em c?lulas de linhagem macrof?gica, linf?citos, c?lulas dendr?ticas e fibroblastos e quando ativado pelo seu ligante, RANKL, promove a diferencia??o e ativa??o de c?lulas osteocl?sticas respons?veis pelo processo de reabsor??o ?ssea. A OPG impede a liga??o RANK/RANKL atuando como um receptor inibit?rio para a atividade osteol?tica. O objetivo deste estudo foi comparar a express?o imuno-histoqu?mica destes biomarcadores em cistos radiculares (n=20) e cistos dent?geros (n=20). A express?o imuno-histoqu?mica destes marcadores foi avaliada no epit?lio e na c?psula dos cistos por escores e percentuais m?dios de imunomarca??o. Para o epit?lio, a an?lise semi-quantitativa revelou um padr?o similar dos escores de imunomarca??o de RANK, RANKL e OPG nas les?es, n?o havendo diferen?a estat?stica significante (p=0.589, p=0.688, p=0.709, respectivamente). Para a c?psula c?stica a an?lise quantitativa, mostrou diferen?a estat?stica significante entre os percentuais m?dios de imunomarca??o do RANK e RANKL (p=0,001 e p=0,005, respectivamente) nos cistos. A correla??o dos escores de imunomarca??o de RANKL e OPG no epit?lio do CR e do CD revelou diferen?a estat?stica significante (p=0,029, p=0,003, respectivamente). No epit?lio dos CRs e dos CDs observou-se uma maior imunoexpress?o da OPG comparada a do RANKL. Os resultados apontam a presen?a de RANK, RANKL e OPG nos cistos radiculares e cistos dent?geros, sugerindo a atua??o destas prote?nas no desenvolvimento e expans?o das les?es no osso adjacente

A movimentação dentária induzida é um processo biológico complexo mediado por estímulos mecânicos, levando a um subsequente processo de remodelação óssea, podendo haver reabsorção indesejada da raiz dentária provocada pelo excesso de força. Uma vez que a movimentação ortodôntica se baseia em um processo inflamatório localizado, o propósito deste estudo foi avaliar os efeitos do laser de baixa potência no processo de remodelação óssea e reabsorção radicular, buscando correlacionar as mudanças metabólicas observadas a nível celular ocorridas nos dias iniciais da movimentação dentária às alterações teciduais observadas microscopicamente e à arquitetura e morfologia do trabeculado e cortical ósseo. Primeiros molares de sessenta e oito ratos machos Wistar foram submetidos à movimentação induzida, divididos em 3 grupos: controle negativo (nenhuma movimentação), não irradiado (movimentação sem irradiação) e laser (movimentação e irradiação com laser de baixa potência de comprimento de onda de 810 nm, potência de 100 mW, área de 0,02cm2 e energia de 1,5 J/ponto) e eutanasiados nos dias 3, 6, 9, 14 e 21. Mensurações da movimentação dentária e análises histomorfométricas foram realizadas em todos os dias estudados. Análise imunoistoquímica dos marcadores RANKL, OPG e TRAP e avaliações por microscopia eletrônica de varredura (MEV) foram feitas nos dias 3, 6 e 9 e o ensaio Western Blotting para proteínas RANKL e SOFAT e imagens de microtomografia computadorizada (MicroCT) nos dias 14 e 21. Os resultados deste estudo mostraram que a movimentação dentária foi significantemente maior no grupo Laser (aumento em média de 40%) em todos os dias avaliados. O lado de compressão mostrou maior expressão de RANKL e osteoclastos TRAP-positivos nos dias 3, 6 e 9 (p<0,05), promovendo significativa redução na área de osso alveolar presente no lado de compressão nos dias 6, 9 e 14 (p<0,05), e alterações microestruturais, como menor fração de volume ósseo/volume total, menor densidade óssea mineral aos 14 dias. A irradiação com laser também aumentou a expressão de RANKL e a citocina SOFAT no dia 14. No lado de tensão, houve maior expressão de OPG especialmente aos 9 dias (p<0,001) e significativo aumento na área de osso alveolar presente nos dias 14 (p<0,01) e 21 (p<0,05) histomorfometricamente e maior densidade óssea mineral e espessura das trabéculas aos 21 dias (p<0,01). Com relação às áreas de hialinização presentes, os resultados mostraram áreas significantemente reduzidas nos dias 3, 6 e 9 nos grupos irradiados, o que explica o menor número de odontoclastos na superfície radicular nestes dias e a redução significante das áreas de reabsorção radicular observadas nas lâminas histológicas nos dias 9, 14 e 21 e nas imagens de MEV nos dias 3 e 9. Os grupos irradiados também mostraram menor volume das lacunas de reabsorção radicular medidas no MicroCT nos dias 14 e 21, especialmente nos lados de compressão. O estudo concluiu que o laser de baixa potência influenciou a remodelação óssea, aumentou a atividade dos osteoclastos no lado da compressão, e estimulou a formação óssea no de tensão, acelerando significativamente o movimento dentário e potencialmente reduzindo as áreas de necrose no ligamento periodontal e, consequentemente, a reabsorção radicular. / Tooth movement is a complex biological process induced by mechanical stimulation, leading to a subsequent process of bone remodeling, concomitantly unwanted root resorption may occur caused by excessive force. Since orthodontic movement is based on a localized inflammatory process, the purpose of this study was to evaluate the effects of low-level laser therapy on the process of bone remodeling and root resorption, searching to correlate metabolic changes observed at cellular level in the initial days of tooth movement to tissue changes observed microscopically and both architecture and morphology of trabecular and cortical bone. Upper first molars of sixtyeight male Wistar rats were submitted to induced movement, divided into 3 groups: negative control (no movement), non-irradiated (movement without irradiation) and Laser (movement and irradiation using low level laser of 810 nm wavelength, 100 mW power, 0.02cm2 area, energy of 1.5J/point) and euthanized on days 3, 6, 9, 14 and 21. Measurements of tooth movement and histomorphometric analysis were performed at all days. Immunohistochemistry analysis of RANKL, OPG and TRAP markers and scanning electron microscopy (SEM) were made on days 3, 6 and 9. Western Blotting method to evaluate RANKL and SOFAT proteins and MicroCT images were performed on days 14 and 21. The results of this study showed that tooth movement was significantly greater in the irradiated side (increased in average of 40%) in all evaluated days. The compression side showed higher expression of RANKL and TRAP-positive osteoclasts on days 3, 6 and 9 (p <0.05), promoting significant reduction in alveolar bone area in the compression side on days 6, 9 and 14 ( p <0.05), and leading to microstructural changes such as decrease of the fraction of bone volume / total volume (BV/TV) and the bone mineral density (BMD) at 14 days. The laser also increased RANKL expression and SOFAT on day 14. On the tension side there was an increased expression of OPG especially after 9 days (p <0.001), a significant increase in alveolar bone area on days 14 (p < 0.01) and 21 (p <0.05) histomorphometrically and increase in bone mineral density and trabecular thickness after 21 days (p <0.01). Regarding hyalinized areas, the results showed significant reduced areas on days 3, 6 and 9 in irradiated groups, which explains the lower number of clastic cells on the root surface in these days, and a significant reduction of areas of root resorption observed in histology on days 9, 14 and 21 and on days 3 and 9 by SEM images. Irradiated groups also showed less volume of root resorption lacunaes measured by MicroCT on days 14 and 21, especially in the compression side. The study concludes that the low-level laser therapy had an effect on bone remodeling, increasing osteoclast activity on the compression side, and stimulating bone formation in tension side, resulting in significant tooth movement acceleration and potentially reducing the areas of necrosis in the periodontal ligament and consequently the root resorption process.

La maladie osseuse est une complication sévère pour les patients atteints de mucoviscidose (Cystic Fibrosis, CF). Les fractures vertébrales et costales impactent les capacités pulmonaires et la clairance du mucus bronchique. La meilleure prise en charge des symptômes des patients CF a permis l’amélioration de leurs qualité et espérance de vie. Cependant malgré l’optimisation de facteurs impactant le métabolisme osseux aucune amélioration notable n’a été observée dans la fragilité osseuse. Plus de 80% des patients CF sont porteurs de la mutation F508del du gène CFTR (Cystic Fibrosis Transmembrane conductance Regulator) sur au moins un allèle. L’implication directe de la mutation F508del dans la maladie osseuse a été montrée, bien que son rôle dans le dysfonctionnement du métabolisme osseux reste encore à élucider. Notre travail a permis de mettre en évidence que la mutation F508del portée par les ostéoblastes humains est responsable d’une dérégulation importante de la voie de signalisation RANK/RANKL/OPG aboutissant à un ratio RANKL/OPG élevé, potentiateur de l’ostéoclastogénèse et de la résorption osseuse. Nous avons également mis en évidence que le contexte inflammatoire chronique de la pathologie pourrait exacerber la perte osseuse, les cellules CF étant plus sensibles à ces stimulations. Par ailleurs, nous avons montré que l’utilisation de molécules pharmaceutiques comme des correcteurs et potentiateurs de CFTR, actuellement utilisés en essais cliniques, permettent une normalisation au moins partielle des dérégulations observées des ostéoblastes CF, et apparaissent comme des nouvelles stratégies thérapeutiques. / Bone disease is a serious complication for patients with Cystic Fibrosis (CF). Rib and vertebral fractures worsen lung function and mucus clearance. Better care of CF patient’s symptoms enable an improvement in life quality and expectancy. Despite optimization of factors impacting bone metabolism no improvement was observed in bone loss of patients with CF. More than 80% CF patients carried the F508del mutation on the CFTR (Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator) gene on at least one allele. The role of the F508del mutation in the dysfunction of bone metabolism is yet unclear, but its involvement has been already shown in clinical studies and mouse models.Our work shown that F508del mutation on human osteoblasts causes a dysregulation in the RANK/RANK-L/OPG signalling leading to a high RANK-L to OPG ratio that may improve osteoclastogenesis, and thus the bone résorption. We also show that chronic inflammatory status of CF patients could exacerbate bone loss because of a high sensitivity of osteoblasts with the F508del-CFTR mutation. In addition, we demonstrate that the use of drugs as CFTR correctors and potentiators cause an improvement of the dysregulation observed and seems to be a promising therapeutic strategy.

Durante a resposta inflamatória, diversos mediadores são liberados localmente com o objetivo de estimular a resposta imune celular e humoral. Por meio da ação das enzimas ciclooxigenases e lipoxigenases ocorrerão modificações estruturais na cadeia do ácido araquidônico levando a síntese de prostaglandinas ou leucotrienos e lipoxinas, respectivamente. Tais mediadores são responsáveis pela regulação da expressão dos genes RANK, RANKL e OPG, moduladores da osteoclastogênese. Dessa maneira, o objetivo deste estudo foi avaliar a expressão do RNA mensageiro (RNAm) para as enzimas envolvidas no metabolismo do ácido araquidônico, ciclooxigenase-2 (COX-2) e 5- lipoxigenase (5-LO), e para os mediadores da osteoclastogênese (RANK, RANKL e OPG) no tecido ósseo, após inoculação de lipopolissacarídeo bacteriano (LPS) nos canais radiculares de molares de camundongos. Posteriormente foi investigado o efeito do bloqueio farmacológico da via COX-2 induzida pelo LPS, na expressão de mediadores da osteoclastogênese e de genes envolvidos no metabolismo ósseo. Foram utilizados 144 camundongos C57BL/6, com 6 semanas de idade, pesando de 18 a 20 gramas, nos quais os canais radiculares dos primeiros molares foram inoculados com uma solução contendo lipopolissacarídeo bacteriano de E. coli (0,1, 1,0 e 10mg/ml). Decorridos os períodos experimentais de 7, 14, 21 e 28 dias, os animais foram submetidos à eutanásia e os blocos contendo dente e osso foram removidos para extração do RNA total. Em seguida, foi realizada a avaliação da expressão gênica por meio de transcrição reversa e reação da polimerase em cadeia em tempo real (qRT-PCR). A análise global da expressão de RNAm para proteínas envolvidas no metabolismo ósseo foi realizada por meio de um ensaio de PCR Array (Osteogenesis RT² Profiler PCR Array). Os valores de expressão relativa de cada RNAm, para cada grupo, foram comparados por meio da análise de variância (ANOVA) de duas vias seguido pelo pós-teste de Bonferroni ou por ANOVA de uma via seguido pelo pós-teste de Dunnett (&alpha = 0,05). A inoculação de LPS nos canais radiculares de molares de camundongos foi capaz de induzir a expressão dos genes PTGS2 e ALOX5, responsáveis pela codificação das enzimas COX-2 e 5-LO, envolvidas no metabolismo do ácido araquidônico, concomitantemente à modulação da expressão dos genes TNFRSF11A, TNFSF11 e TNFRSF11B, responsáveis pela codificação dos moduladores da osteoclastogênese RANK, RANKL e OPG, respectivamente. A administração de Indometacina, um inibidor não seletivo de COX-2, inibiu a expressão de RNAm para RANK e RANKL e estimulou a expressão de OPG durante os períodos iniciais de resposta à inoculação de LPS nos canais radiculares. A inibição da via COX-2 de metabolismo do ácido araquidônico nos períodos iniciais de resposta à inoculação de LPS nos canais radiculares modulou diferencialmente a expressão de genes envolvidos no catabolismo e anabolismo ósseo, indicando possíveis papéis para os mediadores derivados no ácido araquidônico na regulação do metabolismo ósseo. Estes resultados sugerem alvos terapêuticos importantes para intervenção precoce em doenças inflamatórias, como lesões periapicais para evitar a reabsorção do tecido ósseo. / During an inflammatory response, several mediators are locally released in order to stimulate cellular and humoral immune response. Through the action of cyclooxygenase and lipoxygenase enzymes structural changes occur in the arachidonic acid chain leading to synthesis of prostaglandins or leukotrienes and lipoxins, respectively. Such mediators are responsible for the regulation of RANK, RANKL and OPG gene expression, osteoclastogenesis modulators. Thus, the objective of this study was to evaluate the expression of messenger RNA (mRNA) for the enzymes involved in arachidonic acid metabolism, cyclooxygenase-2 (COX-2) and 5-lipoxygenase (5-LO), and the osteoclastogenesis mediators (RANK, RANKL and OPG) in bone tissue after injection of bacterial lipopolysaccharide (LPS) in murine dental root canals. Then, COX-2 pathway was pharmacologically blocked for investigation of expression of osteoclastogenesis mediators and genes involved in bone metabolism. We used 144 C57BL/6 mice, 6 weeks-old, weighing 18-20 grams, which had the first molars root canals inoculated with a solution containing LPS from E. coli (0.1, 1.0 and 10 mg/ml). After 7, 14, 21 and 28 days the animals were euthanized and the tooth-and-bone blocks were removed for total RNA extraction. Subsequently, the evaluation of gene expression was performed by reverse transcription and polymerase chain reaction in real time (qRT-PCR). Global analysis of mRNA expression for proteins involved in bone metabolism was performed using PCR arrays (Osteogenesis RT² Profiler PCR Array). The values for relative expression of each mRNA for each group were compared using two-way analysis of variance (ANOVA) followed by Bonferroni post-test or one-way ANOVA followed by Dunnett\'s test (&alpha;=0.05). The injection of LPS into the root canals was induced expression of genes PTGS2 and ALOX5, responsible for encoding COX-2 and 5-LO enzymes, involved in the metabolism of arachidonic acid, simultaneously to the modulation of gene expression of TNFRSF11A, TNFSF11 and TNFRSF11B, responsible for encoding the osteoclastogenesis modulators RANK, RANKL and OPG, respectively. Administration of Indomethacin, a non-selective inhibitor of COX-2, inhibited the expression of mRNA for RANK and RANKL and stimulated the expression of OPG during the initial response to the root canals contamination with LPS. Inhibition of the COX-2 pathway from arachidonic acid metabolism in the initial periods of response to LPS injection into the root canals differentially modulated the expression of genes involved in bone catabolism and anabolism, indicating possible roles for mediators derived from arachidonic acid in the regulation of bone metabolism. These results suggest important therapeutic targets for early intervention in inflammatory diseases such as apical periodontitis to avoid resorption of bone tissue.

Durante a resposta inflamatória, diversos mediadores são liberados localmente com o objetivo de estimular a resposta imune celular e humoral. Por meio da ação das enzimas ciclooxigenases e lipoxigenases ocorrerão modificações estruturais na cadeia do ácido araquidônico levando a síntese de prostaglandinas ou leucotrienos e lipoxinas, respectivamente. Tais mediadores são responsáveis pela regulação da expressão dos genes RANK, RANKL e OPG, moduladores da osteoclastogênese. Dessa maneira, o objetivo deste estudo foi avaliar a expressão do RNA mensageiro (RNAm) para as enzimas envolvidas no metabolismo do ácido araquidônico, ciclooxigenase-2 (COX-2) e 5- lipoxigenase (5-LO), e para os mediadores da osteoclastogênese (RANK, RANKL e OPG) no tecido ósseo, após inoculação de lipopolissacarídeo bacteriano (LPS) nos canais radiculares de molares de camundongos. Posteriormente foi investigado o efeito do bloqueio farmacológico da via COX-2 induzida pelo LPS, na expressão de mediadores da osteoclastogênese e de genes envolvidos no metabolismo ósseo. Foram utilizados 144 camundongos C57BL/6, com 6 semanas de idade, pesando de 18 a 20 gramas, nos quais os canais radiculares dos primeiros molares foram inoculados com uma solução contendo lipopolissacarídeo bacteriano de E. coli (0,1, 1,0 e 10mg/ml). Decorridos os períodos experimentais de 7, 14, 21 e 28 dias, os animais foram submetidos à eutanásia e os blocos contendo dente e osso foram removidos para extração do RNA total. Em seguida, foi realizada a avaliação da expressão gênica por meio de transcrição reversa e reação da polimerase em cadeia em tempo real (qRT-PCR). A análise global da expressão de RNAm para proteínas envolvidas no metabolismo ósseo foi realizada por meio de um ensaio de PCR Array (Osteogenesis RT² Profiler PCR Array). Os valores de expressão relativa de cada RNAm, para cada grupo, foram comparados por meio da análise de variância (ANOVA) de duas vias seguido pelo pós-teste de Bonferroni ou por ANOVA de uma via seguido pelo pós-teste de Dunnett (&alpha = 0,05). A inoculação de LPS nos canais radiculares de molares de camundongos foi capaz de induzir a expressão dos genes PTGS2 e ALOX5, responsáveis pela codificação das enzimas COX-2 e 5-LO, envolvidas no metabolismo do ácido araquidônico, concomitantemente à modulação da expressão dos genes TNFRSF11A, TNFSF11 e TNFRSF11B, responsáveis pela codificação dos moduladores da osteoclastogênese RANK, RANKL e OPG, respectivamente. A administração de Indometacina, um inibidor não seletivo de COX-2, inibiu a expressão de RNAm para RANK e RANKL e estimulou a expressão de OPG durante os períodos iniciais de resposta à inoculação de LPS nos canais radiculares. A inibição da via COX-2 de metabolismo do ácido araquidônico nos períodos iniciais de resposta à inoculação de LPS nos canais radiculares modulou diferencialmente a expressão de genes envolvidos no catabolismo e anabolismo ósseo, indicando possíveis papéis para os mediadores derivados no ácido araquidônico na regulação do metabolismo ósseo. Estes resultados sugerem alvos terapêuticos importantes para intervenção precoce em doenças inflamatórias, como lesões periapicais para evitar a reabsorção do tecido ósseo. / During an inflammatory response, several mediators are locally released in order to stimulate cellular and humoral immune response. Through the action of cyclooxygenase and lipoxygenase enzymes structural changes occur in the arachidonic acid chain leading to synthesis of prostaglandins or leukotrienes and lipoxins, respectively. Such mediators are responsible for the regulation of RANK, RANKL and OPG gene expression, osteoclastogenesis modulators. Thus, the objective of this study was to evaluate the expression of messenger RNA (mRNA) for the enzymes involved in arachidonic acid metabolism, cyclooxygenase-2 (COX-2) and 5-lipoxygenase (5-LO), and the osteoclastogenesis mediators (RANK, RANKL and OPG) in bone tissue after injection of bacterial lipopolysaccharide (LPS) in murine dental root canals. Then, COX-2 pathway was pharmacologically blocked for investigation of expression of osteoclastogenesis mediators and genes involved in bone metabolism. We used 144 C57BL/6 mice, 6 weeks-old, weighing 18-20 grams, which had the first molars root canals inoculated with a solution containing LPS from E. coli (0.1, 1.0 and 10 mg/ml). After 7, 14, 21 and 28 days the animals were euthanized and the tooth-and-bone blocks were removed for total RNA extraction. Subsequently, the evaluation of gene expression was performed by reverse transcription and polymerase chain reaction in real time (qRT-PCR). Global analysis of mRNA expression for proteins involved in bone metabolism was performed using PCR arrays (Osteogenesis RT² Profiler PCR Array). The values for relative expression of each mRNA for each group were compared using two-way analysis of variance (ANOVA) followed by Bonferroni post-test or one-way ANOVA followed by Dunnett\'s test (&alpha;=0.05). The injection of LPS into the root canals was induced expression of genes PTGS2 and ALOX5, responsible for encoding COX-2 and 5-LO enzymes, involved in the metabolism of arachidonic acid, simultaneously to the modulation of gene expression of TNFRSF11A, TNFSF11 and TNFRSF11B, responsible for encoding the osteoclastogenesis modulators RANK, RANKL and OPG, respectively. Administration of Indomethacin, a non-selective inhibitor of COX-2, inhibited the expression of mRNA for RANK and RANKL and stimulated the expression of OPG during the initial response to the root canals contamination with LPS. Inhibition of the COX-2 pathway from arachidonic acid metabolism in the initial periods of response to LPS injection into the root canals differentially modulated the expression of genes involved in bone catabolism and anabolism, indicating possible roles for mediators derived from arachidonic acid in the regulation of bone metabolism. These results suggest important therapeutic targets for early intervention in inflammatory diseases such as apical periodontitis to avoid resorption of bone tissue.

As doenças periodontais (DP) afetam os tecidos de suporte dos dentes e são desencadeadas por micro-organismos gram-negativos anaeróbios presentes no biofilme periodontal. A evolução da doença é influenciada pela resposta inflamatória e imunológica do hospedeiro e envolve a participação de diversos tipos celulares, que atuam no micro ambiente local modulando a resposta do hospedeiro em busca do controle da infecção. Acredita-se que citocinas inflamatórias, quimiocinas e seus receptores estão envolvidos na migração celular para os tecidos periodontais, contudo, pouco se sabe sobre os mecanismos de determinação de resistência ou susceptibilidade às DP; ou no desencadeamento do dano tecidual decorrente da resposta. Neste projeto, avaliou-se o papel das células CCR5+ na DP experimental induzida pela inoculação oral de Aggregatibacter actinomycetemcomitans em camundongos C57BL/6 wild type e camundongos CCR5-knockout. Os resultados mostram que a maioria das células CCR5+ possuem fenótipo compatível com células T do subtipo Th1, devido a co-expressão de CD3 e CXCR3; além de co-expressarem RANKL. Na ausência das células CCR5+, houve uma significativa diminuição da migração de células inflamatórias totais e RANKL+ para os tecidos periodontais, diminuição da reabsorção óssea alveolar, diminuição dos níveis de expressão de citocinas pró-inflamatórias TNF&#945;-, IL-1&#946; e IFN-&#947;, assim como diminuição na expressão de MMP-1, MMP-2 e MMP-13. Sua ausência não interferiu no controle da infecção periodontal apesar da diminuição dos níveis de iNOS. Estes resultados conduzem à conclusão de que a maioria das células CCR5+ são células T do subtipo Th1, que atuam como importantes moduladoras das citocinas TNF&#945;-, IL-1&#946; e IFN-&#947;, das metaloproteinases de matriz MMP-1, MMP-2 e MMP-13, e que também expressam e modulam a expressão de RANKL, tendo participação importante na imunopatogenese da DP experimental, sem interferir no controle da infecção periodontal. Estes fatos tornam as células CCR5+ potenciais alvos para intervenção terapêutica visando ao controle das doenças periodontais. / The periodontal diseases (PD) affect the supportive tissues of the teeth and are triggered by periodontopathogens present in the dental biofilm. The clinical outcome is highly influenced by the host inflammatory and immune response with participation of many cellular types, that act in the local microenvironment modulating the host response to control the infection. Inflammatory cytokines, chemokines and its receptors are thought to be involved in the cellular migration to the periodontal tissues, but there is little knowledge about the mechanisms of determination of resistance or susceptibility to the PD and in the triggering of tissue damage by immune response components. This study evaluated the role of CCR5+ cells in the experimental PD induced by oral inoculation of Aggregatibacter actinomycetemcomitans in C57BL/6 wild type mice and CCR5-knockout mice. The phenotypic analysis of inflammatory infiltrate demonstrated that the most of CCR5+ cells coexpress CD3 and CXCR3, suggesting a phenotype compatible with Th1-type cells, and also co-express RANKL. In the absence of CCR5+ cells there was a significant overall reduction of inflammatory cells and RANKL+ cells influx to the periodontal tissues, reduction in the alveolar bone resorption, reduction in the levels of pro-inflammatory cytokines TNF&#945;-, IL-1&#946; and IFN-&#947; expression, as a reduction in the expression of MMP-1, MMP-2 and MMP-13. The absence of CCR5+ cells did not impair the control of periodontal infection, despite the reduction of iNOS levels. In conclusion, these data demonstrate that the most of CCR5+ cells are Th1 cells, which act as important modulators of TNF&#945;-, IL-1&#946; and IFN-&#947;, MMP-1, MMP- 2 and MMP-13 levels, and which also express and modulate the expression of RANKL, playing an important role in the immunopathogenesis of experimental PD, without impairing the control of periodontal infection. These facts point to CCR5+ cells as potentials targets to therapeutic interventions aimed to control periodontal diseases.

Alterações morfológicas no tecido ósseo têm sido descritas nos usuários de hipoglicemiantes orais da classe das tiazolidinedionas (TZDs). Hipotetiza-se que alguns genes relacionados com a osteogênese e osteoclastogênese podem ser influenciados pelo tratamento farmacológico, entretanto, o exato mecanismo ainda não está bem esclarecido. O objetivo do estudo foi avaliar o efeito da pioglitazona no remodelamento ósseo através de genes envolvidos na osteoclastogênese em indivíduos recentemente diagnosticados com DM2 e modelos animais, com a finalidade de identificar marcadores genéticos sensíveis de alterações ósseas. Foram convidados para participar do estudo 199 indivíduos (100 diabéticos e 99 normoglicêmicos), no ambulatório de dislipidemias do Instituto Dante Pazzanese de Cardiologia. Os indivíduos diabéticos foram tratados com pioglitazona (15, 30, 45, 45 mg/ dia/ via oral) por 16 semanas. Foram colhidas amostras de sangue, antes e após o tratamento para avaliações laboratoriais, extração de DNA genômico e de RNA total. Os polimorfismos e a expressão do mRNA nas células sanguíneas foram determinados pela PCR em tempo real através do sistema TaqMan®. Para o estudo em modelo animal após a indução da dieta hiperlipídica por 32 semanas, foram utilizados 12 camundongos machos da linhagem C57BL/J6, os quais foram divididos em três grupos: controle (n=4); diabéticos induzidos pela dieta hiperlipídica (DH, n=4) e diabéticos induzidos pela dieta hiperlipídica e tratados com pioglitazona 35mg/Kg/dia por 16 semanas (DHP, n=4). Para os grupos experimentais foram colhidos: amostras de sangue, para exames laboratoriais; fêmures, para a extração do RNA total; e tíbias, para determinação dos parâmetros histomorfométricos. Os pacientes DM2 apresentaram diminuição nas concentrações séricas de osteocalcina e na expressão de OPG e aumento na expressão de VDR em comparação ao grupo NG (p<0,05). A expressão de RANKL e IL6 foi maior entre as mulheres, enquanto que a expressão de PPARG foi maior entre os homens com DM2 em comparação ao grupo NG (p=0,032). Pacientes DM2 antes do tratamento apresentaram glicemia e expressão do mRNA de IL6 negativamente associados ao cálcio ionizado, enquanto que as transcrições de TNFA e VDR foram associadas positivamente e negativamente com bALP respectivamente (p<0,05). O tratamento com pioglitazona reduziu a glicemia de jejum, glicemia pós-prandial, insulina, HOMA-IR, triglicerídeos, VLDL-C, tALP e bALP e aumentou a HDL, tACP, TNF-&#945; e a transcrição de OPG (p<0,05). A glicemia basal associou-se positivamente com o cálcio ionizado. A expressão basal de OPG foi associado negativamente com tALP, enquanto que a expressão basal de TNFA foi associada positivamente com tALP e negativamente com tACP. A expressão basal IL6 foi associada positivamente com tALP, enquanto que a expressão basal de VDR foi associada negativamente com osteocalcina e positivamente com bALP em resposta ao tratamento (p<0,05). O polimorfismo RANK rs1805034 foi associado com redução na transcrição do gene RANK nos indivíduos DM2 e com o remodelamento ósseo após o tratamento com pioglitazona (p<0,05). O polimorfismo RANKL rs9525641 foi associado com aumento da transcrição gênica de RANKL nos indivíduos NG e DM2 e melhora da resposta farmacológica nos indivíduos DM2 tratados com pioglitazona (p<0,05). O polimorfismo rs3102735 do gene OPG foi associado com aumento da formação óssea nos indivíduos DM2 antes e após o tratamento (p<0,05). O genótipo CG do polimorfismo OPG rs2073618 foi associado com alteração da transcrição de OPG no grupo DM2 pré e pós-tratamento (p<0,05). O polimorfismo PPARG rs1801282 foi associado com menor risco para o desenvolvimento de diabetes (p<0,05). O polimorfismo PPARG rs2972162 foi associado com melhora da resistência insulínica nos indivíduos DM2 tratados com pioglitazona (p=0,017). O polimorfismo ESRI rs9340799 foi associado com redução da formação óssea nos indivíduos DM2 (p=0,038). Nos camundongos, após a indução da dieta hiperlipídica por 32 semanas, observou-se aumento do peso, da glicemia, do colesterol total, da expressão do mRNA de RANK, RANKL, IL6 e TNFA em fêmures e aumento de Tb.Sp e diminuição de BV/TV em comparação ao grupo controle (p<0,05). O tratamento com pioglitazona diminuiu a expressão de TNFA (p=0,028). As medidas histomorfométricas não alteraram-se após o tratamento (p>0,05). Os resultados sugerem que o estado hiperglicêmico e o tratamento influenciam os marcadores bioquímicos e moleculares. Os polimorfismos dos genes RANK, RANKL, OPG e ESRI parecem estar envolvidos no remodelamento ósseo independentemente da hiperglicemia e do tratamento e os polimorfismos do gene PPARG parecem estar envolvidos com menor risco para desenvolver diabetes e com a melhora da resistência insulínica em resposta ao tratamento com pioglitazona. / Morphological changes in bone tissue have been reported in users of oral hypoglycemic class of thiazolidinediones (TZDs). It is hypothesized that some genes related to osteogenesis and osteoclastogenesis may be influenced by pharmacological treatment, however, was not aware exact mechanism. The study aims was to evaluate pioglitazone effect on bone remodeling through genes involved in osteoclastogenesis in individuals newly diagnosed with DM2 and animal models, in order to identify sensibles genetics markers of bone alterations. Were invited to participate in study 199 patients (100 diabetics and 99 normoglycemic), in dyslipidemia ambulatory of Institute Dante Pazzanese of Cardiology. Diabetic subjects were treated with pioglitazone (15, 30, 45 or 45 mg /day/oral) for 16 weeks. Blood samples were collected before and after treatment for laboratory evaluations, extraction of genomic DNA and total RNA. Polymorphisms and mRNA expression in blood cells was determined by real time PCR using TaqMan® system. For study in animal model after 32 weeks of fat diet induction, was used 12 male mice C57BL/J6, which were divided into three groups: control (n=4); induced diabetic fat diet (DH, n=4) and induced diabetic fat diet and treated with pioglitazone 35mg/Kg/day for 16 weeks (DHP, n=4). For experimental groups were collected: blood samples for laboratory tests; femurs, for extraction of total RNA; and tibias, to determine histomorphometric parameters. DM2 patients showed decrease in serum osteocalcin and OPG expression and increased VDR expression compared to NG group (p<0.05). RANKL and IL6 expression were higher among women, whereas PPARG expression was higher among men with DM2 compared to NG group (p=0,032). DM2 patients before treatment showed blood glucose and IL6 mRNA expression negatively associated with ionized calcium, whereas TNFA and VDR transcription are positively and negatively associated with bALP respectively (p<0.05). Pioglitazone treatment reduced fasting glucose, postprandial glucose, insulin, HOMA-IR, triglycerides, VLDL-C, tALP and bALP and increased HDL, tACP, TNF-&#945; and OPG transcription (p<0.05). Basal blood glucose was positively associated with ionized calcium. Basal OPG expression was negatively associated with tALP, whereas basal TNFA expression was positively associated with tALP and negatively with tACP. Basal IL6 expression was positively associated with tALP, whereas basal VDR expression was negatively associated with osteocalcin and positively with bALP in response to treatment (p<0.05). RANK rs1805034 polymorphism was associated with RANK gene transcription reduction in subjects with DM2 and bone remodeling after treatment with pioglitazone (p<0.05). RANKL rs9525641 polymorphism was associated with increased RANKL gene transcription in NG and DM2 subjects and pharmacological response improvement in DM2 subjects treated with pioglitazone (p<0.05). OPG rs3102735polymorphism was associated with increased bone formation in DM2 subjects before and after treatment (p<0.05). CG genotype of OPG rs2073618 polymorphism was associated with OPG transcription change in DM2 group before and after treatment (p<0.05). PPARG rs1801282 polymorphism was associated with lower risk for diabetes development (p<0.05). PPARG rs2972162 polymorphism was associated with insulin resistance improvement in DM2 subjects treated with pioglitazone (p=0,017). ESRI rs9340799 polymorphism was associated with reduced bone formation in DM2 subjects (p=0,038). In mice, after 32 weeks of fat diet induction, was observed increase weight, blood glucose, total cholesterol and RANK, RANKL, IL6 and TNFA mRNA expression in femurs and Tb.Sp increase and BV/TV decrease compared to control group (p<0.05). Treatment with pioglitazone decrease TNFA (p=0,028). Histomorphometrics measurements not change after treatment (p>0.05). Results suggest that hyperglycemic state and treatment influence biochemical and molecular markers. RANK, RANKL, OPG and ESRI polymorphisms seens to be involved in bone remodeling regardless of hyperglycemia and treatment and PPARG gene polymorphisms seens to be associated with lower risk for diabetes development and with insulin resistance improvement in response to treatment with pioglitazone.

Alors que les phases de résorption et de couplage du cycle de remodelage de l’os sont de plus en plus connues et ont permis le développement d’agents thérapeutiques, la phase d’activation reste peu étudiée. L’objectif global de ce travail est d’analyser les évènements cellulaires mis en jeu au cours de la phase d’activation du remodelage de l’os. Les objectifs spécifiques ont été 1- de caractériser le trafic cellulaire dans le périoste au cours de la phase d’activation du remodelage et 2- d’étudier le rôle d’une enzyme, la nicotinamide phosphorybosyl transférase (Nampt) dans ces évènements. Dans notre premier travail, nous montrons dans un modèle de remodelage synchronisé de l’os alvéolaire, une expression précoce de ICAM-1 par les vaisseaux qui serait impliquée dans la diapédèse observée de monocyte-macrophages CD68+. Ces cellules migreraient à travers le compartiment non ostéogénique puis ostéogénique, guidées par des cellules de type fibroblastes puis des OB exprimant VCAM-1. Le nombre des cellules RANKL+ dans le compartiment ostéogénique augmente graduellement lors de la phase d’activation. En parallèle, l’expression de la sémaphorine 3a, qui inhibe l’ostéoclastogénèse, diminue chez les OB et les ostéocytes superficiels. Dans notre second travail, nous trouvons que l’expression basale de la Nampt est accrue dans les cellules de la couche ostéogénique au cours de la phase d’activation du remodelage. Inhiber son activité via le FK866 permet de diminuer l’ostéoclastogenèse indiquant que la Nampt serait impliquée dans le recrutement et l’activité des OC. En culture primaire d’ostéoblastes murins, nous montrons que son expression augmente au cours de la différentiation et qu’elle régule l’expression de marqueurs tardifs de différentiation. L’ensemble de ces données montre une série d’évènements coordonnés qui servent au recrutement des précurseurs ostéoclastiques et à leur migration vers la surface osseuse à résorber. La Nampt semble jouer un rôle dans l’acquisition des ostéoblastes d’un phénotype favorable à ces évènements. / Resorption and inversion phases of bone remodeling are well understood, which have permitted the development of therapeutic agents. At the opposite, activation phase remains poorly characterized. This work aims to analyze cellular events involved in the activation phase of bone remodeling. Specific goals were: 1- To characterize cellular traffic in the periosteum during the activation phase of bone remodeling. 2- To study the role of NicotinAMide Phosphorybosyl Transférase (NAMPT) enzyme during activation. In the first study, we show an early expression of ICAM-1 by vessels in a synchronized alveolar-bone-remodeling model. The ICAM-1 expression may be involved in the observed diapedesis of monocytes – macrophages CD68+. These cells migrate through non osteogenic and osteogenic layers, steered by fibroblast-like cells and then by VCAM+ osteoblasts (OB). The number of RANKL+ cells in osteogenic layer gradually increases during the activation phase. Simultaneously, the expression of semaphorine 3a inhibiting osteoclastogenesis, decreases in osteoblasts and superficial osteocytes. In the second study, we show that basal expression of NAMPT increases in osteogenic-layer cells during the activation phase of bone remodeling. Inhibiting its activity with FK866 enhables to decrease osteoclastogenesis, suggesting an involvement of NAMPT in osteoclast recruitment and activity. In primary culture of murine OB, we show that NAMPT expression increases during differentiation. It also regulates OB late-differentiation markers expression. All these data show a series of coordinated events which serve in osteoclasts precursors’ recruitment and migration towards bone surface. NAMPT seems to contribute to acquiring an OB phenotype more favorable to OC recruitment.