Retinale Venenverschlüsse sind eine der häufigsten vaskulären Netzhauterkrankungen. Bei der Entstehung und dem Verlauf von venösen Gefäßverschlüssen im Auge spielen kardiovaskuläre Risikofaktoren eine entscheidende Rolle. Patienten mit einem retinalen Venenverschluss weisen vermehrt vaskuläre Risikofaktoren für arterielle Gefäßkrankheiten auf, weswegen es von hoher klinischer Relevanz ist, diese frühzeitig zu erkennen und zu behandeln. Bisher gibt es kein einheitliches Untersuchungsschema zur Ursachenabklärung eines retinalen Venenverschlusses. Ziel ist es, Empfehlungen einer zukünftigen Routinediagnostik für venöse Gefäßverschlüsse im Auge auszusprechen. In der FIND-AF-EYE-Studie wurde erstmals durch eine umfangreiche Diagnostik an insgesamt 101 Patienten mit retinalen Gefäßverschlüssen eine systematische Abklärung kardiovaskulärer Risikofaktoren kontrolliert durchgeführt. Die Diagnostik umfasste eine duplexsonographische Untersuchung der A. carotis, eine Echokardiographie, eine 24 h-Blutdruckmessung, ein 7 d-LZ-EKG und eine laborchemische Erhebung des Lipid- und Glukosestatus. Bei der Auswertung der 41 Patienten mit venösen Gefäßverschlüssen im Auge konnte wie auch in vergleichbaren Studien gezeigt werden, dass vor allem die arterielle Hypertonie, der Nikotinkonsum, die Hyperlipidämie und der Diabetes mellitus die wichtigsten kardiovaskulären Risikofaktoren darstellen. Zudem wurde durch die verlängerte elektrokardiographische Aufzeichnungsdauer über sieben Tage mehr als ein Drittel aller Patienten mit Herzrhythmusstörungen identifiziert. Anhand der Ergebnisse der vorliegenden Studie sind apparative Untersuchungen wie eine 24 h-Blutdruckmessung, eine Echokardiographie und ein 7-Tage-Langzeit-EKG unverzichtbar. Laborchemisch sollten ein Lipidstatus und ein Blutzuckerprofil routinemäßig erhoben werden. Zur Einschätzung des kardiovaskulären Risikos des Patienten erscheint eine Untersuchung der A. carotis sinnvoll. Um die Morbidität und die Mortalität zu senken bedarf es einer interdisziplinären Ursachenabklärung, welches die enge Zusammenarbeit zwischen Ophthalmologen und Internisten erfordert. Vergleicht man die FIND-AF-EYE-Studie mit der bereits publizierten FIND-AF-Studie litten die Patienten der FIND-AF-Studie signifikant häufiger an einer Karotisstenose. Zusammenfassend lässt sich sagen, dass akuten arteriellen Verschlüssen, wie beispielsweise einer zerebralen Ischämie, in den meisten Fällen thromboembolische Ereignisse zugrunde liegen. Kardiovaskuläre Risikofaktoren spielen aber auch bei venösen Gefäßverschlüssen im Auge eine wichtige Rolle. Hierbei führen sie zu arteriosklerotischen Veränderungen der eng benachbarten Zentralarterie. Durch die Kompression kommt es somit zur Thrombenbildung in der Zentralvene.

Müller cells are major glial cells in the retina and have a broad range of functions that are vital for the retinal neurons. During retinal injury gliotic response either leads to Müller cell dedifferentiation and formation of a retinal progenitor or to maintenance of mature Müller cell functions. The overall aim of this thesis was to investigate the intra- and extracellular signaling of Müller cells, to understand how Müller cells communicate during an injury and how their properties can be regulated after injury. Focus has been on the α2-adrenergic receptor (α2-ADR) and endothelin receptor (EDNR)-induced modulation of Müller cell-properties after injury. The results show that α2-ADR stimulation by brimonidine (BMD) triggers Src-kinase mediated ligand-dependent and ligand-independent transactivation of epidermal growth factor receptor (EGFR) in both chicken and human Müller cells. The effects of this transactivation in injured retina attenuate injury-induced activation and dedifferentiation of Müller cells by attenuating injury-induced ERK signaling. The attenuation was concomitant with a synergistic up-regulation of negative ERK- and RTK-feedback regulators during injury. The data suggest that adrenergic stress-signals modulate glial responses during retinal injury and that α2-ADR pharmacology can be used to modulate glial injury-response. We studied the effects of this attenuation of Müller cell dedifferentiation on injured retina from the perspective of neuroprotection. We analyzed retinal ganglion cell (RGC) survival after α2-ADR stimulation of excitotoxically injured chicken retina and our results show that α2-ADR stimulation protects RGCs against the excitotoxic injury. We propose that α2-ADR-induced protection of RGCs in injured retina is due to enhancing the attenuation of the glial injury response and to sustaining mature glial functions. Moreover, we studied endothelin-induced intracellular signaling in Müller cells and our results show that stimulation of EDNRB transactivates EGFR in Müller cells in a similar way as seen after α2-ADR stimulation. These results outline a mechanism of how injury-induced endothelins may modulate the gliotic responses of Müller cells. The results obtained in this thesis are pivotal and provide new insights into glial functions, thereby uncovering possibilities to target Müller cells by designing neuroprotective treatments of retinal degenerative diseases or acute retinal injury.

The eye is our window to the world. Human vision has therefore been extensively studied over the years. However, in-depth studies are often either limited to our central visual field, or, when extended to the periphery, only correct optical errors related to a narrow spectrum of light. This thesis extends the current knowledge by considering the full visible spectrum over a wide visual field. A broad spectrum means that the wavelength dependence of light propagation inside the eye has to be considered; the optics of the eye will therefore not form a retinal image in the same location for all wavelengths, a phenomenon called chromatic aberration. We present here a new methodology to objectively measure the magnitude of transverse chromatic aberration (TCA) across the visual field of the human eye, and show that the ocular TCA increases linearly with off-axis angle (about 0.21 arcmin per degree for the spectral range from 543 nm to 842 nm). Moreover, we have implemented adaptive psychophysical methods to quantify the impact of TCA on central and peripheral vision. We have found that inducing additional TCA degrades peripheral grating detection acuity more than foveal resolution acuity (more than 0.05 logMAR per arcmin of induced TCA peripherally compared to 0.03 logMAR/arcmin foveally). As stimuli to evaluate peripheral vision, we recommend gratings that are obliquely-oriented relative to the visual field meridian. The results of this thesis have clinical relevance for improving peripheral vision and are equally important for retinal imaging techniques. To limit the negative impacts of TCA on vision, inducing additional TCA should be avoided when the peripheral refractive errors are to be corrected, such as for people suffering from macular degeneration and central visual field loss. In retinal imaging applications, TCA leads to lateral offsets when imaging is performed in more than one wavelength. Consequently, the measurement of TCA together with careful pupil alignment and subsequent compensation can improve the functionality of these instruments. / Ögat är vårt fönster mot världen, och syn har mätts och studerats i stor utsträckning över åren. Trots detta är forskningen om mänsklig syn oftast begränsad till det centrala synfältet, och i studier av det perifera synfältet korrigeras optiska fel endast över ett smalt våglängdsområde. Denna avhandling vidgar forskningen om vår syn till att inkludera hela det synliga spektrumet över ett stort synfält. Ett brett spektrum innebär att vi måste ta hänsyn till våglängdsberoendet i ljusets brytning i ögat; ögats optik kan därför inte avbilda ett objekt till samma bildläge på näthinnan för alla våglängder, ett fenomen som kallas kromatisk aberration. Vi presenterar här en ny metod för att mäta mängden transversell kromatisk aberration (TCA) över ögats synfält och visar att ögats TCA ökar linjärt med vinkeln ut i synfältet (ungefär 0,21 bågminuter per grad från 543 nm till 842 nm). Dessutom har vi implementerat adaptiva psykofysiska mätmetoder för att kvantifiera effekten av TCA på central och perifer syn. Våra resultat visar att extra inducerad TCA påverkar den perifera förmågan att upptäcka sinusformade randmönster mer än den centrala förmågan att upplösa motsvarande ränder (mer än 0,05 logMAR per bågminut inducerad TCA i periferin jämfört med 0,03 logMAR/bågminut centralt). Vid utvärdering av perifer syn rekommenderar vi att använda sinusformade randmönster med en sned riktning jämfört med synfältsmeridianen. Resultaten som presenteras i avhandlingen har klinisk betydelse för att förbättra den perifera synen och är även viktiga för tekniker som avbildar ögats näthinna. För att begränsa den negativa effekt TCA har på synen ska man undvika att inducera extra TCA, t.e.x. när ögats perifera refraktiva fel korrigeras med glasögon för människor med makula degeneration och centralt synfältsbortfall. Vid avbildning av näthinnan ger ögats TCA förskjutningar mellan bilder i olika våglängder. Därför kan mätningar av TCA, tillsammans med välkontrollerad linjering av pupillens position och efterföljande kompensation, förbättra funktionen hos dessa instrument. / <p>QC 20160511</p>

One strategy to restore vision in retinitis pigmentosa and related retinal degenerations is by cell replacement. Typically, patients lose vision when the outer retinal photoreceptor layer is lost, and so the therapeutic ideal would be to restore vision at this stage of disease. It is not currently known if a degenerate retina lacking the outer nuclear layer of photoreceptor cells would allow the survival, maturation and reconnection of replacement photoreceptors, as prior studies used hosts with a pre-existing outer nuclear layer at the time of treatment. Here, using a murine model of severe human retinitis pigmentosa at a stage when no host rod cells remain, transplanted rod precursors are shown to reform an anatomically distinct and appropriately polarised outer nuclear layer. A trilaminar nuclear organisation is returned to the rd1 hosts that had only two retinal layers before treatment. The newly introduced rod precursor cells were able to resume their developmental programme in the degenerate host niche to become mature rods with light- sensitive outer segments, and reconnected with host neurons downstream. Visual function, assayed in the same animals before and after transplantation, was restored in animals with zero rod function at baseline. These observations suggest that a cell therapy approach may reconstitute a light-sensitive cell layer de novo and hence repair a structurally damaged visual circuit. Rather than placing discrete photoreceptors amongst pre-existing host outer retinal cells, total photoreceptor layer reconstruction may provide a clinically relevant model to investigate cell-based strategies for retinal repair.

Les neuropathies optiques héréditaires se caractérisent par une dégénérescence des cellules ganglionnaires de la rétine entraînant une perte visuelle modérée voire la cécité. L'atrophie optique dominante (AOD) ou maladie de Kjer et la neuropathie optique de Leber (NOHL), sont les deux formes les plus fréquentes. Il existe quatre loci d'AOD mais seulement deux gènes identifiés : OPA1 et OPA3 codant des protéines mitochondriales. La NOHL est due à des mutations de l'ADN mitochondrial (ADNmt). Aucun traitement n'existe pour soigner ces pathologies ou ralentir leur progression. Nous nous sommes intéressés au gène YWHAH, situé au locus OPA5, codant la protéine 14-3-3eta, un des gènes majoritairement exprimés dans les GCRs. Le criblage de YWHAH dans des banques d'ADNs de patients exempts de mutation dans OPA1, OPA3 et l'ADNmt a permis d'identifier deux mutations hétérozygotes chez des patients présentant une AOD et une surdité profonde.14-3-3eta joue un rôle de protection dans l'apoptose. En effet, les fibroblastes de patients et des cellules surexprimant une 14-3-3eta mutée s'avèrent moins résistants à un stress apoptotique. Pour évaluer l'effet des mutations de 14-3-3eta sur la fonction visuelle et auditive nous avons généré une souris reproduisant une mutation humaine. Les souris 14-3-3eta hétéro et homozygotes ont une atteinte auditive de 15 à 20 décibels dès 2 mois, et seules les souris homozygotes présentent une altération de la fonction visuelle à partir de 12 mois affectant les interneurones et les photorécepteurs de la rétine. La souris mutante présente un phénotype moins grave que chez l'homme, mais son étude permet d'impliquer 14-3-3eta dans des atteintes neurosensorielles / Inherited Optic Neuropathies (ION) are characterized by the degeneration of the Retinal Ganglion Cells (RGCs), leading to moderate visual loss or legal blindness. Dominant Optic Atrophy or Kjer disease (DOA) and Leber Hereditary Optic Neuropathy (LHON) are the most common forms of IONs. There are four loci for DOA, but only two genes have been identified: OPA1 and OPA3 encoding mitochondrial proteins. LHON is caused by mitochondrial DNA (mtDNA) mutations. There is no treatment to cure these diseases or slow down their progression. In order to identify new genes responsible for DOA, our team was interested in the YWHAH gene localized at the OPA5 locus, coding the 14-3-3eta protein, a gene strongly expressed in RGCs. The screening of YWHAH in DNAs without mutation in OPA1, OPA3 and mtDNA allowed us to identify two heterozygous mutations in patients presenting a DOA associated to a severe deafness.As 14-3-3eta plays a role in apoptosis, we studied patient fibroblasts and found that they present a marked susceptibility to apoptosis. Moreover, the mutated alleles of 14-3-3eta lost their ability to confer resistance to cell death. In order to evaluate the effects of the 14-3-3eta mutations on the visual and auditory functions, we have generated an animal model mimicking a human mutation. The 14-3-3eta hetero and homozygous mice present a stable auditory impairment of 15 to 20 decibels, whereas only the homozygous mice present an alteration of the visual function at 12 months, with affected interneurones and photoreceptors. Even if the mutant mouse does not present a phenotype as dramatic as in human, its study shed light on 14-3-3eta involvement in neuronsensorial functions

Le système nerveux central est un organe privilégié et protégé, notamment grâce à l’existence des barrières histologiques entre le sang et les tissus nerveux. La barrière-hémato encéphalique (BHE) et la barrière hémato-rétinienne (BHR) séparent respectivement le parenchyme cérébral et la rétine des composés contenus dans l’espace vasculaire, grâce à l’expression de jonctions serrées et de transporteurs membranaires permettant une régulation spécifique des échanges entre le sang et le parenchyme nerveux. Ce travail a porté sur l’étude d’un nouveau transporteur de cations organiques mis en évidence fonctionnellement à la BHE de la souris. Ce transporteur appartenant très probablement à la superfamille des solute carrier (SLC), fonctionne comme un antiport proton. Actuellement, sa présence ne peut être démontrée que de façon fonctionnelle car son identité moléculaire est encore inconnue. Cet antiport proton constitue un nouvel acteur de la perméabilité cérébrale et ouvre une nouvelle voie d’accès au cerveau. Nous nous sommes tout d’abord attachés à approfondir les connaissances fonctionnelles de ce transporteur en étudiant de nouveaux substrats et tissus d’expression. Le transport cérébral de psychotropes a été étudié in vivo par la technique de perfusion carotidienne in situ chez la souris et in vitro grâce à une lignée de cellules endothéliales cérébrales humaines immortalisées (hCMEC/D3). Nous avons démontré que la haute perméabilité cérébrale de la cocaïne fait intervenir à la fois une diffusion passive et surtout une diffusion médiée par un antiport proton. La vitesse d’entrée des substances d’abus dans le cerveau est associée à un plus fort risque d’addiction et fait de ce transporteur un nouvel acteur critique de la régulation du passage cérébral. En effet, d’autres substances comme la nicotine et certaines amphétamines comme le MDPV et l'ecstasy sont également des substrats de cet antiport. Ce transporteur apparaît comme une cible pharmacologique potentielle dans la prise en charge de toxicomanies. Malgré la diversité chimique et pharmacologique d’interactions des composés avec cet antiport, les concentrations nécessaires pour l’inhiber dépassent celles retrouvées dans le sang. Pour aider l’identification d’inhibiteurs sélectifs et efficaces nous avons développé un modèle pharmacophorique d’inhibiteurs du transporteur à partir de données générées in vitro et de l’approche FLAPpharm. Ce modèle semble prédictif de nouveaux composés pouvant constituer de meilleurs inhibiteurs de ce transporteur. L’étude des échanges in vivo au niveau du tissu nerveux nous a menés à étudier l’impact de transporteurs ABC et de l’antiport-proton au niveau cérébral et rétinien à l’aide de substances spécifiques ou de substrats mixtes comme le vérapamil. L’antiport proton est fonctionnel au niveau de la BHR et transporte notamment la clonidine, le DPH et le vérapamil. Cependant, dans le cas d’un substrat mixte P-gp et SLC (ex : vérapamil), ce transport d’influx n’est visible à la BHE que lorsque la P-gp est neutralisée. Au contraire, à la BHR l’influx lié à cet SLC est visible naturellement. L’impact de la P-gp à la BHR étant 6.3-fois plus faible ce processus est probablement moins masqué. Cette étude illustre la difficulté actuelle de prédire l’impact fonctionnel d’un transporteur pour des substrats multi-spécifiques et l’existence d’une priorisation du transport. Enfin, nous avons essayé d’identifier l’antiport proton au niveau moléculaire par une méthode de photo-activation à l’aide d’un composé adapté. Cette méthode s’est avérée efficace pour fixer une molécule sur le transporteur, permettant par la suite de l’isoler plus facilement. En conclusion, ce travail a permis de mettre en évidence l’importance de l’antiport proton dans la distribution cérébrale de psychotropes et d’ouvrir de nouvelles perspectives dans l’addiction et la compréhension du transport de substrats multi-spécifiques. / The central nervous system is a privilege organ protected by histological barriers between the blood and the nervous tissue. The blood-brain barrier (BBB) and the blood-retinal barrier (BRB) separate cerebral parenchyma and retina from the circulating blood and both express tight junctions and membrane transporters, allowing a precise regulation of the exchanges between the blood and nervous tissues. We studied a new cationic transporter functionally evidenced at the mouse BBB. This molecularly unknown transporter belong to the solute carrier super family (SLC) and is a proton antiporter. It could constitute a new actor in the cerebral permeability and may be a new brain access pathway. First, we worked on the functional identification studying new substrates and new localization. Psychotropic brain transport was studied in vivo by brain in situ perfusion on mouse and in vitro with human immortalized endothelial cells (hCMEC/D3). We showed that cocaine brain entry depends on passive diffusion but also mainly on a proton antiporter. Brain entry rate of drugs of abuse is associated with modulation of addiction liability, making this transporter a new component of brain entry of cocaine, and also nicotine and some amphetamines such as ecstasy and MDPV. This proton antiporter appears to be a new potential target in addiction. Various chemical entities interact with this transporter; however concentrations used to inhibit the transporter are much higher than the one possibly found in the blood. In order to help find or design new selective and potent inhibitors, we developed a pharmacophore model of the proton antiporter inhibitors using in vitro data and the FLAPpharm approach. The model predicts well new possible inhibitors of this transporter. We also studied the impact of the ABC transporters and the proton antiporter at the BBB and the BRB using specific or multi-specific substrates such as verapamil. The proton antiporter is functionally expressed at the BRB and transports clonidine, DPH and verapamil. However, for the multi-specific (P-gp and SLC) compound verapamil, influx transport by the proton antiporter is visible at the BBB only when P-gp efflux is neutralized. On the contrary, at the BRB, the proton antiporter influx is always visible. This is certainly due to the lower impact (by 6.3 fold) of P-gp at the BRB compared to the BBB. These results show the difficulty to predict the functional impact of a transporter for multi-specific compounds and a probable transport prioritization. Finally we worked on the molecular identification of the proton antiporter using a photolabeling method. This work evidenced the importance of the proton antiporter in the brain distribution of psychotropic and drugs of abuse and opened toward new perspectives in addiction and transport comprehension.

Le système nerveux central est un organe privilégié et protégé, notamment grâce à l’existence des barrières histologiques entre le sang et les tissus nerveux. La barrière-hémato encéphalique (BHE) et la barrière hémato-rétinienne (BHR) séparent respectivement le parenchyme cérébral et la rétine des composés contenus dans l’espace vasculaire, grâce à l’expression de jonctions serrées et de transporteurs membranaires permettant une régulation spécifique des échanges entre le sang et le parenchyme nerveux. Ce travail a porté sur l’étude d’un nouveau transporteur de cations organiques mis en évidence fonctionnellement à la BHE de la souris. Ce transporteur appartenant très probablement à la superfamille des solute carrier (SLC), fonctionne comme un antiport proton. Actuellement, sa présence ne peut être démontrée que de façon fonctionnelle car son identité moléculaire est encore inconnue. Cet antiport proton constitue un nouvel acteur de la perméabilité cérébrale et ouvre une nouvelle voie d’accès au cerveau. Nous nous sommes tout d’abord attachés à approfondir les connaissances fonctionnelles de ce transporteur en étudiant de nouveaux substrats et tissus d’expression. Le transport cérébral de psychotropes a été étudié in vivo par la technique de perfusion carotidienne in situ chez la souris et in vitro grâce à une lignée de cellules endothéliales cérébrales humaines immortalisées (hCMEC/D3). Nous avons démontré que la haute perméabilité cérébrale de la cocaïne fait intervenir à la fois une diffusion passive et surtout une diffusion médiée par un antiport proton. La vitesse d’entrée des substances d’abus dans le cerveau est associée à un plus fort risque d’addiction et fait de ce transporteur un nouvel acteur critique de la régulation du passage cérébral. En effet, d’autres substances comme la nicotine et certaines amphétamines comme le MDPV et l'ecstasy sont également des substrats de cet antiport. Ce transporteur apparaît comme une cible pharmacologique potentielle dans la prise en charge de toxicomanies. Malgré la diversité chimique et pharmacologique d’interactions des composés avec cet antiport, les concentrations nécessaires pour l’inhiber dépassent celles retrouvées dans le sang. Pour aider l’identification d’inhibiteurs sélectifs et efficaces nous avons développé un modèle pharmacophorique d’inhibiteurs du transporteur à partir de données générées in vitro et de l’approche FLAPpharm. Ce modèle semble prédictif de nouveaux composés pouvant constituer de meilleurs inhibiteurs de ce transporteur. L’étude des échanges in vivo au niveau du tissu nerveux nous a menés à étudier l’impact de transporteurs ABC et de l’antiport-proton au niveau cérébral et rétinien à l’aide de substances spécifiques ou de substrats mixtes comme le vérapamil. L’antiport proton est fonctionnel au niveau de la BHR et transporte notamment la clonidine, le DPH et le vérapamil. Cependant, dans le cas d’un substrat mixte P-gp et SLC (ex : vérapamil), ce transport d’influx n’est visible à la BHE que lorsque la P-gp est neutralisée. Au contraire, à la BHR l’influx lié à cet SLC est visible naturellement. L’impact de la P-gp à la BHR étant 6.3-fois plus faible ce processus est probablement moins masqué. Cette étude illustre la difficulté actuelle de prédire l’impact fonctionnel d’un transporteur pour des substrats multi-spécifiques et l’existence d’une priorisation du transport. Enfin, nous avons essayé d’identifier l’antiport proton au niveau moléculaire par une méthode de photo-activation à l’aide d’un composé adapté. Cette méthode s’est avérée efficace pour fixer une molécule sur le transporteur, permettant par la suite de l’isoler plus facilement. En conclusion, ce travail a permis de mettre en évidence l’importance de l’antiport proton dans la distribution cérébrale de psychotropes et d’ouvrir de nouvelles perspectives dans l’addiction et la compréhension du transport de substrats multi-spécifiques. / The central nervous system is a privilege organ protected by histological barriers between the blood and the nervous tissue. The blood-brain barrier (BBB) and the blood-retinal barrier (BRB) separate cerebral parenchyma and retina from the circulating blood and both express tight junctions and membrane transporters, allowing a precise regulation of the exchanges between the blood and nervous tissues. We studied a new cationic transporter functionally evidenced at the mouse BBB. This molecularly unknown transporter belong to the solute carrier super family (SLC) and is a proton antiporter. It could constitute a new actor in the cerebral permeability and may be a new brain access pathway. First, we worked on the functional identification studying new substrates and new localization. Psychotropic brain transport was studied in vivo by brain in situ perfusion on mouse and in vitro with human immortalized endothelial cells (hCMEC/D3). We showed that cocaine brain entry depends on passive diffusion but also mainly on a proton antiporter. Brain entry rate of drugs of abuse is associated with modulation of addiction liability, making this transporter a new component of brain entry of cocaine, and also nicotine and some amphetamines such as ecstasy and MDPV. This proton antiporter appears to be a new potential target in addiction. Various chemical entities interact with this transporter; however concentrations used to inhibit the transporter are much higher than the one possibly found in the blood. In order to help find or design new selective and potent inhibitors, we developed a pharmacophore model of the proton antiporter inhibitors using in vitro data and the FLAPpharm approach. The model predicts well new possible inhibitors of this transporter. We also studied the impact of the ABC transporters and the proton antiporter at the BBB and the BRB using specific or multi-specific substrates such as verapamil. The proton antiporter is functionally expressed at the BRB and transports clonidine, DPH and verapamil. However, for the multi-specific (P-gp and SLC) compound verapamil, influx transport by the proton antiporter is visible at the BBB only when P-gp efflux is neutralized. On the contrary, at the BRB, the proton antiporter influx is always visible. This is certainly due to the lower impact (by 6.3 fold) of P-gp at the BRB compared to the BBB. These results show the difficulty to predict the functional impact of a transporter for multi-specific compounds and a probable transport prioritization. Finally we worked on the molecular identification of the proton antiporter using a photolabeling method. This work evidenced the importance of the proton antiporter in the brain distribution of psychotropic and drugs of abuse and opened toward new perspectives in addiction and transport comprehension.

Thèse numérisée par la Division de la gestion de documents et des archives de l'Université de Montréal.

La détérioration de la barrière hémato rétinienne et l'oedème maculaire consécutif est une manifestation cardinale de la rétinopathie diabétique (RD) et la caractéristique clinique la plus étroitement associée à la perte de la vue. Alors que l'oedème maculaire affecte plus de 25% des patients souffrant de diabète, les modalités de traitement actuellement disponibles tels que les corticostéroïdes administrés localement et les thérapies anti-VEGF récemment approuvés présentent plusieurs inconvénients. Bien que le lien entre une rupture de l’unité neuro-vasculaire et la pathogénèse de la RD ait récemment été établi, l’influence de la signalisation neuro-vasculaire sur la vasculopathie oculaire diabetique a jusqu’à présent reçu peu d’attention. Ici, à l’aide d’ètudes humaines et animales, nous fournissons la première preuve du rôle essentiel de la molécule de guidage neuronale classique Sémaphorine 3A dans l’instigation de la perméabilité vasculaire maculaire pathologique dans le diabète de type 1. L’étude de la dynamique d’expression de Sémaphorine 3A révèle que cette dernière est induite dans les phases précoces hyperglycèmiques du diabète dans la rétine neuronale et participe à la rupture initiale de la fonction de barrière endothéliale. En utilisant le modèle de souris streptozotocine pour simuler la rétinopathie diabétique humaine, nous avons démontré par une série d’approches analogue que la neutralisation de Sémaphorine 3A empêche de façon efficace une fuite vasculaire rétinienne. Nos résultats identifient une nouvelle cible thérapeutique pour l’oedème maculaire diabétique en plus de fournir d’autres preuves de communication neuro-vasculaire dans la pathogènese de la RD. / The deterioration of the blood retinal barrier and consequent macular edema is a cardinal manifestation of diabetic retinopathy (DR) and the clinical feature most closely associated with loss of sight. While macular edema affects over 25% of patients suffering from diabetes, currently available treatment modalities such as locally administered corticosteroids and recently approved anti-VEGF therapies, present several drawbacks. Although recent insight on the pathogenesis of DR points to a breakdown in the neurovascular unit, neurovascular cross-talk and its influence on diabetic ocular vasculopathy has thus far received limited attention. Here we provide the first evidence from both human and animal studies for the critical role of the classical neuronal guidance cue Semaphorin3A in instigating pathological macular vascular permeability in type I diabetes. Investigation of the dynamics of expression reveal that Semaphorin3A is induced in the early hyperglycemic phases of diabetes within the neuronal retina and precipitates initial breakdown of endothelial barrier function. Using the streptozotocin mouse model as a proxy for human diabetic retinopathy, we demonstrate by a series of orthogonal approaches (gene silencing or treatment with soluble Neuropilin-1 employed as a Semaphorin3A trap), that neutralization of Semaphorin3A efficiently prevents retinal vascular leakage. Our findings identify a new therapeutic target for DME and provide further evidence for neurovascular cross-talk in pathogenesis of DR.

Le glaucome est la première cause de cécité irréversible à travers le monde. À présent il n’existe aucun remède au glaucome, et les thérapies adoptées sont souvent inadéquates. La perte de vision causée par le glaucome est due à la mort sélective des cellules rétiniennes ganglionnaires, les neurones qui envoient de l’information visuelle de la rétine au cerveau. Le mécanisme principal menant au dommage des cellules rétiniennes ganglionnaires lors du glaucome n’est pas bien compris, mais quelques responsables putatifs ont été proposés tels que l’excitotoxicité, le manque de neurotrophines, la compression mécanique, l’ischémie, les astrocytes réactifs et le stress oxidatif, parmis d’autres. Indépendamment de la cause, il est bien établi que la perte des cellules rétiniennes ganglionnaires lors du glaucome est causée par la mort cellulaire programmée apoptotique. Cependant, les mécanismes moléculaires précis qui déclenchent l’apoptose dans les cellules rétiniennes ganglionnaires adultes sont mal définis. Pour aborder ce point, j’ai avancé l’hypothèse centrale que l’identification de voies de signalisations moléculaires impliquées dans la mort apoptotique des cellules rétiniennes ganglionnaires offrirait des avenues thérapeutiques pour ralentir ou même prévenir la mort de celles-ci lors de neuropathies oculaires telles que le glaucome. Dans la première partie de ma thèse, j’ai caractérisé le rôle de la famille de protéines stimulatrices d’apoptose de p53 (ASPP), protéines régulatrices de la famille p53, dans la mort apoptotique des cellules rétiniennes ganglionnaires. p53 est un facteur de transcription nucléaire impliqué dans des fonctions cellulaires variant de la transcription à l’apoptose. Les membres de la famille ASPP, soit ASPP1, ASPP2 et iASPP, sont des protéines de liaison de p53 qui régulent l’apoptose. Pourtant, le rôle de la famille des ASPP dans la mort des cellules rétiniennes ganglionnaires est inconnu. ASPP1 et ASPP2 étant pro-apoptotiques, l’hypothèse de cette première étude est que la baisse ciblée de ASPP1 et ASPP2 promouvrait la survie des cellules rétiniennes ganglionnaires après une blessure du nerf optique. Nous avons utilisé un modèle expérimental bien caractérisé de mort apoptotique neuronale induite par axotomie du nerf optique chez le rat de type Sprague Dawley. Les résultats de cette étude (Wilson et al. Journal of Neuroscience, 2013) ont démontré que p53 est impliqué dans la mort apoptotique des cellules rétiniennes ganglionnaires, et qu’une baisse ciblée de ASPP1 et ASPP2 par acide ribonucléique d’interference promeut la survie des cellules rétiniennes ganglionnaires. Dans la deuxième partie de ma thèse, j’ai caractérisé le rôle d’iASPP, le membre anti-apoptotique de la famille des ASPP, dans la mort apoptotique des cellules rétiniennes ganglionnaires. L’hypothèse de cette seconde étude est que la surexpression d’iASPP promouvrait la survie des cellules rétiniennes ganglionnaires après axotomie. Mes résultats (Wilson et al. PLoS ONE, 2014) démontrent que le knockdown ciblé de iASPP exacerbe la mort apoptotique des cellules rétiniennes ganglionnaires, et que la surexpression de iASPP par virus adéno-associé promeut la survie des cellules rétiniennes ganglionnaires. En conclusion, les résultats présentés dans cette thèse contribuent à une meilleure compréhension des mécanismes régulateurs sous-jacents la perte de cellules rétiniennes ganglionnaires par apoptose et pourraient fournir des pistes pour la conception de nouvelles stratégies neuroprotectrices pour le traitement de maladies neurodégénératives telles que le glaucome. / Glaucoma is the leading cause of irreversible blindness worldwide. At present, there is no cure for glaucoma, and current therapies are often inadequate. Loss of vision in glaucoma results from the death of retinal ganglion cells, the neurons that send visual information from the retina to the brain. The principal mechanism leading to retinal ganglion cell damage during glaucoma is not well understood, however, putative culprits have been proposed including excitotoxicity, neurotrophin deprivation, mechanical compression, ischemia, reactive astrocytes and oxidative stress. It is well established that retinal ganglion cell loss during glaucoma is caused by apoptotic programmed cell death, however, the precise mechanisms that lead to apoptotic death of adult retinal ganglion cells are poorly defined. To address this point, I put forth the central hypothesis that the identification of signaling pathways involved in apoptotic retinal ganglion cell death would offer therapeutic avenues to slow or prevent retinal ganglion cell death during ocular neuropathies such as glaucoma. In the first part of my thesis, I characterised the role of Apoptosis Stimulating Protein of p53 family (ASPP) proteins, which are regulators of p53, in the apoptotic death of retinal ganglion cells. p53 is a nuclear transcription factor implicated in cellular functions ranging from transcription to apoptosis. ASPP family members ASPP1, ASPP2 and iASPP are p53 binding proteins that belong to a family of protein regulators of p53-dependent apoptotic death. However, the role of ASPP family members in retinal ganglion cell death is unknown. As ASPP1 and ASPP2 are pro-apoptotic, the hypothesis of our first study was that the knockdown of ASPP1 and ASPP2 gene expression would lead to retinal ganglion cell survival after an optic nerve lesion. We used a well-characterized experimental model of neuronal apoptosis induced by optic nerve axotomy in Sprague Dawley rats. The results of this study (Wilson et al. Journal of Neuroscience, 2013) demonstrated that p53 is implicated in retinal ganglion cell death, and that targeted knockdown of ASPP1 and ASPP2 by short interference ribonucleic acid promotes retinal ganglion cell survival. The knockdown of ASPP2 correlates with a reduction in the levels of pro-apoptotic p53 regulated targets PUMA and Fas/CD95. In the second part of my thesis, I characterized the role of the anti-apoptotic member of the ASPP family, iASPP, in the apoptotic death of retinal ganglion cells. The hypothesis of this second study is that the overexpression of iASPP would promote retinal ganglion cell survival after axotomy. The data (Wilson et al. PLoS ONE, 2014) demonstrate that the targeted knockdown of iASPP by short interference ribonucleic acid exacerbates retinal ganglion cell death, and that the overexpression of iASPP by adeno-associated virus promotes retinal ganglion cell survival. The overexpression of iASPP correlates with a reduction in protein levels of PUMA and Fas/CD95. In conclusion, the findings presented in this thesis contribute to a better understanding of the pathological mechanisms underlying retinal ganglion cell loss by apoptosis and might provide insights into the design of novel neuroprotective treatments for neurodegenerative diseases such as glaucoma.