Submitted by Luciana Ferreira (lucgeral@gmail.com) on 2015-10-27T13:50:34Z No. of bitstreams: 2 Tese - Arthur Tavares de Oliveira Melo - 2015.pdf: 5375267 bytes, checksum: 306e8d72c2977068f8f669824b83ca4b (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) / Approved for entry into archive by Luciana Ferreira (lucgeral@gmail.com) on 2015-10-27T14:08:47Z (GMT) No. of bitstreams: 2 Tese - Arthur Tavares de Oliveira Melo - 2015.pdf: 5375267 bytes, checksum: 306e8d72c2977068f8f669824b83ca4b (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-10-27T14:08:47Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Tese - Arthur Tavares de Oliveira Melo - 2015.pdf: 5375267 bytes, checksum: 306e8d72c2977068f8f669824b83ca4b (MD5) license_rdf: 23148 bytes, checksum: 9da0b6dfac957114c6a7714714b86306 (MD5) Previous issue date: 2015-01-22 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES / The sugarcane is one of the most important crop species to provide sugar and renewable energy in the world. Due to the high amount of repetitive elements and the various polyploidization events suffer during its evolution, the Saccharum spp. genome has not yet been assembled and annotated, unlike other agronomic important species. So, the knowledge about sugarcane transcriptome become even more useful for supporting genomic analyzes studies. A draft assembly of sugarcane transcriptome was obtained from Illumina sequencing paired-ends libraries of five different plant organs, sampled from thirty elite clones. Analyzes of quality control and normalization was done in the RNA-seq data. Trinity package was used for de novo assembly. The scaffolds obtained and identified as complete ORFs were annotated according to Gene Ontology terms. The draft assembly was characterized by the identification of microsatellites and SNPs molecular markers and for assessing the contribution of different plant organs for transcriptome final assembly. The draft sugarcane transcriptome comprised 178 Mb, over 131,831 scaffolds, representing 61,225 genes. The transcripts average size was 1,350 bp and N50 value was 1,667 bp. A total of 1,250 transcripts identified as complete ORFs showed no similarity to sequences of the nr NCBI database, are considered new Transcript Active Regions (nTARs). The annotation performed using the KEGG database identified 234 transcripts coding for enzymes members of sucrose and starch metabolism, an important metabolic pathway for understanding the relationship between photosynthetic rate and sucrose accumulation in the stalk. The five plant organs used contributed equally for the draft sugarcane transcriptome. A total of 12,931 genomic regions were identified containing perfect microsatellites, with a predominance of di and tri nucleotide. On average, one SNP every 18 bp was identified, with more than four million SNPs identified with satisfactory values of haplotype and quality scores. The nucleotide diversity of thirty elite clones used in this study was high. The identification of these molecular markers, particularly SNPs markers, provides the possibility of using these polymorphisms in genomic and genetic studies of sugarcane, including the possibility of application of genome wide selection like breeding strategy. The sugarcane transcriptome draft assembly proposed in this study has data and analysis quality sufficient to be used in attempt to encompass a reference transcriptome for the species of Saccharum spp. / A cana-de-açúcar é uma das principais espécies cultivadas para o fornecimento mundial de açúcar e energia renovável. Devido à elevada quantidade de elementos repetitivos e os vários eventos de poliploidização, o genoma da espécie ainda não foi montado e anotado, diferentemente de outras espécies de interesse agronômico. Assim, as informações do transcritoma da espécie se tornam ainda mais úteis por dar suporte ás iniciativas de análises genômicas. Um draft assembly do transcritoma de cana-de-açúcar foi montado a partir do sequenciamento Illumina de bibliotecas paired-ends de cinco órgãos distintos da planta, obtidos de uma amostra de trinta clones elite. Os dados de RNA-seq passaram por análises de controle de qualidade e normalização. O software Trinity foi utilizado para montagem de novo do transcritoma. Os scaffolds obtidos identificados como ORFs completas foram anotados conforme os termos do Gene Ontology. O draft assembly obtido para o transcritoma de cana-de-açúcar foi caracterizado pela identificação de marcadores moleculares do tipo microssatélites e SNPs e pela avaliação da contribuição dos diferentes órgãos vegetais para constituição final do transcritoma. O transcritoma obtido compreendeu 178 Mb, distribuídos em 131.831 scaffolds, representando 61.225 genes. O tamanho médio dos transcritos foi de 1.350 pb, com valor de N50 igual a 1.667 pb. Um total de 1.250 transcritos, identificados como ORFs completas, não apresentaram similaridade com sequências do banco de dados nr do NCBI, sendo considerados novas regiões transcricionalmente ativas (nTARs). A anotação realizada através do banco de dados do KEGG identificou 234 transcritos codificantes para enzimas integrantes do metabolismo de sacarose e amido, uma importante rota metabólica para compreensão da relação entre taxa fotossintética e o acúmulo de sacarose no colmo. Os cinco órgãos vegetais utilizados contribuíram igualmente para a constituição do draft do transcritoma de cana-de-açúcar. Foram identificadas 12.931 regiões genômicas contendo microssatélites perfeitos, com predomínio de di e tri nucleotídeos. Em média, identificou-se um SNP a cada 18 pares de bases, com mais de quatro milhões de SNPs identificados. A diversidade nucleotídica dos trinta clones elites utilizados é elevada. A identificação destes marcadores moleculares, principalmente os marcadores SNPs, fornece a possibilidade de utilização destes polimorfismos em estudos genéticos e genômicos de cana-de-açúcar, incluindo o emprego em abordagens como seleção genômica ampla no melhoramento da espécie. O draft assembly do transcritoma de cana-de-açúcar proposto neste estudo possui qualidade de dados e de análise suficiente para ser utilizado na tentativa de abranger um transcritoma de referência para as espécies de Saccharum spp.

Submitted by Taiwany Oliveira (taiwanyrodriguess@gmail.com) on 2018-10-22T14:08:28Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) minha tese pronta em pdf.pdf: 3260829 bytes, checksum: 4f79fe4884cb35fde794ffb3be8d205b (MD5) / Approved for entry into archive by Marcos Roberto Gomes (mrobertosg@gmail.com) on 2018-10-22T15:26:52Z (GMT) No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) minha tese pronta em pdf.pdf: 3260829 bytes, checksum: 4f79fe4884cb35fde794ffb3be8d205b (MD5) / Approved for entry into archive by Divisão de Documentação/BC Biblioteca Central (ddbc@ufam.edu.br) on 2018-10-23T14:13:43Z (GMT) No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) minha tese pronta em pdf.pdf: 3260829 bytes, checksum: 4f79fe4884cb35fde794ffb3be8d205b (MD5) / Made available in DSpace on 2018-10-23T14:13:43Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) minha tese pronta em pdf.pdf: 3260829 bytes, checksum: 4f79fe4884cb35fde794ffb3be8d205b (MD5) Previous issue date: 2018-02-05 / CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Copaifera multijuga Hayne is a large plant species, popularly known as copaiba, native to Latin America and Africa. They are widely used in Amazonian folk medicine, due to the properties of oleoresin extracted from the trunk of their trees, mainly used as: diuretic, laxative, anti-tetanic, anti-inflammatory, antitussive, healing and anti-tumor. Therefore, it is of great importance for research aimed at identifying in plants substances with potential medical and biotechnological purposes. Therefore, this work aimed to search for the transcriptome of C. multijuga Hayne, which was sequenced using the Roche 454 platform, obtaining a total of 638,576 reads, assembled using the de novo methodology using the MIRA and TRINITY platforms. Being generated, from the assembly by TRINITY 53.319 contigs and 62.839 by assembly MIRA. The transcriptome annotation was performed using BLASTx (NCBI) and the functional annotation through the Gene Ontology (GO) bank. The results were categorized according to GO, where the contigs were grouped in the categories: "Cell Component" with 6.249 contigs involved in this category, "Molecular Function" with a total of 17.208 contigs and "Biological Process" with 9,499 contigs. In the three categories the contigs evidenced are involved in the primary plant metabolism. A total of 184 unigenes were detected in 22 clusters, mainly involved in responses to plant oxidative stress, terpenes, important metabolites involved in the formation of copaiba oleoresin, diterpenes (resinous portion of oleoresin) and sesquiterpenes (volatile components of oil) and unigenes related to vegetal pigmentation such as: flavonoids, carotenoids and anthocyanins. In phylogenetic analysis, evolutionary comparisons of terpene synthase enzymes, copaiba oil formation components, with enzymes from the NCBI database were made. C. multijuga TPS4-2 unigene had similarity to other Copaifera TPS4-2 terpene sequences available from the bank. Thus, in this work the transcriptome of C. multijuga was carried out with new assembly and annotation, which leads to the perspective of studies with the unigenes encoding enzymes components of the oleoresin evidenced in this work, aiming with this future research for biotechnological purposes. / Copaifera multijuga Hayne é uma espécie de planta de grande porte, popularmente conhecida como copaíba, nativa da América Latina e da África. São amplamente utilizadas na medicina popular amazônica, devido as propriedades do óleo-resina extraído do tronco de suas árvores, utilizado principalmente como: diurético, laxativo, antitetânico, anti-inflamatório, antitussígeno, cicatrizante e anti-tumoral. Sendo, portanto, de grande importância para pesquisas que visem identificar nas plantas substâncias com potenciais finalidades médicas e biotecnológicas. Por isto, este trabalho visou pesquisar o transcriptoma de C. multijuga Hayne, o qual foi sequênciado utilizando a plataforma 454 Roche, sendo obtido um total de 638.576 reads, montados através da metodologia de novo com auxílio das plataformas MIRA e TRINITY. Sendo gerados, a partir da montagem por TRINITY 53.319 contigs e 62.839 pela montagem MIRA. A anotação do transcriptoma foi realizada utilizando BLASTx (NCBI) e a anotação funcional através do banco Gene Ontology (GO). Os resultados obtidos foram categorizados de acordo com GO, onde os unigenes foram agrupados nas categorias: “Componente Celular” com 6.249 contigs envolvidos nesta categoria, “Função Molecular” com total 17.208 contigs e “Processo Biológico” com 9.499 contigs. Nas três categorias os contigs evidenciados estão envolvidos no metabolismo primário vegetal. Já do metabolismo secundário foram detectados 184 unigenes, sendo organizados em 22 clusters, envolvidos principalmente em respostas ao estresse oxidativo vegetal, compostos terpenos, importantes metabólitos envolvidos na formação do óleo-resina de copaíba, diterpenos (porção resinosa do óleo-resina) e sesquiterpenos (componentes voláteis do óleo) e unigenes relacionados com a pigmentação vegetal tais como: flavonóides, carotenóides e antocianinas. Na análise filogenética foram feitas comparações evolutivas de enzimas de terpenos sintases, componentes de formação do óleo de copaíba, com enzimas do banco de dados NCBI. O unigene de TPS4-2 de C. multijuga mostrou-se mais próximo a outras sequências de terpenos TPS4-2 de Copaifera disponíveis no banco. Com isto, neste trabalho realizou-se o transcriptoma de C. multijuga com a montagem de novo e anotação o que leva a perspectiva de estudos com os unigenes codificadores de enzimas componentes do óleo-resina evidenciados neste trabalho, visando com isto futuras pesquisas para fins biotecnológicos.

A tuberculose ainda é pontuada como uma doença de impacto mundial, sendo considerada desde 1993 um problema de saúde pública global. Uma das grandes preocupações é a contínua prevalência de cepas da Mycobacterium tuberculosis multidroga resistentes, especialmente o genótipo hipervirulento W-Beijing. Acredita-se que este genótipo apresenta alguma vantagem seletiva em relação a outros genótipos da M. tuberculosis, além de estar associado à falha terapêutica, tuberculose extrapulmonar, resistência à vacinação pela BCG e acentuada capacidade de disseminação. Estas cepas apresentam variável capacidade de sobrevivência dentro de macrófagos e do granuloma, modulando vias metabólicas específicas que culminam no escape do sistema imunológico e sucesso na infecção. Buscando entender esta vantagem seletiva e capacidade de persistência na infecção, este estudo teve como objetivo analisar e comparar o perfil transcriptômico de macrófagos infectados com as cepas da M. tuberculosis, W-Beijing 1471 e H37Rv. Os RNAs mensageiros dos macrófagos infectados foram sequenciados em plataforma HiScan Genome Analyzer Illumina. Foram gerados aproximadamente 30 milhões de sequências por amostra, em leituras single reads, com mais de 70% de sequências com valores de score Q de qualidade superior ou igual a 30. Foram mapeados e analisados 35.581 transcritos. Em média, 63% dos genes não apresentaram diferenças nos valores de expressões, 19% tiveram suas expressões reduzidas e 18% dos genes foram classificados como mais expressos, para todas as amostras de macrófagos sequenciadas. Após as análises terciárias e validação por PCR em tempo real, as amostras infectadas com a cepa W-Beijing 1471 apresentaram um aumento nas expressões de IFNs da classe I (p<0,001) e aumento exacerbado de TNF-alfa (p<0,001), comparativamente ao controle e as amostras infectadas com a cepa padrão H37Rv. Aditivamente foi observado um aumento nas expressões de duas quinases, RIPK1 e RIPK3 e de moléculas envolvidas na indução e controle de espécies reativas de oxigênio (ROS), que em infecções por bactérias intracelulares, estão correlacionadas com a morte de macrófagos por necroptose. A cepa hipervirulenta da M. tuberculosis, W-Beijing 1471, apresentou reduzida persistência intramacrofágica e induziu morte precoce dos macrófagos ao quinto dia de infecção. A morte observada nos macrófagos foi associada a ativação de IFNs da classe I/TNF-&#945;/RIPK1/RIPK3 e ROS, indicando necroptose. Ainda, foi observado um aumento na expressão do receptor TLR3 nas amostras infectadas com a cepa W-Beijing, comparativamente as amostras controles e infectadas com a cepa H37Rv. É provável que a ativação inicial dos IFNs da classe I tenha ocorrido via TLR3 através do reconhecimento de dsRNAs da M. tuberculosis. / Since 1993 the tuberculosis is considered as a disease of worldwide impact and a problem of public health. A major concern is the continuing prevalence of multidrug resistant Mycobacterium tuberculosis strains, especially the hypervirulent W - Beijing genotype. It is believed that this genotype has a selective advantage over other genotypes of M. tuberculosis and has being associated with treatment failure, extrapulmonary tuberculosis, resistance to BCG vaccination and marked ability to spread. These strains have varying ability to survive within macrophages and granuloma, modulating specific metabolic pathways that culminate in the escape of the immune system response. To understand this selective advantage and ability to persist in infection, this study aimed to analyze and compare the transcriptomic profile of macrophages infected with strains of M. tuberculosis W - Beijing 1471 and H37Rv. The mRNAs of infected macrophages were sequenced in HiScan Illumina Genome Analyzer platform. Were generated approximately 30 million sequences per sample, in single-reads readings. More than 70 % of sequences had values of Q score superior or equal to 30. Were mapped and analyzed 35,581 transcripts. On average, 63% of the genes showed no differences in the expressions, 19% were downregulated and 18% were upregulated, for all samples sequenced macrophages. After tertiary analysis and validation by real-time PCR, samples infected with the strain W -Beijing in 1471 showed an increase in expression of IFN class I (p <0.001) and exacerbated increase of TNF- alpha (p < 0.001) when compared to the control samples and those infected with standard strain H37Rv. Additively was observed an increase in expressions of the two kinases RIPK1 and RIPK3 and molecules involved in the induction and control of reactive oxygen species (ROS). In infections by intracellular bacteria, activation of RIPK1, RIPK3, ROS and TNF-&#945;, are correlated with death of macrophages by necroptosis. The hypervirulent M. tuberculosis W - Beijing 1471 strain showed reduced persistence inside macrophage and induced early death of macrophages in the fifth day of infection. The death observed in macrophages was associated with activation of IFNs class I/TNF-&#945;/RIPK1/RIPK3 and ROS, indicating necroptosis. Also was observed an increase in the expression of TLR3 receptor in infected samples with W-Beijing 1471 strain compared to controls and those infected with H37Rv strain. Probably the initial activation of IFNs class I occurred by TLR3 through the recognition of M. tuberculosis dsRNAs.

A elucidação dos mecanismos moleculares pelos quais tratamentos hormonais alteram o início da puberdade é de fundamental importância para o desenvolvimento de estratégias que reduzam a idade ao primeiro parto, e consequentemente a taxa de desfrute do rebanho Nelore. Foram investigados os efeitos do uso de dispositivos de progesterona, e do estradiol endógeno, sobre mecanismos moleculares controlando a obtenção da puberdade de novilhas Nelore peripúberes. Especificamente, como as diferenças na expressão de genes relativos à reprodução em duas áreas do hipotálamo. Trinta e cinco novilhas Nelores não púberes, e com idade entre 13 e 14 meses, foram divididas em quatro tratamentos experimentais (nove ou oito por tratamento): dispositivo de P4 sem estradiol (SP); dispositivo de P4 com estradiol (PE); sem dispositivo de P4 e sem estradiol (SS); e sem dispositivo de P4 e com estradiol (SE). As novilhas foram alimentadas no cocho pós desmame até atingirem 295 ± 11 kg, com fornecimento de água à vontade. Ao término do tratamento hormonal as novilhas foram abatidas e as porções de hipotálamo colhidas para processamento e armazenagem a -80 ºC. O RNA total do tecido hipotalâmico foi extraído, tratado com DNAse I e submetido à síntese de cDNA para estudo da expressão gênica por PCR em tempo real (qRT-PCR). Foram formados pools de RNA para a realização de um estudo abrangente da administração de progesterona e do efeito do estradiol endógeno e das diferenças entre áreas do hipotálamo, realizado por sequenciamento de nova geração (RNA-Seq), de forma a identificar possíveis genes candidatos no hipotálamo. Foram encontrados genes diferencialmente expressos alterados pelos tratamentos e entre as áreas do hipotálamo relativos à obtenção da puberdade. / The understanding of the molecular mechanisms by which nutrition, genetics and hormonal treatments affect the beginning of puberty is of great importance for developing strategies aiming to reduce the age at first calving, and therefore increase the slaughter rate in Nellore cattle. The effects of progesterone device and of endogenous estradiol on the molecular mechanisms controlling the attainment of puberty in Nellore heifers were investigated. Specifically, the molecular pathways of progesterone and estradiol were studied in the hypothalamus. Thirty five non-pubertal heifers, between 13 and 14 months of age, were divided into four treatment (nine or eight per treatment): P4 device without estradiol (SP), P4 device with estradiol (PE), without P4 device and without estradiol (SS), and without P4 device and with estradiol (SE). The heifers were fed after weaning until reach 295 ± 11 Kg, with water access. At the end of the hormonal treatments all heifers were slaughtered and the hypothalamus areas were harvested, processed and then also stored at -80°C. Total RNA of hypothalamus were extracted, treated with DNase I and submitted to cDNA synthesis for gene expression quantification by real time PCR (qRT-PCR). RNA samples were pooling to realize a comprehensive study of the effects of progesterone administration and endogenous estrogen on attainment of puberty by next-generation sequencing (RNA-Seq), in order to identify possible candidate genes in the hypothalamus. Genes diffentially expressed between hypothalamic areas and affected by treatments were found.

Inúmeros aspectos da reprodução em Apis mellifera já foram extensamente divulgados, no entanto, os mecanismos reguladores da manutenção do estado estéril das operárias, bem como aqueles que permitem a ativação de seus ovários, ainda estão para serem descobertos. Por exemplo, a organização dos folículos ovarianos em crescimento e a arquitetura e papel das células foliculares neste processo. Além disso, para compreender o processo de ativação dos ovários em um contexto mais amplo, também é necessária uma investigação da síntese e maturação de diferentes classes de RNAs as quais modelam redes de interações gênicas extremamente complexas. Portanto, neste doutorado, tivemos como objetivo realizar 1- uma análise morfológica dos ovários ativos de operárias de A. mellifera obtidos em condições orfandade, com ênfase nas células foliculares e 2- um estudo aprofundado da regulação da expressão gênica (genes estruturais e reguladores) que é de fundamental importância para ligar os genótipos aos fenótipos. A análise morfológica dos ovários de operárias de A. mellifera foi realizada em microscópio de fluorescência ou confocal (priorizou a contagem das células foliculares) e microscópio eletrônico de transmissão, que permitiu a descrição e caracterização, pela primeira vez, da patência em ovários de operárias A. mellifera. Paralelamente, por meio da técnica de RNAseq, foi possível analisar o transcriptoma (miRNAs e mRNAs) de amostras específicas de ovários, em diferentes estados fisiológicos, em rainhas e operárias. Os mRNAs e miRNAs que se destacaram em nossas análises in silico foram validados experimentalmente por RT-PCR com alto grau de reprodutibilidade e em harmonia com o estado fisiológico dos ovários. Os transcritos altamente expressos nos ovários ativados foram: fpps5, cad, obp7, yellow-g e aqueles representados pelo GB42182 e GB44975. Acreditamos estes genes possam fazer parte da rede que regula o processo de ativação dos ovários em A. mellifera. Os miRNAs que se destacaram em nossas análises foram: A) miR-306 e miR-317 - altamente expressos nas amostras de ovários funcionais e B) miR-71 pelo fato de, nas análises in silico, ser o mais forte candidato a alvejar a vitelogenina, e na análise experimental, apresentarem, microRNAs e mRNAs, perfis de expressão antagônicos. A construção de bibliotecas de microRNAs e mRNAs a partir de ovários funcionais e não funcionais de abelhas operárias e rainhas, a análise de expressão, bem como a predição de uma rede de integração nos deu um retrato do sensível equilíbrio reprodutivo que mantém ambas as castas em aparente harmonia dentro da colônia aonde elas assumem, no momento certo, seus papéis nesta sofisticada sociedade empreendendo ou não a reprodução. / Countless aspects of reproduction in Apis mellifera have been widely published, however, the regulatory mechanisms for the maintenance of the sterile state of workers as well as those that allow the activation of their ovaries are still to be discovered, as much as the organization of growing ovarian follicles, the architecture and the role of follicular cells during this process. Furthermore, to understand the activation process of the ovaries in a broader context, it is also necessary to investigate the synthesis and maturation of different classes of RNAs which exemplify networks of gene interactions, extremely complex. Therefore, PhD project, we aimed to approach: 1 - A morphological analysis of active ovaries of A. mellifera workers obtained in queenless conditions, with emphasis on the follicular cells and 2 - A detailed study of the regulation of gene expression (structural and regulatory genes) that is crucial for linking genotypes to phenotypes. Morphologic analysis of workers ovaries of A. mellifera was performed under a fluorescence microscope or confocal (prioritized follicular cell count) and transmission electron microscope, which allowed, for the first time, a description and characterization of the patency of worker ovaries in A. mellifera. Similarly, by RNAseq technique, it was possible to analyze the transcriptome (miRNAs and mRNAs) of specific samples of ovaries at different physiological states, in queens and workers. mRNAs and miRNAs that stood out in our in silico analysis were experimentally validated by RT-PCR with high reproducibility and in harmony with ovaries physiologic state. Transcripts highly expressed in activated ovaries were fpps5, cad, obp7, yellow-g and those represented by GB42182 and GB44975. We believe these genes may be part of the network that regulates ovaries activation process in A. mellifera. miRNAs that stood out in our analysis were: - a) - miR-306 and miR-317 - highly expressed in samples of active ovaries and b) -miR-71 by the fact that the in silico analysis, was the strongest candidate to target vitellogenin, and in experimental analysis, presented antagonistic profile of expression when microRNAs and mRNAs were contrasted. The construction of microRNAs and mRNAs libraries from active and inactive ovaries of worker bees and queens, the analysis expression, as well as the prediction of a integrative network has given us a portrait of the sensitive reproductive balance that keeps both castes of bees in apparent harmony within the colony, where they take each one, at the right time, their roles in this sophisticated society, undertaking or not the reproduction.

O dermatófito Trichophyton rubrum é um fungo filamentoso, antropofílico que infecta preferencialmente tecidos queratinizados, e é o agente etiológico mais frequentemente isolado em casos de dermatofitoses humanas. Recentemente, este fungo tornou-se a causa de infecções profundas e generalizadas em pacientes imunocomprometidos. As estratégias terapêuticas para controlar esse tipo de infecção apresentam várias limitações, como o aparecimento de linhagens resistentes e o número restrito de alvos celulares disponíveis. Novas estratégias terapêuticas são necessárias, sendo o foco de muitas investigações. Acriflavina é uma droga citotóxica com atividade antifúngica envolvida na inibição da topoisomerase. Embora seja um composto intercalante de DNA, já foi relatada a super expressão de genes que codificam enzimas envolvidas no transporte de elétrons na cadeia respiratória mitocondrial e no transporte de ferro em resposta a esta droga, sugerindo um amplo espectro de efeitos celulares. A fim de melhor compreender seus efeitos moleculares, o objetivo deste trabalho foi avaliar o transcriptoma de T. rubrum em resposta a acriflavina. Os perfis transcricionais em resposta a esta droga foram analisados utilizando a metodologia de RNA-seq empregando o sequenciamento em larga escala SOLiD System. Foram comparadas quatro bibliotecas sendo uma o cultivo de T. rubrum em meio Sabouraud e três períodos de exposição à droga: 3 horas, 12 horas e 24 horas. Foram geradas aproximadamente 200 milhões de reads, as quais foram filtradas e alinhadas no genoma de T. rubrum disponível no Dermatophyte Comparative Database Broad Institute utilizando os algoritmos Bowtie e Tophat. As reads alinhadas foram processadas utilizando os algoritmos Cufflinks e Cuffdiff para estimar a abundancia dos transcritos e testar os genes diferencialmente expressos entre o controle e as condições de exposição à droga. Foram identificados 3.153 genes diferencialmente expressos. Após o estabelecimento de critérios mais estringentes, foram selecionados 490 genes diferencialmente expressos em resposta à droga. Estes genes estão relacionados a vários processos celulares como reações de oxidação e redução, transporte transmembrana, transporte de íons e metais e a patogenicidade. Os genes envolvidos com patogenicidade foram reprimidos, sugerindo que a droga interfira com processos importantes para instalação e manutenção da infecção no hospedeiro. Outros fatores de virulência como genes envolvidos no ciclo do glioxilato, também foram reprimidos pela droga. Além disso, genes da via de biossíntese do ergosterol foram reprimidos pela droga, o que constitui um provável novo mecanismo de ação de acriflavina. Os resultados obtidos nesta análise em larga escala contribuem com a elucidação dos mecanismos moleculares envolvidos na adaptação ao estresse em dermatófitos e podem auxiliar o desenvolvimento de novas drogas antifúngicas. Além disso, estes resultados contribuem com a anotação do genoma e transcritoma de T. rubrum e outros dermatófitos. / The dermatophyte Trichophyton rubrum is an anthropophilic filamentous fungus that infects keratinized tissues and is the most common etiologic agent isolated in cases of human dermatophytoses. Recently, it has become the cause of deep and widespread infections in immunocompromised patients. Therapeutic strategies to control these infections have several limitations, such as the appearence of resistant strains and the limited number of antifungal cellular targets. New therapeutic strategies are necessary, being the focus of many investigations. Acriflavine is a cytotoxic drug with antifungal activity involved in topoisomerase inhibition. Although it presents DNA intercalating properties, it has already been reported the over-expression of genes coding for enzymes involved in mitochondrial respiratory-electron transport and in iron transport in response to this drug, suggesting a broad spectra of cellular effects. In order to better understand its molecular effects we evaluated T. rubrum transcriptome in response to acriflavine in a time-course assay using the next generation sequencing technology SOLiD System. RNA-seq was performed comparing T. rubrum growth in Sabouraud medium as the control and the three periods of drug exposure, 3h, 12h, and 24h. RNA-seq generated approximately 200 million short reads that were mapped to the Broad Institutes Dermatophyte Comparative Database using Bowtie and TopHat algoritms. Differential gene expression analysis was performed using Cufflinks and Cuffdiff. It was identified 3,153 differentially expressed genes. A more stringent cut-off threshold was established and this analysis revealed a subset of 490 genes modulated in response to the stress caused by exposure of T. rubrum to acriflavine. These genes are involved in various cellular processes such as oxidation-reduction reactions, transmembrane transport, metal ion binding, and pathogenicity. The genes involved in pathogenicity were down-regulated, suggesting that this drug interferes with virulence factors that allow the development of infection and persistence of the dermatophyte in the host. Other virulence factors such as genes involved in the glyoxylate cycle were also repressed by the drug. Moreover, genes involved in ergosterol biosynthesis pathway were down-regulated by the drug and may constitute a new mechanism of action of acriflavine. The results obtained in this large scale analysis provide insights into the molecular mechanisms underlying the responses of T. rubrum to stress conditions and may aid the development of new antifungal drugs. Furthermore, these results contribute to improve gene annotation and open reading frame prediction for T. rubrum and other dermatophyte genomes and transcriptomes.

A soja é uma cultura de grande importância, movimentando aproximadamente 230 bilhões de dólares em todo o mundo, com produção anual estimada de 267,61 milhões de toneladas. Os percevejos sugadores de sementes são considerados uma das pragas de maior importância para a cultura da soja, sendo as espécies Euschistus heros (E.), Piezodorus guildinii (West.) e Nezara viridula (L.) as mais abundantes no Brasil. O ataque por percevejos causa diversos problemas como o atraso da maturação fisiológica, retenção foliar, perdas no rendimento e diminuição da qualidade e potencial germinativo das sementes. Esses insetos são responsáveis ainda pela transmissão de patógenos, e podem causar alterações na composição de óleos, proteínas e ácidos graxos das sementes. A obtenção de cultivares com resistência genética é indispensável, a fim de minimizar a necessidade de utilização de defensivos agrícolas. Dessa forma, este trabalho identificou genes possivelmente associados à resposta de resistência pela comparação da expressão gênica diferencial entre genótipos de soja resistente (IAC-100) e suscetível (CD-215), a partir da metodologia de sequenciamento de RNA (RNA-Seq). As vagens foram submetidas a dois tratamentos por 24 horas: infestação por percevejos Piezodorus guildinii (West.) e não infestação. Foi utilizado o alinhador STAR contra o genoma hardmasked do phytozome e o pacote cufflinks.Com os resultados das análises dos genes diferencialmente expressos e uma posterior filtragem foi possível identificar 128 genes candidatos, dentre estes: genes relacionados com defesa, metabolismo secundário de produção de terpenos e proteínas LRR de sinalização celular. / Soybeans are an important crop with a world-wide annual production of 267.61 tons, worth 230 billion dollars. Stink bugs are a major soybean pest. The most abundant species in Brazil are Euschistus heros (E.), Piezodorus guildinii (West.) and Nezara viridula (L.). Stink-bug attack causes several problems, including delayed physiological maturity, leaf retention, yield losses, decreased seed quality, and decreased germination potential. The bugs are responsible for transmitting pathogens, and they can cause changes in the oil, protein, and fatty acids composition in the seed. Producing genetically resistant cultivars is critical in order to minimize the need for agricultural pesticides. Our work aims to identify genes associated with the stink-bug resistance response in soybean by comparing differential gene expression between resistant (IAC-100) and susceptible (CD-215) genotypes by analyzing RNA sequencing (RNA-Seq) data. Data was from soybean pods that were subjected to two treatments for 24 hours: infestation by the stink bug Piezodorus guildinii (West.), and non-infestation. STAR aligner was used against the hard-masked genome sequence from Phytozome, followed by analysis using the Cufflinks package. Analysis of the results of the differentially expressed genes and a subsequent filtering identified 128 candidate defense-associated genes, among them, defense-related such as LRR-RLKs and production of secondary metabolites like terpenes.

Orientador: Gonçalo Amarante Guimarães Pereira / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-24T13:53:36Z (GMT). No. of bitstreams: 1 ReisJunior_Osvaldo_M.pdf: 4891818 bytes, checksum: f9d97822f44db63385219e9c927eaf29 (MD5) Previous issue date: 2014 / Resumo: As tecnologias de sequenciamento de segunda geração geram um grande número de sequências em um curto espaço de tempo e com baixo custo. O sequenciamento em larga escala de cDNA, conhecido como RNA-seq, tem permitido análises precisas de transcriptomas inteiros sem a necessidade de conhecimento prévio sobre sequências genômicas, conforme exigido pela tecnologia de microarranjos. No entanto, existem muitas discussões sobre os métodos utilizados para o alinhamento de reads, identificação de genes diferencialmente expressos e montagem de transcriptomas. Desde 2000, o Laboratório de Genômica e Expressão (LGE), tem estudado a doença da vassoura-de-bruxa do cacaueiro (Theobroma cacao), que é causada pelo fungo basidiomiceto Moniliophthora perniciosa. Recentemente, 54 bibliotecas RNA-seq da interação planta-patógeno foram sequenciadas pelo nosso grupo, a fim de ajudar na elucidação da complexa biologia da doença. Desta forma, este trabalho tem como objetivo gerar informações sobre o perfil de transcrição do M. perniciosa e do T. cacao durante a doença vassoura-de-bruxa. Os resultados estão divididos em três seções principais, sendo que na primeira apresentamos uma análise de alinhamento e expressão gênica nas condições e tecidos amostrados. Na segunda, analisamos o estágio inicial da doença, conhecido como vassoura-verde, onde através da análise de expressão diferencial identificamos genes relacionados aos mecanismos de interação entre o cacaueiro e o fungo M. perniciosa. Na ultima seção, desenvolvemos uma estratégia para identificar sequências de possíveis RNAs não codificantes longos (lncRNA) e aplicamos esta estratégia no fungo M. perniciosa. De uma maneira geral estes dados apresentam um importante avanço no estudo desta doença e poderão ser utilizados em trabalhos futuro / Abstract: Next-generation sequencing technologies generate large numbers of sequences in a short time and at low cost. The high-throughput sequencing of cDNA, known as RNA-seq, has allowed precise analyses of entire transcriptomes without the need of previous knowledge on genomic sequences, as required by microarrays. However, there are many discussions about the methods used for read alignment, identification of differentially expressed genes and assembly of transcriptomes. Since 2000, the Genomics and Expression Laboratory (LGE), has been studying the Witches' Broom Disease (WBD) of cacao (Theobroma cacao), which is caused by the basidiomycete fungus Moniliophthora perniciosa. Recently, 54 RNA-seq libraries of this plant-pathogen interaction were sequenced by our group in order to help in the elucidation of the complex biology of the disease. Thus, this work aims to generate information about the transcription profile of M. perniciosa and T. cacao during the Witches' Broom Disease (WBD). The results are divided into three main sections, the first is an analysis of alignment and gene expression under the conditions and sampled tissues. In the second section, we analyze the initial stage of the disease, known as green broom, where through differential expression analysis we could identify genes related to mechanisms of interaction between cacao and the fungus M. perniciosa. In the last section, we developed a strategy to identify possible sequences of long noncoding RNAs (lncRNA) and applied this strategy in the fungus M. perniciosa. In general these data present an important advance in the study of this disease and may be used in future work / Mestrado / Bioinformatica / Mestre em Genética e Biologia Molecular

Orientador: Gonçalo Amarante Guimarães Pereira / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-23T01:57:11Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Camargo_EduardoLealOliveira_D.pdf: 11285446 bytes, checksum: 686698f2a706f1cdd1381fde9bf42836 (MD5) Previous issue date: 2013 / Resumo: O nitrogênio (N) é o principal macronutriente necessário para o desenvolvimento das plantas e acúmulo de biomassa. O gênero Eucalyptus é a principal fonte de biomassa para as indústrias de base florestal, principalmente a de papel e celulose. Suas altas taxas de crescimento, propriedades da madeira e repostas a manejo silviculturais tem grande potencial para utilização na geração de biocombustíveis e químicos. Neste novo cenário, a projeção é de uma crescente demanda de biomassa e, em função disso, é necessário associar novas estratégias aos programas de melhoramento genético, que resultem não somente no aumento da produtividade, como também na adequação de caracteres da qualidade da madeira. A qualidade da madeira depende de diversas propriedades do xilema secundário que são influenciadas por fatores genéticos e ambientais, como a disponibilidade água e nutrientes. Neste estudo foi demonstrado que a fertilização nitrogenada causa alterações na formação e qualidade do xilema secundário de eucalipto. Plantas de um clone comercial de Eucalyptus urophylla x E. grandis foram submetidas a adubações contrastantes de N. Análises histológicas de regiões caulinares demonstraram que a deposição de lignina foi reduzida pela fertilização em excesso de N, enquanto um aumento consistente foi observado nas plantas cultivadas em solução deficiente em N. Esses resultados foram corroborados por análises químicas. Pela análise de sequenciamento de RNA foram identificados 1.469 genes diferencialmente expressos e exibindo um padrão de expressão relacionado à quantidade de N disponível. Dentre esses se destacam genes relacionados ao metabolismo de nitrogênio e fenilpropanóides. Os resultados possibilitaram entender os mecanismos envolvidos na manutenção das altas taxas de lignificação sob deficiência de N, bem como apontar possíveis genes candidatos relacionados com a qualidade da madeira de eucalipto / Abstract: The nitrogen (N) is the main macronutrient required for plants development and biomass accumulation. The genus Eucalyptus is the principal source of biomass to forest industries, mainly to the pulp and paper. Their fast growth, valuable wood properties and ease of management have great potential to generate biofuel and chemicals. In this scenario, the projections lead to a high demand of biomass, resulting in the need to associate new strategies of genetic improvement programs, which results in a higher productivity with a better wood quality. The wood quality depends from many properties of secondary xylem that are influenced by genetics and environment factors, like water and nutrients availability. In this study, we demonstrate in Eucalyptus that N fertilization promotes changes on secondary xylem formation and quality. Plants from a commercial clone of Eucalyptus urophylla x E. grandis were submit to contrasting N fertilizations. The histological analyses from stem regions demonstrate that lignin deposition were reduced by high N fertilization, whereas a consistent increased were observed on those cultivate at N deficient treatment. These results were corroborate by chemical analyses. By the RNA sequencing analyses, it was identified 1,469 differently expressed genes, exhibiting an N-dependent expression pattern. Between those are genes related to N and phenylpropanoid metabolisms. The results allowed us to understand the mechanism involved on the maintenance of the high rates of lignifications under N depletion, and also to point some possible candidates genes involve on Eucalyptus wood quality / Doutorado / Bioquimica / Doutor em Biologia Funcional e Molecular

Depuis leurs apparitions, les technologies de séquençage à haut débit (NGS) ont permis de révolutionner notre connaissance du transcriptome. Le RNA-Seq ou séquençage à haut-débit des transcrits, permet la numérisation rapide d’un transcriptome sous forme de millions de courtes séquences d’ADN. Contenue dans ces données brutes, l’information des transcrits peut être analysée quantitativement sous forme de profils d’expression. Les séquences obtenues contiennent également une multitude d’informations qualitatives comme les jonctions d’épissage, les variants génomiques ou post-transcriptionnels, ainsi que de nouvelles formes de transcriptions moins conventionnelles comme les ARN circulaires, les gènes de fusions ou les longs ARN non-codants.Peu à peu, le RNA-Seq s’impose comme une technologie de référence dans la recherche en biologie, et, demain dans la médecine génomique.Mes travaux de thèse proposent une vue transversale de la technologie RNA-Seq avec comme point de départ l’optimisation des méthodes d’analyses actuelles dans un contexte donné - via des procédures de benchmarking systématiques s’appuyant sur la simulations de données. Ces optimisations sont ensuite exploitées, dans le cadre d’applications sur la biologie des cancer (Leucémies et Hépatoblastome), afin d’identifier de nouveaux biomarqueurs, ainsi qu’une nouvelle stratification des patients dans le but de proposer des pistes thérapeutiques personnalisées. Enfin, mes derniers travaux portent sur la proposition de deux nouvelles méthodes d’analyse du RNA-Seq par décomposition en k-mers. La première, TranSiPedia, propose un nouveau paradigme, ayant pour objectif d'intégrer les données du transcriptome à très large échelle, via l'indexation systématique de données expérimentales. La seconde méthode, DE-kupl, propose une analyse différentielle - sans apriori - des données RNA-Seq pour l’identification de nouveaux biomarqueurs et la caractérisation de nouveaux mécanismes du transcriptome. / Since their introduction, next generation sequencing technologies (NGS) have shaped our vision of the transcriptome. RNA-seq, or high throughput transcript sequencing, enables the fast digitization of a transcriptome in the form of million of short DNA sequences. The information available in the raw data can be used in a quantitative way to extract expression profiles. The obtained sequences also provides a wide range of qualitative information such as splicing junction, genomic or post-transcriptional variants, as well as new forms of less conventional transcription such as circular RNA, fusion genes or long non coding RNA. Gradually, RNA-Seq is becoming a gold standard in molecular biology and tomorrow in genomic medicine.My thesis work proposes a global vision of the RNA-Seq technology, starting with the optimisation of current analysis methods to a particular context through systematic benchmarking procedures relying on the simulation on synthetic data. These optimizations are later used as a part of a work on the biology of cancer in order to identify new biomarkers in leukemia as well as a new stratification of hepatoblastoma patients to propose personalized treatments. Finally, my last work is focused on the proposal of two new analysis methods for RNA-Seq data, both based on the principle of k-mer decomposition. The first method, TranSiPedia, is a new paradigm to integrate transcriptome data at a very large scale through the systematic indexation of experimental data. The second method, DE-Kupl, is a new strategy to perform differential analysis, without a priori knowledge about the transcriptome. DE-kupl is designed to help the discovery of new biomarkers as well as the characterization of new mechanisms of the transcriptome.