Les récepteurs couplés aux protéines G forment une grande famille de récepteurs transmembranaires. De nombreuses études montrent que ces récepteurs présenteraient une tendance à interagir entre eux et à former des oligomères. Ces structures sont toutefois sujettes à controverse. En effet, très peu d'éléments permettent d'affirmer que ces oligomères existeraient dans les tissus natifs, la plupart des caractérisations se faisant en systèmes hétérologues. Nous avons donc développé une approche basée d'une part sur l'utilisation de ligands fluorescents pour marquer les récepteurs dans leur environnement natif et d'autre part sur le FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer) en temps résolu en utilisant des cryptates de lanthanides, en particulier le Lumi4-Tb. Nous avons ainsi pu montrer et publier l'existence d'oligomères du récepteur de l'ocytocine dans la glande mammaire. Le protocole de cette étude a aussi été publié et a été validé pour la mise en évidence d'hétéro-oligomères, plus précisément entre les récepteurs V1a et V2 de la vasopressine. La poursuite de l'étude de ce phénomène dans les tissus natifs nous a poussés à développer notre propre dispositif de microscopie FRET en temps résolu. Ce dispositif est basé sur un microscope en champ large auquel nous avons ajouté une source laser pour l'excitation pulsée et une caméra CCD Multigate pour la détection. Nous en présentons ici les premiers résultats ainsi que sa validation pour l'utilisation de multiples fluorophores accepteurs avec une contamination minimale par le Lumi4-Tb. Enfin, nous proposons un modèle pharmacologique montrant l'utilisation de ligands bivalents pour étudier le couplage des oligomères. / G-protein coupled receptors form a very large family of transmembrane receptors. Numerous studies have shown that these receptors showed a tendency to interact and form oligomers. These structures are however the matter of great debate. Indeed, very few elements allow us to maintain that these oligomers could exist in native tissues, most studies being carried out in heterologous systems. We have therefore developed an approach based for one part on the use of fluorescent ligands to label receptors in their native environment, and on the other part on time-resolved FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer) by using lanthanide cryptates, more specifically Lumi4-Tb. We have thus been able to show and publish the existence of oxytocin receptor oligomers in the mammary gland. The protocol used for this study was also published and validated for the study of hetero-oligomers, more specifically between vasopressin V1a and V2 receptors. Following on our study of oligomers in native tissues, we have developed our own setup to perform time-resolved FRET microscopy. This setup is based on a wide field microscope to which we added a laser source for the pulsed excitation and a Multigate CCD camera for imaging. We are here presenting the first results as well as its validation for the use of multiple acceptor fluorophores with minimal bleed through from the Lumi4-Tb. Lastly, we propose a pharmacological model showing the use of bivalent ligands to study oligomer coupling.

Les récepteurs de chimiokines sont des régulateurs essentiels de la migration cellulaire dans le cadre de la surveillance immunitaire, et le développement. Les récepteurs CCR5 et CXCR4 sont de plus spécifiquement impliqués dans les métastases cancéreuses et l'infection par le VIH. Nous avons développé un système permettant de sur-exprimer ces deux RCPGs. Afin de s'affranchir des problèmes de toxicité inhérents à l'expression des protéines membranaires en bactérie notre approche de production consiste à adresser les protéines vers les corps d'inclusion d'E. coli grâce à une fusion protéique N-terminale permettant de hauts niveaux d'expression. Après purification en conditions dénaturantes, les protéines sont alors repliées en présence de surfactants originaux, les amphipoles. La validation de cette nouvelle approche pour les récepteurs des chimiokines représente un des objectifs principaux de ce travail. Afin de tester la fonctionnalité des protéines repliées, une série d'outils a été développée : des versions modifiées des chimiokines ont été produites (RANTES pour CCR5 et SDF 1a pour CXCR4). La fonctionnalité des chimiokines a été évaluée au niveau moléculaire et cellulaire. L'interaction entre le récepteur replié en amphipole et son ligand a été testé par résonance de plasmons de surface (SPR). Différents types de surfaces fonctionalisées avec le récepteur de chimiokine replié en amphipole ont été explorés au cours de ce travail. A la fin de ce projet, la production des chimiokines et de leur récepteur a été mise au point. L'accès à ces outils ouvre la voie à de futures études moléculaires telles que la compréhension de la dimérisation du récepteur ou la détermination de la stoechiométrie du complexe.

Les récepteurs de chimiokines sont des régulateurs essentiels de la migration cellulaire dans le cadre de la surveillance immunitaire, et le développement. Les récepteurs CCR5 et CXCR4 sont de plus spécifiquement impliqués dans les métastases cancéreuses et l'infection par le VIH. Nous avons développé un système permettant de sur-exprimer ces deux RCPGs. Afin de s'affranchir des problèmes de toxicité inhérents à l'expression des protéines membranaires en bactérie notre approche de production consiste à adresser les protéines vers les corps d'inclusion d'E. coli grâce à une fusion protéique N-terminale permettant de hauts niveaux d'expression. Après purification en conditions dénaturantes, les protéines sont alors repliées en présence de surfactants originaux, les amphipoles. La validation de cette nouvelle approche pour les récepteurs des chimiokines représente un des objectifs principaux de ce travail. Afin de tester la fonctionnalité des protéines repliées, une série d'outils a été développée : des versions modifiées des chimiokines ont été produites (RANTES pour CCR5 et SDF 1a pour CXCR4). La fonctionnalité des chimiokines a été évaluée au niveau moléculaire et cellulaire. L'interaction entre le récepteur replié en amphipole et son ligand a été testé par résonance de plasmons de surface (SPR). Différents types de surfaces fonctionalisées avec le récepteur de chimiokine replié en amphipole ont été explorés au cours de ce travail. A la fin de ce projet, la production des chimiokines et de leur récepteur a été mise au point. L'accès à ces outils ouvre la voie à de futures études moléculaires telles que la compréhension de la dimérisation du récepteur ou la détermination de la stoechiométrie du complexe. / Chemokine receptors are critical regulators of cell migration in the context of immune surveillance, inflammation and development. The GPCRs (G protein-coupled receptors) CCR5 and CXCR4 are specifically implicated in cancer metastasis and HIV-1 infection. An expression system to over-express these two GPCRs was developed. To overcome the toxicity problem of membrane protein expression in bacterial system, the production approach consists in targeting the proteins towards E. coli inclusion bodies thanks to a N-terminal fusion allowing a high yield expression. After purification under denaturing conditions, these GPCRs were then folded using original polymeric surfactants: the amphipols. The validation of this new approach for the chemokine receptor production is one of the goals of this work. In order to assess the functionality of the folded proteins, series of tools have been developed: engineered chemokine ligands (RANTES for CCR5 and SDF1a for CXCR4) were produced. The functionality of chemokines was evaluated at cellular and molecular levels. Interaction between the receptor folded in amphipols and its ligand was evaluated using Surface Plasmon Resonance (SPR) technique. Several types of surfaces, functionalized with the chemokine receptor/amphipol complex have been explored in this work. At the end of this project the productions of chemokines and their receptors has been set up. These established tools open the way to future studies, at the molecular level, in order to, for instance, investigate receptor dimerization and complex stoichiometry.

Les récepteurs de l’ocytocine (OTR) et de la vasopressine (AVPR) sont connus pour être impliqués dans la modulation d’effets centraux complexes. Récemment l’OTR a été proposé comme une cible thérapeutique pour le traitement des troubles du spectre autistique (TSA).Afin de mieux comprendre le rôle de l’OTR et des AVPR dans les TSA, d’éclaircir des nouveaux traits de sa pharmacologie et d’établir des méthodes du criblage sur les récepteurs sauvages, nous avons développé des traceurs pour la tomographie par émission des positons ainsi que des sondes fluorescentes pour la famille OT/AVP des RCPG. Les ligands fluorescents ont été utilisés pour établir un test de liaison TR-FRET pour l’OTR et pour initier le développement du test alternatif sur les récepteurs sauvages. Les radiotraceurs TEP seront bientôt testés chez la souris et chez le singe pour évaluer leurs performances pour la détection des récepteurs de l’ocytocine centraux avant d’envisager des études chez l’Homme. / In order to better understand the role of OTR and AVPR in ASD, to reveal new features in its pharmacology and signaling and to establish high-throughput screening method on wild-type G protein-coupled receptors, we developed imaging probes for the oxytocin-vasopressin receptors family, namely radiotracers for positron emission tomography and optical probes for fluorescence detection and imaging. The fluorescent ligands have been used to establish TR-FRET binding assay for OTR and to initiate the development the screening assay for the wild-type oxytocin receptor. The PET radiotracers will be shortly tested in mice and monkeys to evaluate their potency in detecting the central oxytocin receptors.

Les récepteurs couplés aux protéines G de classe A (RCPG) constituent la plus grande famille de récepteurs transmembranaires du génome humain et sont impliqués dans la régulation de nombreux mécanismes physiologiques. Comprendre les mécanismes évolutifs qui ont conduit à la diversité de cette famille de récepteurs pourrait permettre une meilleure connaissance des relations séquence-structure-fonction des différentes sous-familles. Pour obtenir des informations sur l'évolution des RCPG, nous avons exploré leur espace de séquences par multidimensional scaling métrique (MDS). Nous avons appliqué une nouvelle technique MDS qui projette des séquences supplémentaires sur un espace de référence et permet ainsi la comparaison des séquences de différentes espèces. Les résultats montrent que les récepteurs se répartissent en quatre groupes et suggèrent que les récepteurs actuels ont évolué à partir d'ancêtres des récepteurs de peptides suivant trois directions évolutives principales. Les prolines des hélices transmembranaires 2 et/ou 5 sont impliquées dans deux de ces directions. Pour comprendre le mécanisme fin ayant abouti à la formation des différentes sous-familles, nous avons analysé les covariations des résidus à différents niveaux hiérarchiques (classe/groupe/sous-famille). Nous avons testé différentes méthodes pour analyser les mutations corrélées afin de sélectionner une méthode robuste pour les différents jeux de séquences. L'application de cette méthode met en évidence des résidus spécifiques qui sont cruciaux pour l'évolution de sous-familles particulières.

Les récepteurs couplés aux protéines G (RCPG) de classe A sont les cibles de plus de 25% des médicaments sur le marché et nombreux sont ceux impliqués dans le traitement de la douleur. Les enjeux dans les traitements de la douleur chronique est énorme puisque nombreux sont ceux qui ne répondent pas à la médication usuelle. La recherche de nouvelles avenues thérapeutiques est indispensable afin d’aider les patients dont le soulagement est limité. Le récepteur de la neurotensine de type 2 (NTS2) et le récepteur APJ de l’apéline sont deux RCPG qui pourraient être des cibles pour deux éventuels traitements contre la douleur. Les objectifs de cette thèse étaient de caractériser des analogues synthétiques ciblant les récepteurs NTS2 ou APJ, examiner la distribution de ces récepteurs dans le cerveau, la moelle épinière et les ganglions spinaux pour ensuite déterminer leur implication dans la régulation du contrôle descendant au niveau spinal et supraspinal dans la région bulbaire rostro-ventrale (RVM) en conditions de douleurs aiguë et tonique. Nous avons observé que l’immunoréactivité du récepteur NTS2 était distribuée dans l’axe rostrocaudal de la substance grise périaqueductal (SGPA) et dans tous les noyaux de la RVM. Les résultats sont similaires avec l’anticorps anti-APJ démontrant que ces deux récepteurs sont impliqués dans le contrôle de la douleur. Aussi, les résultats en immunohistochimie dans la moelle épinière ont illustré la présence du récepteur APJ dans les laminae superficielles. Dans les ganglions spinaux, APJ colocalise dans les neurones substance P. Les résultats aux tests comportementaux avec administration intra-RVM d’analogues modifiés neurotensinergiques ont montré une analgésie impliquée par l’activation de NTS2 dans la RVM. L’analgésie provoquée par le récepteur NTS2 serait médiée via la relâche de sérotonine au niveau de la moelle épinière en conditions de douleurs aiguë et tonique. Les résultats en douleur tonique avec les analogues Apeline-13 modifiés en position carboxy-terminale illustrent que les modifications comportant les groupements 2-naphtalenalanine (2 Nal) et de l’acide aminoisobutyrique (Aib) permettent une plus forte analgésie générale, cependant nos expériences à ce jour ne nous permettent pas de statuer sur les différentes voies de signalisation activées dans ces conditions. La modélisation moléculaire pourrait nous aider davantage afin d’explorer les différentes caractéristiques des ligands biaisés. Ces études sur la relation structure-activité, distribution et fonctions des récepteurs NTS2 et APJ dans la modulation de douleur ne sont qu’un début vers des nouveaux traitements contre la douleur.

Les récepteurs couplés aux protéines G (RCPGs) forment la plus grande famille de récepteurs membranaires. Ils transmettent vers l’intérieur de la cellule des signaux extracellulaires d’une grande diversité physiologique. Les différentes classes de RCPGs induisent l'activation de nombreuses voies de signalisation par une multitude de seconds messagers. Le type cellulaire, le contexte du stimulus ainsi que les complexes multiprotéiques recrutés à la membrane plasmique influencent le niveau de spécialisation du signal induit. Le récepteur du thromboxane A? (TP) est exprimé sous deux isoformes, issues d’un épissage alternatif. Les deux isoformes étant régulées différemment au niveau de la signalisation et de la désensibilisation. Dans ce contexte, il est important d’étudier les protéines qui interagissent spécifiquement avec l’une ou l’autre de ces isoformes. Un criblage par double-hybride chez la levure a permis d’identifier une nouvelle protéine d'interaction pour l’isoforme ß de TP (TPß), WDR36 (WD repeat protein 36), une protéine dont la fonction est inconnue. Dans une première étude, nous démontrons que WDR36 interagit directement avec TPß, et que cette interaction est modulée en cellule par la stimulation du récepteur. TP? active la production d’inositol phosphate, qui est augmentée par WDR36. Cette régulation est supportée par l’interaction de WDR36 avec deux effecteurs de la signalisation de TPß, soit G?q et PLCß2. La présence de WDR36 accentue l’interaction entre G?q et PLCß2, et l’interaction entre WDR36 et PLCß2 est modulée par la stimulation de TPß. L'étude des différents mutants de WDR36 associés au glaucome montre qu’ils affectent différemment la production d'inositol triphosphate induite par TPß, comparativement à la protéine de type sauvage. Finalement, nous illustrons que WDR36 induit une activation accrue de ERK1/2 suite à la stimulation de TPß. Ces résultats suggèrent que WDR36 agit à titre de protéine d’échafaudage, servant à favoriser la signalisation de TPß en rapprochant dans un complexe multi-protéique le récepteur TPß et ses effecteurs G?q et PLCß2. Pour faire suite à cette étude, nous avons investigué le rôle de WDR36 dans l'activation de la voie des MAPKs produite par l'activation de TPß. Nous démontrons que WDR36 augmente l’activation de ERK1/2, mais pas de p38 ou JNK. L’activation progresse via la cascade PLCß-PKC-c-Raf-MEK1/2-ERK1/2. L’interaction entre WDR36 et les membres de cette cascade est présente de façon basale et est modulée par la stimulation de TPß. L’expression de WDR36 semble également être importante pour l’interaction c-Raf-ERK1/2 et MEK1/2-ERK1/2. Ces résultats suggèrent que WDR36 assemble un complexe multi-protéique facilitant la phosphorylation et l’activation de ERK1/2. Cette phosphorylation accrue se traduit par une augmentation de la translocation nucléaire de ERK1/2 activées, de la production de c-Fos et de la prolifération cellulaire. Finalement, l’effet positif de WDR36 sur l’activation de ERK1/2 peut également être observé suite à une stimulation des cellules avec des facteurs de croissance retrouvés dans le sérum. Ces deux études supportent un modèle dans lequel WDR36 agit à titre de protéine d'échafaudage dans la signalisation du récepteur TPß en rapprochant ce dernier de ses effecteurs G?q et PLCß2, et en réunissant les membres de la voie d'activation de ERK1/2. Cette caractérisation des rôles de WDR36 est d’autant plus importante, puisque différents variants de WDR36 sont maintenant associés à différents cancers. À cet égard, WDR36 pourrait représenter une nouvelle cible thérapeutique dans la recherche sur le cancer. [symboles non conformes]

Résumé : La protéine Gα[indice inférieur]s est une GTPase hétérotrimérique, actrice principale de la signalisation intracellulaire couplée aux récepteurs couplés aux protéines G (RCPG). Un de ses rôles majeurs est de transmettre l’activation d’un RCPG par un agoniste au niveau de la membrane plasmique, en signal intracellulaire, ceci grâce à un changement conformationnel dû à sa liaison à un GTP. En réponse, la protéine Gα[indice inférieur]s activera principalement la voie de l’AMP cyclique. Or, depuis quelques années, la protéine Gα[indice inférieur]s semble impliquée dans un tout autre phénomène intracellulaire, qu’est le trafic vésiculaire. En effet, sa localisation au niveau du compartiment endosomal laisse perplexe. Certains ont démontré le couplage de cette sous-unité avec des récepteurs internalisés, induisant une signalisation à partir de la membrane endosomale, tandis que d’autres ont démontré une implication de cette sous-unité au niveau du complexe de triage protéique présent sur la membrane endosomale. Ainsi, l’équipe du Dr Farquhar a démontré l’implication de Gα[indice inférieur]s avec la protéine hepatocyte growth factor-regulated tyrosine kinase substrate (HRS) dans la dégradation du récepteur à l’epidermal growth factor (EGF). A travers nos travaux, nous avons pu démontrer une implication générale de la sous-unité Gα[indice inférieur]s dans la régulation de la dégradation endosomale de nombreux récepteurs, comme les RCPG. Nous avons identifié deux complexes, un ubiquitine-indépendant et un ubiquitine-dépendant. Le premier, ubiquitine-indépendant, implique une interaction directe de la protéine Gα[indice inférieur]s avec les proteines GPCR associated sorting protein 1 (GASP-1) et dysbindin. Ces deux protéines ont déjà été démontrées comme étant indispensables à l’adressage du récepteur delta opioïde (DOP) vers le compartiment lysosomal. Nous avons identifié que GASP-1 et dysbindin font le lien entre Gα[indice inférieur]s et HRS, et induisent l’adressage aux lysosomes du récepteur DOP, via les complexes endosomal sorting complexes required for transport (ESCRT). Le second complexe identifié, ubiquitine-dépendant, est spécifique au récepteur C-X-C motif receptor 4 (CXCR4). L’adressage de ce récepteur aux lysosomes fait intervenir de nombreuses enzymes ubiquitine-ligases ainsi que des enzymes déubiquitinases. Nous avons démontré que Gα[indice inférieur]s, via son interaction directe avec l’E3 ubiquitine ligase Deltex 3 like (DTX3L), module l’activation d’une autre E3 ubiquitine ligase atrophin-1 interacting protein 4 (AIP4) et influence l’état d’ubiquitination du complexe ESCRT0, ceci régulant la dégradation du récepteur CXCR4. Paradoxalement, nous avons pu remarquer que les complexes identifiés ne semblent pas affecter les récepteurs couplés à Gα[indice inférieur]s. En effet, les récepteurs connus pour être couplés à la protéine Gα[indice inférieur]s, d’un point de vue signalétique, n’ont pas leur trafic intracellulaire affecté par la déplétion de l’expression de la protéine Gα[indice inférieur]s. De plus, l’état d’activation de Gα[indice inférieur]s ne semble pas influencer ces complexes. / Abstract : The Gα[subscript]s protein is a heterotrimeric GTPase protein, lead actress of intracellular signaling coupled to G protein-coupled receptors (GPCR). One of its major role is to transmit the binding of a ligand on the GPCR at the plasma membrane in intracellular signaling, thanks to a conformational change due to binding to GTP. In response, the activated Gα[subscript]s protein will mainly stimulate the way of cyclic AMP. However, in recent studies, the Gα[subscript]s protein appears to be involved in other intracellular phenomenon, like vesicular trafficking, due to its location at the endosomal compartment. Some studies showed the coupling of this subunit with internalized receptors, inducing signaling from the endosomal membrane, while others have shown implication of this subunit in the protein sorting complex presents on the endosomal membrane. Thus, the team of Dr. Farquhar demonstrated the involvement of Gα[subscript]s protein with hepatocyte growth factor-regulated tyrosine kinase substrate (HRS) protein, in the epidermal growth factor receptor (EGFR) degradation. Through our study, we demonstrated a general involvement of Gα[subscript]s subunit in the regulation of endosomal degradation of many receptors, such as GPCRs. We identified two complexes, an ubiquitin-independent and an ubiquitin-dependent. The first, ubiquitin-independent one, involves a direct interaction of Gα[subscript]s protein with GPCR associated sorting protein 1 (GASP-1) and dysbindin. These two proteins have been previously shown to be essential for delta opioid receptor (DOP) targeting to the lysosomal compartment. We identified that GASP-1 and dysbindin make the link between Gα[subscript]s and HRS, and induce the DOP receptor addressing to lysosomes, via complexes with endosomal sorting complex required for transport (ESCRT). The second complex identified is the ubiquitin-dependent complex, which is specific to the CXC motif receptor 4 (CXCR4). The lysosomal sorting of this receptor involves many ubiquitin ligases and deubiquitinases enzymes. We demonstrated that Gα[subscript]s, through a direct interaction with the E3 ubiquitin ligase Deltex 3 like (DTX3L), modulates the activation of another E3 ubiquitin Atrophin-1 interacting protein ligase 4 (AIP4) and influences the ESCRT-0 ubiquitination pattern. This complex regulates the CXCR4 receptor degradation. Paradoxically, we observed that receptors coupled to Gα[subscript]s are not affected. Indeed, the receptors known to be coupled to the Gα[subscript]s protein have not their intracellular trafficking affected by Gα[subscript]s depletion. Moreover, Gα[subscript]s activation state does not seem to influence these complexes.

Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Les récepteurs couplés aux protéines G (RCPG) représentent la plus grande famille de protéines membranaires. Ils sont activés par une grande variété d'hormones, de neurotransmetteurs, et par des stimuli sensoriels. Ces récepteurs jouent un rôle central dans le contrôle de la grande majorité des fonctions physiologiques et constituent une cible thérapeutique majeure. Plusieurs études supportent l'existence de plusieurs états conformationnels de ces récepteurs stabilisés par les ligands. Le caractère dynamique des RCPG est essentiel dans leur fonctionnement. Une question majeure est de déterminer comment un ligand modifie la structure et la fonction de son récepteur. Pour cela, nous avons analysé les changements conformationnels d'un récepteur prototype de la famille des récepteurs à ligands peptidiques, le sous-type V2 de la vasopressine (V2R). Le V2R présente un large éventail de ligands ayant des efficacités différentes (agoniste partiels et complets, agonistes inverses et antagonistes) ainsi que des agonistes biaisés vis-à-vis des voies de signalisation dépendantes de Gs et des arrestines. Afin de déterminer les bases structurales de l'efficacité (amplitude de la réponse biologique) et de la sélectivité fonctionnelle (la capacité d'un RCPG à activer ou à inactiver préférentiellement une voie de signalisation parmi l'ensemble des voies de transduction auxquelles il est couplé), nous avons purifié et stabilisé le V2R par reconstitution en amphipols neutres (Napols). La fonctionnalité du récepteur a été vérifiée par mesure de son interaction directe avec la protéine Gs et les arrestines purifiés. Les profils d'efficacité des ligands vis-à-vis des deux voies de signalisation sont cohérents avec ceux décrits dans des cellules vivantes. Afin d'aborder directement les changements conformationnels dépendants des ligands, nous avons développé deux approches de fluorescence, la fluorescence intrinsèque des tryptophanes et le LRET (Lanthanide Resonance Energy Transfer). La liaison des ligands ayant des efficacités opposées pour la voie Gs ont induit des variations opposées de la fluorescence intrinsèque des tryptophanes, suggèrant l'existence d'états conformationnels distincts. En parallèle, l'analyse des changements des signaux de LRET entre deux domaines fonctionnels du récepteur marqués par deux fluorophores compatibles, le domaine transmembranaire 6 (TM6) côté cytoplasme et l'extrémité C-terminale distale, a permis de calculer une distance moyenne de 33 Å. En accord avec les variations de fluorescence intrinsèque des tryptophanes, les ligands ayant des efficacités opposées pour la voie Gs ont induit un mouvement opposé de ces deux domaines. Les agonistes complets entraînent un éloignement de la boucle i3 et de l'extrémité C-terminale (+2.4 Å) alors qu'un rapprochement des deux domaines est associé à la liaison de l'agoniste inverse (-0.9 Å). Nos résultats démontrent qu'un récepteur à ligands peptidiques répond à la liaison de ses ligands spécifiques par des changements conformationnels dynamiques. Chaque ligand est caractérisé par un ou plusieurs états conformationnels distincts. De plus, les changements conformationnels du V2R jouant un rôle dans le couplage à Gs sont différents de ceux impliqués dans le recrutement des arrestines. Ces données apportent des éléments essentiels de compréhension des mécanismes moléculaires et structuraux de l'activation des RCPG. A plus long terme, une étude plus extensive de la dynamique des RCPG devrait guider le développement de molécules thérapeutiques possédant des propriétés de sélectivité fonctionnelle. / G protein-coupled receptors (GPCR) are seven-transmembrane proteins that mediate most cellular responses to hormones and neurotransmitters, representing the largest group of therapeutic targets. Several studies support the existence of multiple ligand-specific conformational states of GPCR. The dynamic character of GPCR is likely to be essential for their functioning, and a better understanding of this molecular plasticity might facilitate structure-based drug discovery. A major question is to determine how ligands modify receptor structure and function. To this end, we have been studying the structural dynamics of the human vasopressin type 2 receptor (V2R), a prototypical peptide-activated class A GPCR. The V2R is coupled to Gs protein and to β-arrestins, and it has been well characterized pharmacologically using a large panel of ligands with different efficacies. Several display functional selectivity (Gs activation and concomitant β-arrestin inhibition). To demonstrate that ligand efficacy and functional selectivity are achieved through the stabilization of multiple conformational states, we have purified and reconstituted the V2R in amphipathic polymers (amphipol) and developed fluorescence-based approaches. The functionality of the V2R was monitored by direct activation of the purified Gs protein and interaction with purified β-arrestin 1. In these two assays, the effect of ligands correlated well with their known efficacy in cellular systems. Binding of V2R ligands with opposite efficacies toward Gs pathway led to opposite variations in the tryptophan intrinsic fluorescence of the receptor, suggesting the presence of different conformational states of the receptor. In parallel, we used Lanthanide-based resonance energy transfer (LRET) to directly analyze dynamics of the V2R and more particularly conformational changes between fluorophore-labeled extreme C-terminus and transmembrane domain 6. We calculated a basal mean distance of 33 Å between these domains. Interestingly, ligands with different efficacies towards Gs protein elicited opposite LRET changes as for tryptophan fluorescence spectroscopy. Indeed, the two labeled domains moved away upon full agonist binding (+2.4 Å), and closer in presence of inverse agonist (-0.9 Å). These data provide the first evidence of ligand-specific conformational changes in a peptide-activated receptor, and demonstrate that receptor conformational changes involved in Gs coupling are different from those responsible for arrestin recruitment. The results shed some light into the molecular and structural mechanisms of GPCR activation that may be relevant to the design of signaling pathway-selective drugs.