Submitted by Deborah Santos (deborah.araujo89@gmail.com) on 2018-05-30T20:42:54Z No. of bitstreams: 1 Tese - Deborah Santos.pdf: 12203832 bytes, checksum: e193cc5eef9d1f8e0dd6df5a35d4cc55 (MD5) / Rejected by Ronildo Prado (ri.bco@ufscar.br), reason: Oi , Faltou enviar a Carta comprovante assinada pelo orientador. Solicite o modelo em sua Secretaria de Pós-graduação, preencha e colete a assinatura com o orientador e acesse novamente o sistema para fazer o Upload. Fico no aguardo para finalizarmos o processo. Abraços Ronildo on 2018-06-04T18:07:58Z (GMT) / Submitted by Deborah Santos (deborah.araujo89@gmail.com) on 2018-06-04T19:48:12Z No. of bitstreams: 2 Tese - Deborah Santos.pdf: 12203832 bytes, checksum: e193cc5eef9d1f8e0dd6df5a35d4cc55 (MD5) doc PPGQ.pdf: 706491 bytes, checksum: 90df4e7187c05b6824acb979f9f1cafd (MD5) / Approved for entry into archive by Ronildo Prado (ri.bco@ufscar.br) on 2018-06-06T17:46:22Z (GMT) No. of bitstreams: 2 Tese - Deborah Santos.pdf: 12203832 bytes, checksum: e193cc5eef9d1f8e0dd6df5a35d4cc55 (MD5) doc PPGQ.pdf: 706491 bytes, checksum: 90df4e7187c05b6824acb979f9f1cafd (MD5) / Approved for entry into archive by Ronildo Prado (ri.bco@ufscar.br) on 2018-06-06T17:53:10Z (GMT) No. of bitstreams: 2 Tese - Deborah Santos.pdf: 12203832 bytes, checksum: e193cc5eef9d1f8e0dd6df5a35d4cc55 (MD5) doc PPGQ.pdf: 706491 bytes, checksum: 90df4e7187c05b6824acb979f9f1cafd (MD5) / Made available in DSpace on 2018-06-06T17:53:22Z (GMT). No. of bitstreams: 2 Tese - Deborah Santos.pdf: 12203832 bytes, checksum: e193cc5eef9d1f8e0dd6df5a35d4cc55 (MD5) doc PPGQ.pdf: 706491 bytes, checksum: 90df4e7187c05b6824acb979f9f1cafd (MD5) Previous issue date: 2017-12-01 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / Cathepsin L is a lysosomal cysteine protease, that is related to many physiological processes, however overexpression and up- or downregulation may cause several pathologies. Therefore, cathepsin L became an interesting drug target. Peptidyl epoxides and aziridines are reported as potent cathepsin inhibitors.Previously, our research group has synthesized six new epoxi-α-acyloxycarboxamides through one-pot process starting with an organocatalyzed asymmetric epoxidation using catalyst I followed by Passerini reaction. Then, inhibitory assays against cathepsins K, L and V were performed, and the new compounds presented inhibition, mainly against cathepsin L. In order to further evaluate the structure-activity relationship of epoxi-α-acyloxycarboxamides 11 new compounds were synthesized. Among all, LPSN423 exhibited the best inhibitory activity. The mechanistic study showed that LSPN423 is a reversible tight binding uncompetitive inhibitor, which characterized by a high affinity enzyme-inhibitor complex. To further explore the application of 2,3-epoxi-aldehydes in multicomponent reactions, in addition to create a library of compounds to be evaluated against cathepsin L, Ugi reaction were performed sequentially to epoxidation. The 2-step procedure furnished the desired product with yields ranged from 22% to 68%. The new epoxi-α-acylaminocarboxamides were tested against cathepsin L and no significant activity was observed. The organocatalytic aziridination reaction is reported, however some drawbacks are associated with this reaction, such as the use of chlorinated solvents and large excess of base to promote the reaction. Thus, catalyst I allowed the use of the greener solvent mixture ethanol/water and a lower amount of base. Another drawback of this reaction is the unstable product, so to overcome this issue, the one-pot Passerini reaction was performed, right after the completion of the aziridination; the desired products were obtained from moderate to good yields. Preliminary evaluation of the new aziridine peptidomimetics indicates a potential activity of this class of compounds, although further studies are required. / A catepsina L é uma cisteíno protease lisossomal, que está envolvida em vários processos fisiológicos. Entretanto, falhas na sua expressão e regulação desencadeiam processos patológicos, por esse motivo, a catepsina L se tornou um alvo terapêutico interessante. Peptídeos contendo anéis epóxido e aziridina são reportados como inibidores potentes de catepsinas. Em um estudo prévio desenvolvido pelo nosso grupo de pesquisa, 6 epoxi-α-aciloxicarboxamidas foram sintetizadas de maneira one-pot via reação de epoxidação assimétrica organocatalisada utilizando o catalisador I seguida da reação de Passerini. Testes relacionados à atividade dos compostos como inibidores de catepsinas K, V e L mostraram o potencial da nova classe, sobretudo frente à catepsina L. Neste trabalho, a coleção de epoxi-α-aciloxicarboxamidas foi ampliada com a síntese de mais 11 exemplos, a fim de melhor avaliar a relação estrutura-atividade desta classe de compostos frente à catepsina L. De toda a série, o LPSN423 apresentou a melhor inibição. Estudos sobre o mecanismo de inibição demonstraram que o LSPN423 é um inibidor reversível do tipo tight binding incompetitivo. Neste modo de inibição, o complexo enzima-inibidor apresenta elevada afinidade. Com o intuito de explorar a aplicação dos 2,3-epoxi-aldeídos assimétricos preparados pela metodologia desenvolvida no grupo de pesquisa, bem como criar uma biblioteca de compostos candidatos a inibidores de catepsina L, novas epoxi-α- acilaminocarboxamidas foram sintetizadas, desta vez empregando de forma sequencial a reação multicomponente de Ugi. Os rendimentos em duas etapas variaram de 22-68% para os cinco exemplos sintetizados. Os compostos desta série foram avaliados frente à catepsina L, porém, nenhum deles apresentou atividade inibitória significativa. A síntese de aziridinas assimétricas via organocatálise é reportada tendo como desvantagem a utilização de solventes clorados e excessos de base. O emprego do organocatalisador I proporcionou o uso de etanol:água como solvente e diminuição da quantidade de base. Uma limitação na síntese de β-formilaziridinas está na dificuldade de isolar os produtos, por esse motivo, aplicou-se a funcionalização da aziridina na reação de Passerini one-pot, na qual obteve-se o produto desejado com rendimentos moderados. A avaliação preliminar das aziridinas obtidas frente à inibição da catepsina L indica uma potencial atividade dessa classe de compostos, no entanto estudos mais aprofundados serão necessários. / CNPq: 144095/2014-9

Orientador: Semíramis Guimarães Ferraz Viana / Coorientador: Teresa Cristina Goulart de Oliveira-Sequeira / Banca: Marcelo Vasconcelos Meireles / Banca: Rodrigo Martins Soares / Banca: Pedro Luís Silva Pinto / Banca: Simone Baldini Lucheis / Resumo: Muitas espécies de protozoários podem causar gastroenterite aguda ou crônica em seres humanos e são altamente prevalentes nas populações residentes nos países em desenvolvimento, onde a transmissão é favorecida devido a condições precárias de higiene e escassa disponibilidade de água potável. No entanto, a infecção assintomática e o poliparasitismo também são comumente observados nessas populações. Neste trabalho, investigou-se a prevalência de protozoários intestinais em duas colônias de pescadores, Porto Said (PS) e Santa Maria da Serra (SM), situadas ao longo do rio Tietê, no Estado de São Paulo. As colônias não dispõem de serviços públicos básicos como: vias públicas, fornecimento de água e luz e saneamento básico. Todos os colonos (n = 88 em PS, e n = 38 em SM) coletaram três amostras de fezes, e todos eram assintomáticos no momento da coleta. Para obter informações sobre as possíveis vias de transmissão, amostras fecais de 49 cães (38 de PS e 11 de SM) e 28 amostras de água do rio foram coletadas (16 de PS e 12 de SM). As amostras fecais humanas e caninas foram analisadas por microscopia e PCR para detectar e caracterizar os protozoários Giardia duodenalis, Blastocystis spp., Dientamoeba fragilis e Cryptosporidium spp. Diante dos resultados obtidos, Blastocystis spp. foi o parasita mais prevalente nas amostras humanas (45,4% em PS e 71% em SM), seguido por D. fragilis (13,6% em PS e 18,4% em SM) e G. duodenalis (18,2% em PS e 7,9% em SM), já Cryptosporidium spp. não foi detectado na população humana. Além disso, G. duodenalis foi detectado em quatro cães (10,5%) em PS e dois cães (18,2%) em SM, enquanto que um único cão foi detectado com Cryptosporidium canis. Nas 28 amostras de água previamente processadas pelos métodos de filtração e separação imunomagnética e examinadas por microscopia de fluorescência, oocistos de Cryptosporidium e cistos de Giardia não foram... / Abstract: Several species of protozoa cause acute or chronic gastroenteritis in humans, worldwide. The burden of disease is particularly high among children living in developing areas of the world, where transmission is favored by lower hygienic standards and scarce availability of safe water. However, asymptomatic infection and polyparasitism are also commonly observed in poor settings. Here, we investigated the prevalence of intestinal protozoa in two small fishermen villages, Porto Said (PS) and Santa Maria da Serra (SM), situated along the river Tietê in the State of São Paulo, Brazil. The villages lack basic public infrastructures and services, such as roads, public water supply, electricity and public health services. Multiple fecal samples were collected from 88 individuals in PS and from 38 individuals in SM, who were asymptomatic at the time of sampling and had no recent history of diarrheal disease. To gain insights into potential transmission routes, 49 dog fecal samples (38 from PS and 11 from SM) and 28 river water samples were also collected. All samples were tested by microscopy and PCR was used to genotype isolates of Giardia duodenalis, Blastocystis spp., Dientamoeba fragilis and Cryptosporidium spp. By molecular methods, the most common human parasite was Blastocystis spp. (prevalence, 45% in PS and 71% in SM), followed by D. fragilis (13.6% in PS, and 18.4% in SM) and G. duodenalis (18.2% in PS and 7.9% in SM); Cryptosporidium spp. were not detected. Further, G. duodenalis was found in 4 dogs (10.5%) in PS and 2 dogs (18.2%) in SM, whereas a single dog was found infected with Cryptosporidium canis. River water samples processed by filtration and immunomagnetic separation and examined by fluorescent microscopy, were negative for Cryptosporidium oocysts and Giardia cysts. Sequencing of the barcoding region of the small subunit ribosomal gene revealed large genetic variation among Blastocystis isolates, with subtypes (STs) that ... / Doutor

Modificações epigenéticas tais como metilação do DNA, constituem um mecanismo especial de regulação da expressão gênica envolvido em muitas situações patológicas. Padrões alterados de metilação do DNA são comuns em cânceres e infecções virais. A Paracoccidioidomicose (PCM) é uma infecção fúngica sistêmica, causada pelo fungo termo-dimórfico Paracoccidioides brasiliensis. O Brasil é detentor do maior número de casos na América do Sul. A doença apresenta envolvimento pulmonar primário com disseminação para mucosa oral, pele, sistema retículo-endotelial e glândulas suprarrenais. As lesões orais são caracterizadas por hiperplasia eritematosa finamente granular, salpicadas com hemorragias pontuais chamadas de estomatite moriforme. A finalidade deste estudo foi identificar perfis diferenciais de metilação do DNA em pacientes com e sem lesão oral na PCM. A identificação destes perfis foi baseada na estratégia de MS-AP-PCR (Amplificação arbitrária sensível a metilação). O DNA, extraído do sangue total de pacientes com e sem lesão oral, foi digerido com as enzimas de restrição Hpa II e Msp I. Os produtos da digestão foram amplificados pela técnica de PCR, utilizando iniciadores arbitrários. Foi obtido um perfil diferencial de metilação após a amplificação do DNA de pacientes sem lesão de boca, comparado ao perfil de pacientes com lesão de boca. A banda diferencialmente expressa foi purificada, clonada e os plasmídeos obtidos P5, P6 e P7 foram analisados pelo software PhredPhrap e na ferramenta BLASTN para a obtenção de dados de mapeamento e identidade com as sequências presentes no genoma humano. O fragmento clonado no plasmídeo P5 apresentou similaridade com uma sequência de DNA presente no cromossomo 20, próxima ao gene YTHDF1. Os fragmentos clonados nos plasmídeos P6 e P7 apresentaram similaridade com sequências de DNA presentes no cromossomo 15, sendo que o fragmento P6 apresentou similaridade com uma sequência intrônica do gene RNA binding protein with multiple splicing 2” (RBPMS2) e o fragmento P7 com uma sequência intrônica do gene “diphthamine biosynthesis 6” (DPH6)”. A expressão do gene YTHDF1 em leucócitos foi testada por PCR em tempo real e não houve diferença significativa nos dois grupos de pacientes. Ainda não há descrição na literatura da correlação do gene YTHDF1 com a PCM tornando este estudo inédito e mostrando a importância da análise epigenética para conhecimento dos mecanismos celulares nas condições normais e também patológicas. / Epigenetic changes such as DNA methylation is a specific mechanism for the regulation of gene expression involved in many pathological situations. Altered patterns of DNA methylation are common in cancers and viral infections. Paracoccidioidomycosis (PCM) is a systemic fungal infection caused by a thermo-dimorphic fungus, Paracoccidioides brasiliensis. Brazil is having the largest number of cases in South America. The disease presents primary pulmonary involvement that spreads to oral mucus, skin, reticuloendothelial system, and adrenals. Oral lesions are characterized by erythematous fine granular hyperplasia, and speckled with occasional bleeding called moriform stomatitis. The purpose of this study was to identify profiles of different DNA methylation in patients with and without oral lesions in PCM. The identification of these profiles was based on the strategy of MS-AP-PCR (Methylation-Sensitive arbitrarily Primed PCR). The DNA extracted from whole blood of patients with and without oral lesions was digested with restriction enzymes: Hpa II and Msp I. The digestion products were amplified by PCR (polymerase chain reaction) using arbitrary primers. We obtained a differing profile after amplifying the DNA from patients without mouth lesions compared to the profile of patients with mouth lesions from agarose gel electrophoresis. The differently expressed band was purified and cloned, and the obtained plasmids, P5, P6 and P7, were analyzed by the softwares PhredPhrap and BLASTN tool to obtain mapping data and identify the sequences present in the human genome. The cloned fragment in the plasmid P5 showed similarity with a DNA sequence present in chromosome 20, next to the gene YTHDF1. The fragments cloned in plasmids P6 and P7 showed similarity with the DNA sequences present on chromosome 15, the P6 fragment showed similarity with an intronic sequence from the gene, “RNA binding protein with multiple splicing 2 "(RBPMS2), and the P7 fragment showed similarity with the intronic sequence of the gene "diphthamine biosynthesis 6" (DPH6) ".biosynthesis 6" (DPH6)". The YTHDF1 gene expression in leukocytes was tested by real-time PCR and no significant difference were found in both groups of patients. There is no description in the literature relating the YTHDF1 gene with PCM which has shown the importance of study epigenetic for understanding the cellular mechanisms under normal and pathological conditions.

Com a ampla disseminação da AIDS, uma grande gama de microrganismos tem aparecido como patógenos emergentes, causando importantes infecções em pacientes imunocomprometidos. Por exemplo, Rhodococcus equi, um agente incomum de infecções em humanos, tem sido isolado em pacientes imunocomprometidos. A presença deste microrganismo oportunista em produtos farmacêuticos não tem tido considerável atenção. No presente trabalho, o método de reação em cadeia da polimerase (PCR) foi comparado com métodos convencionais para rápida detecção de três espécies bacterianas em amostras de cremes tópicos contaminadas artificialmente. As amostras foram incubadas por 24 horas a 37ºC. Depois da incubação em caldo com 10% de tween 20, amostras foram semeadas em meio para crescimento seletivo. Identificação bioquímica de Bacillus cereus e Rhodococus equi foram feitas utilizando o sistemas de identificação API 20E® e API Coryne®, respectivamente. Para identificação de Micrococcus luteus foram utilizados os testes de catalase, oxidase, morfologias das colônias e o sistema Gram. O DNA foi extraído usando o método do fenol-clorofórmio. Os iniciadores utilizados contendo a seqüência específica foram para B. cereus (BC1 e BC2), R. equi (COX-F e COX-R) e para M. luteus (ML-ISR-R e ML-ISR-F) foram utilizados na reação de PCR. Para validação da metodologia molecular, as seqüências dos produtos de PCR foram determinadas e analizadas utilizando-se os programas Blastn e Blastx. Foi observado uma alta similaridade (E .value 0,0) e uma alta identidade ( > 99%) para as bactérias utilizadas neste estudo. Os métodos convencional e de PCR detectaram B. cereus, R. equi e M. luteus em todas as amostras contaminadas artificialmente. O tempo para completar o método de PCR incluindo o preparo de amostras e a amplificação específica do DNA bacteriano foi de 27 horas. Para o método convencional foi necessário de 72 a 96 horas para o isolamento e identificação bioquímica dos microrganismos pesquisados. A rápida detecção de PCR para B. cereus, R. equi e M. luteus mostrada neste trabalho sugerem o uso desta metodologia em controle de qualidade microbiológica de produtos tópicos não estéreis, especialmente utilizados por pacientes imunocomprometidos. / With the ample dissemination of the AIDS, a wide range microorganisms has blunted as emergent pathogens, causing important infection in immunocompromised patients. For example, Rhodococcus equi, an unusual cause of infection in humans, has been isolated from HIV-infected patients. The presence of these opportunistic microorganisms in pharmaceutical products has not receiv considerable attention. In the present work PCR assay were compared with standard microbiological methods for rapid detection of three bacterial species from artificially contaminated sample of topical creams. Artificially contaminated samples were incubated for 24 horas at 37º C. After incubation in broth with 10% tween 20, samples were streaked on seletive growth media. Biochemical identification of Bacillus cereus and R. equi was performed using API 20E® and API Coryne® identification systems, respectivelly. For Micrococcus luteus identification, colony an Gram-stained morphology of the bacterium and the biochemical tests of catalase and oxidase were used.DNA was extracted using phenol-chloroform method. DNA primers containing the specific sequences of the BC1 and BC2 for B. cereus, COX-R and COX-F for R. equi and ML-ISR-F and ML-ISR-F for M. luteus were used for detection in the PCR reaction. In order to validate this methodology, DNA sequences of the products were determined. The sequences of the cloned PCR products were analysed using Blastn and Blastx programs. It was observed a marked similarity (E.value 0,0) and a high identity (> 99%) to the bacteria used in the study. Both the PCR and the standard enrichment tests method detected B. cereus, R. equi and M. luteus in all of the deliberately contaminated samples. The time to complete the PCR assay including sample preparation and PCR amplification of the specific DNA bacterial targets was 27 h. Standard plating methods required 72-96 h for the bacteria to be isolated, purified and biochemecally identified. Rapid PCR detection of B. cereus, R. equi and M. luteus showed in this work suggests the use of this methodology in the microbiology control of non-sterile topical products, specially intended for use with immunocompromised patients.

Nos últimos anos o aumento na incidência de candidose superficial e invasiva causada por espécies emergentes resistentes tem sido atribuído a disseminação do uso de antibióticos e agentes imunossupressores. O aumento de Candida não-albicans deve-se ao incremento de pacientes imunodeprimidos, neutropênicos, recém nascidos de baixo peso, procedimentos invasivos e iatrogenia. Todos esses fatores permitem que agentes pouco virulentos, causem doenças. Vários estudos bioquímicos e moleculares foram realizados no sentido de elucidar as causas da resistência a antifúngicos em leveduras. Os objetivos do presente estudo foram: estudar leveduras do gênero Candida isoladas da cavidade bucal de pacientes com e sem HIV; comparação de métodos de identificação dos isolados; determinar o perfil de sensibilidade aos antifúngicos anfotericina B e fluconazol pelas metodologias de microdiluição CLSI, AFSTEUCAST e difusão em agar Etest e obter amostras heterorresistentes à anfotericina B e ao fluconazol por indução e seleção. Foram identificados 22 isolados de C. albicans, 3 de C. tropicalis, 3 de C. parapsilosis e 2 de C. glabrata segundo o método clássico. A identificação por métodos morfológicos e bioquímicos foi 100% concordante com o método molecular (PCR), tanto pela amplificação dos primers espécies-específicos (C. albicans e C. dubliniensis) quanto pela comparação do tamanho do fragmento amplificado pelos primers da região ITS2. A correlação entre a metodologia Etest e os dois métodos de microdiluição foi alta. Todas as amostras selvagens foram sensíveis a anfotericina B (CIM£2,0μg/mL) e apenas um isolado (3,33%) de C. tropicalis foi resistente ao fluconazol (CIM³64,0μg/mL por CLSI e CIM³64,0μg/mL por AFST-EUCAST). Foram selecionadas amostras heteroresistentes através da pressão seletiva utilizando meio adicionado de fluconazol (8μg/mL) e em seguida com anfotericina B (1,0μg/mL). A pressão seletiva também foi feita iniciando-se com anfotericina B e em seguida fluconazol. Paralelamente, as amostras selvagens foram submetidas à indução de resistência através do cultivo primeiro em concentrações crescentes de fluconazol (16,0; 32,0; 64,0; 128 e 256mg/mL) e em seguida com anfotericina B (0,5; 1,0; 1,5; 2,0; 2,5 e 3,0mg/mL). Os testes também foram feitos invertendo-se os antifúngicos, iniciando com anfotericina B e depois fluconazol. Foram obtidas três amostras heterorresistentes a fluconazol, das quais duas foram por indução (C. glabrata e C. tropicalis) e uma por seleção (C. tropicalis.). Ambas amostras de C. tropicalis foram originadas de um mesmo isolado selvagem. Nenhuma amostra mudou seu perfil de sensibilidade para anfotericina B, apesar de alguns isolados apresentarem capacidade de crescimento em várias concentrações deste antifúngico (1,0 a 3,0μg/mL). Após cultivos sucessivos em meio livre de droga, somente a cepa obtida por seleção manteve seu fenótipo de resistência. As cepas selvagens e suas mutantes apresentaram o mesmo perfil quando comparadas pela amplificação da região ITS2. Conclui-se que, embora a maior parte das espécies estudadas seja C. albicans (73,33%) todas as amostras heteroresistentes ao fluconazol obtidas foram Candida nãoalbicans (10%). As duas cepas mutantes obtidas pelo mesmo isolado inicial possuem, possivelmente, mecanismos múltiplos e distintos de resistência que, associado ao isolado, conferem resistência e/ou adaptabilidade à levedura frente ao antifúngico. / In the last years the increase in the incidence of superficial and invasive candidosis caused by resistant species has been attributed to the use of antibiotics and immunosuppression drugs. The increase do Candida non-albicans isolate due to the increment of patient immunocompromised, immunodeficiency virus infection, neutropenic, newly born of low weight, procedures invasives and iatrogenic. All those factors allow that agents a little virulent, caused diseases. Several biochemical and molecular studies have been accomplished for elucidating the causes of resistance in yeasts. The aims of the present research were: to study yeasts of the gender Candida isolated of the buccal cavity patients with and without HIV; comparison of methods of identification of isolates ; to determine the sensibility profile to the amphotericin B and fluconazole antifungals by microdilution methodologies CLSI, AFST-EUCAST and Etest difusion agar and acquisition of heteroresistent samples to amphotericin B and to fluconazole by induction and selection experiments. Were identifications 22 C. albicans, 3 C. tropicalis, 3 C. parapsilosis and 2 C. glabrata through the classic methods. The identification by morphologic and biochemisth was 100% agreement with the results obtained by the molecular method (PCR), them by the amplification of the species with specific primers (C. albicans and C. dubliniensis) as for the comparison of the size of the fragment amplified by the primers of region ITS2. The correlation among the methodology Etest and the two microdilution methods (CLSI and AFST-EUCAST) was higth. All samples wilds were suscetibility to amphotericin B (CIM£2,0μg/mL) and just one isolate (3,33%) of C. tropicalis was resistent to fluconazole (CIM³64,0μg/mL por CLSI e CIM³ 64,0μg/mL por AFST-EUCAST). Resistant strains were obtained by selective pressure using a medium amended with Fluconazole (8 μg/mL) and after that a medium with Amphothericin B (1.0 μg/mL). The selective pressure was also performed using Amphothericin B at first followed by Fluconazole. Similarly, wild samples were submitted to the induction of resistance by culturing in increasing concentrations of Fluconazole (16.0; 32.0; 64.0; 128 e 256mg/mL) followed by culturing in increasing concentrations of Amphotericin B (0.5; 1.0; 1.5; 2.0; 2.5 e 3.0mg/mL) and, after that, inverting the antifungal agents: Amphotericin B at first, followed by Fluconazole. Three samples heteroresistant to Fluconazole were obtained, two of which obtained by induction (C. glabrata and C. tropicalis) and one by selection (C. tropicalis.). Both C. tropicalis samples were originated from te same wild strain.None sample chamged its susceptibility profile to amphotericin B, in spite of some isolates that presented capacity of growth in several concentrations of this antifungals (1,0 a 3,0μg/mL). After successive cultivations in medium free of drugs, only the sample obtained by selection maintained your resistance phenotype. The wild samples and their mutants presented the same profile when compared by the amplification of the region ITS2. In conclusion, although most of the studied species were C. albicans (73,33%), all the fluconazol-heteroresistant samples obtained were Candida no-albicans (10%). The two mutant samples obtained from the same initial isolate possibly possess multiple and different mechanisms of resistance that, associated to the isolate, confer resistance and/or adaptability to the yeast in front to antifungal. / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES

Nosso grupo de pesquisa já vem há alguns anos estudando métodos para a síntese do núcleo estrutural dos furanoeliangolidos, mais especificamente do goiazensolido. A estrutura básica deste composto corresponde a um sistema 7-oxabiciclo [6.2.1] undecano, e ele possui atividades biológicas como esquistossomicida, citotóxica e antiinflamatória. Em nosso trabalho utilizamos como etapa chave a reação de Diels-Alder, que é geralmente eficiente e rápida para formação de sistemas policíclicos. Na ultima etapa da proposta sintética, propomos a clivagem da ligação interna do sistema policíclico para obtenção do macrociclo desejado. / Our research group has been studying, for some years, new methods for the synthesis of the core structure of the furanoheliangolides, more specifically of goyazensolide. The basic structure of this compound is a 7-oxabicyclo [6.2.1] undecane system, and it shows biological activities such as schistosomicidal, cytotoxic and anti-inflammatory. In this work, we have used the Diels-Alder reaction as a key step, since it is usually fast and efficient for the synthesis of polycyclic structures. As a last step, we proposed that the cleavage of the internal bond of the rings should furnish the desired macrocycle.

Orientador: Adriane Pinto Wasko / Banca: Claudio Oliveira / Banca: Lucia Giuliano Caetano / Resumo: Grande parte do genoma dos eucariotos é composta de múltiplas cópias de DNA, conhecidas como DNAs repetitivos, cuja função em relação à manutenção, estrutura e funcionamento do genoma ainda precisa ser melhor investigada. Os DNAs repetitivos classificados como elementos transponíveis vêm sendo considerados como um dos principais representantes do genoma de vertebrados e, de maneira particular, os peixes têm chamado atenção em relação à grande diversidade de classes destes elementos encontradas em seus genomas. Visando ampliar os dados acerca de elementos transponíveis em peixes, o presente trabalho teve como objetivos o isolamento e a caracterização de retrotransposons da família Rex em duas espécies de Characidae - Brycon amazonicus e B. orbignyanus - e realizar inferências acerca de sua organização e dinâmica evolutiva. Desta forma, amostras de DNA foram utilizadas em PCR (Polymerase Chain Reaction) para amplificar segmentos dos retroelementos Rex1, Rex3 e Rex6 e os fragmentos obtidos foram clonados e sequenciados. Adicionalmente, estes segmentos de DNA foram utilizados como sondas em experimentos de hibridação in situ visando identificar a localização cromossômica destes retrotransposons. A identificação de elementos Rex em B. cephalus e B. orbignyanus demonstrou a presença destes retrotransposons não-LTR (Long Terminal Repetition) em um maior número de espécies de Characiformes e, especificamente, no grupo Characidae. Os segmentos analisados de Rex1 e Rex3 correspondem aos domínios codificantes 3-7 e 1, 2, 2A, A e B do gene da transcriptase reversa (RT), respectivamente. O fragmento de DNA relativo ao retroelemento Rex6 isolado codifica a porção C-terminal de uma endonuclease. Comparações entre sequências nucleotídicas de diferentes espécies de peixes... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: A huge part of the eukaryote genome is constituted by multiple DNA copies, known as repetitive DNAs, which role regarding to the maintenance, structure, and function of the genome needs to be better understandable. The repetitive DNAs that are classified as transposable elements have been considered one of the main parts of the vertebrate genome and, particularly, fishes have gain attention due to the presence of many different classes of these elements in their genomes. In order to improve data on fish transposable elements, the present work intent to isolate and characterize retrotransposons of the Rex family in two Characidae species - Brycon amazonicus and B. orbignyanus - and infer on the organization and evolutionary dynamics of these elements. Therefore, DNA samples were used on PCR (Polymerase Chain Reaction) in order to amplify segments of the Rex1, Rex3, and Rex6 elements, and the obtained fragments were cloned and sequenced. Additionally, these DNA segments were used as probes throughout in situ hybridization procedures to identify the chromosome localization of these retrotransposons. The identification of Rex elements in B. cephalus e B. orbignyanus evidenced the presence of these non-LTR (Long Terminal Repetition) retrotransposons in a large number of Characiformes species and, specifically, in Characidae. The analyzed fragments of Rex1 and Rex3 correspond to the coding domains 3-7 and 1, 2, 2A, A and B of the reverse transcriptase (RT) gene, respectively. The DNA segment correlated to the Rex6 element codifies a C-terminal portion of an endonuclease. Nucleotide sequence comparisons among different fish species showed that these regions are highly conserved in diverse groups. Although the obtained data for B. amazonicus seemed to point to a higher similarity between Rex1 and Rex3 of... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

Orientador: Virgínia Bodelão Richini-Pereira / Resumo: A família Trypanosomatidae é constituída por diversas espécies de protozoários que causam doenças em humanos e outros animais. Destacam-se os protozoários Leishmania spp. causadores das leishmanioses e Trypanosoma spp. causadores da doença de Chagas. O cão doméstico é considerado o principal reservatório da leishmaniose no meio urbano, porém o homem e animais silvestres também podem ser infectados atuando como reservatórios de tripanossomatídeos. O objetivo do presente estudo foi avaliar a ocorrência de Leishmania spp. e Trypanosoma spp. em amostras provenientes de animais silvestres atropelados, procedentes do estado de Santa Catarina pela técnica molecular de Reação em Cadeia da Polimerase (PCR), a fim de mapear e identificar áreas de risco para a infecção humana. Foram coletadas 1063 amostras de tecido pulmão, fígado, baço, pele e coração de 297 animais silvestres. Utilizou-se primers LITST/L5.8S e LITSV/L5.8SR para triagem da família Trypanosomatidae, onde 12 amostras de sete roedores foram positivas. Na pesquisa de L. infantum e T. cruzi foram utilizados primers específicos, LCS1/LCS3 e TCZ1/TCZ2 respectivamente, sendo todas as amostras foram negativas. O sequenciamento foi realizado a partir das amostras positivas e nove amostras apresentaram similaridade entre 79% a 100% com Trypanosoma brucei (GenBank KX700175.1), Trypanosoma brucei gambiense (GenBank XM_011780373.1), Trypanosoma vivax (GenBank HE573020.1), Trypanosoma rangeli (GenBank KJ742907.1) e com o gênero Trypa... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: The family Trypanosomatidae consists several species of protozoans that cause diseases in humans and other animals. Leishmania spp. is responsible to cause leishmaniasis diseases and Trypanosoma cruzi cause Chagas disease. The domestic dog is considered the main reservoir of leishmaniasis, although wild animals can also be acting as reservoirs of trypanosomatids. The objective of the present study was to evaluate the occurrence of the Leishmania spp. and Trypanosoma spp in samples from wild animals from Santa Catarina State, using the molecular technique Polymerase Chain Reaction (PCR), in order to map and identify risk areas for human infection. A total of 1,063 tissue samples of lung, liver, spleen, skin and heart of 297 wild animals. Primers (LITST / L5.8S and LITSV / L5.8SR) were used for screening of Trypanosomatidae family, with samples from seven rodents were positive. In the research of L. infantum and T. cruzi specific primers were used, where all the samples were used, LCS1 / LCS3 and TCZ1 / TCZ2 respectively, all of which were negative. Sequencing was performed from the positive samples and nine samples from five animals showed similarity between 79% to 100% with Trypanosoma brucei (GenBank KX700175.1), Trypanosoma brucei gambiense (GenBank XM_011780373.1), Trypanosoma vivax (GenBank HE573020.1), Trypanosoma rangeli (GenBank KJ742907.1) and the genus Trypanosoma spp. The animals were, Oxymycterus sp. (marsh rat), Scapteromys sp. (water rat), Nectomys squamipes (wat... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

A atenção encontra-se incluída no grupo de funções psíquicas, agrupadas sob o nome de funções cognitivas que subsidiam o processo de aprendizagem escolar. Em relação à atenção visual, a literatura vem apontando a existência de diferenças no tempo de reação a estímulos visuais entre escolares com e sem distúrbios de aprendizagem (DA). Neste sentido, o objetivo deste estudo foi caracterizar a função atencional visual em escolares com DA. Participaram deste estudo 50 escolares, sendo 25 com o diagnóstico de distúrbio de aprendizagem, formando o grupo de estudo (GE), e 25 crianças sem queixas escolares, formando o grupo controle (GC), com faixa etária entre oito e 14 anos de idade. Os instrumentos utilizados foram o Teste de Atenção Visual (TAVIS4), um teste computadorizado composto por três tarefas para avaliar a capacidade atentiva de sustentar, selecionar e mudar o foco de atenção para estímulos visuais e da impulsividade motora, e a Escala de Conners na forma abreviada para professores, apropriado para discriminar crianças com problemas de comportamento e com sintomas de TDAH. Os resultados evidenciaram que o tempo de reação médio (TRM) do GC foi significativamente menor que o do GE na tarefa de atenção sustentada. O GE também apresentou diferença estatística significativa na atenção alternada, com menor número de acertos (NA), maior número de erros por omissão (EO) e maior número de erros por ação (EA). Na Escala de Conners a pontuação do GE foi maior do que do GC. Houve correlação entre os testes nas tarefas de atenção alternada e nas tarefas de atenção sustentada para o número de acertos (NA), erros por omissão (EO) e erros por ação (EA). Podemos inferir que as crianças com DA apresentam déficit dos processos atencionais, embora não possam ser caracterizadas com o TDAH. No subgrupo dos adolescentes houve diferença significativa na atenção seletiva para o número de erros por omissão (EO), no TRM da atenção sustentada e na atenção alternada para número de erros por omissão (EO) e erros por ação (EA). Houve correlação entre os testes, neste subgrupo do GE e GC na atenção seletiva para o número de acertos (NA), erros por omissão (EO) e erros por ação (EA). Portanto, os maiores índices apontados na escala (déficit atencional) estão associados aos piores resultados dos participantes nas tarefas de atenção alternada e sustentada. Pode-se observar que quanto maior a idade dos participantes, melhor é a capacidade de atenção seletiva, sustentada e alternada. Desta maneira, o TMR mais baixo do subgrupo dos adolescentes em comparação com o grupo geral pode evidenciar a melhora da atenção com o desenvolvimento. Porém, os adolescentes do GE apresentaram melhor desempenho do que as crianças, ou seja, algumas alterações notadamente persistem quando comparadas ao GC sugerindo uma disfunção dos mecanismos neuropsicológicos subjacentes ao processamento da atenção visual nos adolescentes com DA. / Attention is included in the group of psychic functions, grouped under the name of cognitive functions, and that support the learning process in school. Regarding the visual attention, literature has pointed to the existence of differences in reaction time to visual stimuli between students with and without learning disabilities (LD). In this sense, the purpose of this study was to characterize the visual attentional function in children with LD. A total of 50 students, including 25 with learning disorders without signs of Attention Deficit Disorder and Hyperactivity Disorder (ADHD), forming the study group (SG), and 25 children without impairments, forming the control group (CG) , aged between eight and 14 years old. The instruments used were the Test of Visual Attention (TAVIS4), computerized test consists of three tasks to assess the ability to sustain attentional, select and change the focus of attention to visual stimuli and motor impulsivity, and the Scale of the Conners abbreviated form for teachers, appropriate to discriminate children with behavior problems and ADHD signs. The results showed that the hit reaction time (HRT) of the CG was significantly less than the SG in the sustained attention task. SG also showed statistically significant differences in the alternating attention, with less number of right answers (RA), higher number of omission errors (OE) and higher number of commissions errors (CE). Scale of the Conners scores of GE was higher than the GC. There was a correlation between tests in alternating attention tasks and sustained attention tasks to the number of right answers (RA), omission errors (OE) and commission errors (CE). We may deduce that children with LD have deficits of attentional processes, although they cannot be characterized with ADHD. In the subgroup of adolescents was significant difference in selective attention to the number of omission errors (OE), the HRT of sustained attention and alternating attention to the number of omission errors (OE) and commission errors (CE). There was a correlation between tests, this subgroup of SG and CG in selective attention to the number of right answers (RA), omission errors (EO) and commissions errors (CE). So, the highest rates indicated on the scale (attentional deficits) are associated with worse outcomes of participants in the tasks of sustained and alternating attention. It can be observed that the higher the age of the participants, the better the ability of selective attention, sustained attention and alternating attention. That way, the HMT less subgroup of adolescents compared with the overall group may show an improvement in attention to development. However, adolescents SG improved their attentional capacity, but some changes persist especially when compared to CG suggesting a dysfunction of neuropsychological mechanisms underlying the processing of visual attention in adolescents with LD.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:22:16Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2013-02-22Bitstream added on 2014-06-13T19:48:27Z : No. of bitstreams: 1 panoff_b_me_botfca.pdf: 479570 bytes, checksum: 18963582936b7c7dfc0dd966e4523c3d (MD5) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Devido ao aumento do número de cultivares de soja e com pouca diferença genética entre elas, fica cada vez mais difícil a verificação de contaminação varietal pelo método de peroxidase. As cultivares de soja são separadas em dois grupos com base na atividade, alta ou baixa, da peroxidase no tegumento. A alta atividade é resultado da presença de, pelo menos, um alelo dominante (EpEp ou Epep), enquanto que baixa atividade resulta da presença do par recessivo (epep). O auxílio de técnicas moleculares na identificação de contaminação varietal de soja utilizando a peroxidase é de grande importância, pois a tecnologia baseada na análise do DNA não sofre a ação de fatores externos (ambientais). Neste contexto, o objetivo geral do trabalho foi o de viabilizar a técnica de PCR convencional para verificar a presença de contaminação varietal em auxílio ao método colorimétrico da peroxidase. O estudo foi conduzido no Departamento de Produção Vegetal da Faculdade de Ciências Agronômicas/UNESP, Campus de Botucatu-SP. Foi realizado o teste colorimétrico tradicional e comparado com os resultados encontrados no PCR. Foram usadas 14 cultivares de importância, dessas, foram pré-selecionadas seis cultivares com reação positiva à peroxidase: BRS 320, BRS 284, BRS 232, BRS 7860RR, BRSMG 760SRR, BRS295RR, quatro cultivares negativas à peroxidase: BRS 326, BRS 8160RR, Nutrisoy, BRS Valiosa RR e quatro cultivares com reação positiva e negativa: BRSGO 8060, BRS 270RR, FTS Campo Mourão e BRS 239. Em paralelo ao teste colorimétrico, o DNA foi extraído das sementes inteiras, primers foram desenhados, seguido da reação de PCR e eletroforese em gel de agarose. A utilização de kit comercial de extração de DNA, juntamente com a utilização da técnica de PCR foi eficiente na detecção de amostras de sementes... / The increasing number of soybean cultivars and the small genetic difference between makes difficult to verify varietal contamination using the conventional peroxidase method. The soybean cultivars are separated into groups with high or low activity, based on the peroxidase activity in the tegument,. The high activity is a result of the presence of at least one dominant allele (or EpEp Epep), while low activity results from the presence of the pair recessive (epep). The use of molecular techniques to identify soybean cultivars is a powerful tool since it is not influenced by external factors (environmental) or genetic. In this context, the general objective of this work was to enable the use of molecular biology technique to facilitate identification of soybean cultivars. The study was performed at the Department of Plant Production, Faculty of Agricultural Sciences / UNESP, Botucatu-SP. Traditional biochemical colorimetric test was performed and compared with the results of obtained by conventional PCR. Fourteen commercial soybean cultivars were used, where we selected six cultivars with positive reaction to peroxidase: BRS 320, BRS 284, BRS 232, BRS 7860RR, BRSMG 760SRR, BRS295RR, four cultivars with negative reaction to peroxidase: BRS 326, BRS 8160RR, NutriSoy, BRS Valiosa RR and four cultivars with positive and negative reaction: BRSGO 8060, BRS 270RR, FTS Campo Mourão and BRS 239. In parallel with the traditional colorimetric assay for peroxidase, DNA was extracted from whole seeds and primers were designed, followed by conventional PCR reactions and visualization in agarose gel. The use of commercial kit for DNA extraction along with the use of the PCR technique was efficient in detecting negative and positive samples. However, when seed lots with positive reaction was purposely contaminated seed lots with negative reaction at the proportion of 1, 2, 3, 4 and 5%, the PCR technique was not sensible enough to detect the contamination