Introdução - A Infecção do Trato Urinário (ITU) é uma das doenças mais comuns, especialmente em mulheres jovens e sexualmente ativas, causada, na maioria das vezes, pela Escherichia coli. Este estudo objetiva analisar os fatores de risco associados com este tipo de infecção, além de estudar o perfil de resistência à genotipagem da E. coli. Pacientes e métodos - Foram avaliados 62 pacientes femininas, residentes em Santa Cruz do Sul, com idade variando entre 18 a 84 anos, com o diagnóstico ambulatorial de ITU não complicada. O diagnóstico foi estabelecido na presença de sintomas urinários e urocultura com a contagem superior a 105 UFC/mL. Os pacientes responderam a um questionário para obtenção de dados clínicos. A sensibilidade dos isolados de E. coli frente aos antimicrobianos foi determinada usando o método de difusão em disco em meio Mueller Hinton. A genotipagem foi realizada através da técnica de reação em cadeia da polimerase baseada na região consenso repetitivo intergênica. Resultados: O perfil de resistência bacteriana aos antibióticos testados foi de 22,6% para a sulfametoxazol-trimetoprim, 19,3% para a cefalexina, 8,1% para a norfloxacina, 4,8% para a gentamicina e 3,2% para a nitrofurantoína. A genotipagem revelou que 43,5% dos isolados clínicos de E. coli apresentavam relação clonal. A comparação dos dados clínicos dos pacientes que eram portadores de cepas formadoras de clones com os que não eram, revelou que não houve diferença entre os dois grupos em relação ao perfil de resistência, idade da primeira infecção urinária, atividade sexual, história de doença renal no passado, número de episódios de ITU, hospitalização, uso prévio de antibióticos nos últimos 2 meses e presença de animal de estimação em casa. A análise dos grupos classificados pelo resultado da genotipagem quanto ao perfil de resistência revelou que não há diferença estatisticamente significante nos níveis de resistência à cefalexina, à gentamicina, à nitrofurantoína, à norfloxacina e à sulfametoxazol-trimetoprim nos diferentes clones observados. Conclusão: O perfil de resistência da E. coli aos antibióticos testados mostrou altos níveis de resistência à SMT e à cefalexina. A genotipagem da E. coli identificou, em 43,5% dos isolados, a presença de uma relação clonal embora não tenha sido observado uma associação da relação clonal com perfil de resistência e variáveis clínicas.

Mancha marrom ou Helmintosporiose é uma das principais doenças do trigo, causada pelo fitopatógeno Bipolaris sorokiniana, sendo responsável por grandes perdas econômicas no cultivo do trigo no mundo inteiro. Este fungo apresenta uma grande diversidade morfológica, fisiológica e genética. Com objetivo de caracterizar a diversidade molecular de amostras monospóricas de B. sorokiniana isolados de sementes do Brasil e outros países, foram utilizados 60 isolados monospóricos tendo o DNA genômico desses isolados sido submetidos à amplificação por PCR. Foram utilizados 12 oligonucleotídeos iniciadores universais construídos a partir de sequências repetidas do genoma do arroz (URP). Os perfis gerados foram analisados pelo método de médias aritméticas não ponderadas (UPGMA). O método PCR – URP permitiu obter informações importantes sobre o perfil genético das culturas monospóricas mostrando distinções entre os três conídios isolados oriundos da mesma cepa polispórica. Os oligonucleotídeos URP-30F, URP-6R, URP-17R e URP-38Famplificaram com um elevado índice de isolados. Em contra partida, os oligonucleotideos URP-13R, URP- 25F e URP-32F apresentaram um perfil de amplificação menor entre os isolados do fitopatógeno. O número total de fragmentos gerados com cada um dos oligonucleotídeos variou entre 41 e 77 fragmentos. Os oligonucleotídeos URP-17R, URP-30F, URP-32F e URP-6R apresentaram maior índice de fragmentos polimórficos. Os isolados apresentaram uma grande diversidade intra-especifíca entre os oligonucleotideos iniciadores URP e entre os conídios monospóricos. A análise forneceu informações relevantes sobre a variabilidade genética e a relação entre os isolados de B. sorokiniana. / Leaf spot disease or helmintosporiosis is one of the most important diseases of wheat cultures caused by the phytopathogem Bipolaris sorokiniana. It is responsible for great economic loss of wheat cultivation worldwide. This fungus presents a great morphologic, physiologic and genetic diversity. The aim of this study was to characterize the molecular diversity of B. sorokiniana monosporic isolates isolated from seeds from Brazil and other countries. For this purpose 60 monosporic isolates were used. The genomic DNA of this isolates were submitted to PCR amplification using 12 universal primers built from repeated sequences of rice genome (URP). The analysis of the amplification profile were calculated by Unweighted Pair Group Arithmetic Mean (UPMGA) Method. The PCR-URP method provided important information about the genetic profile to the monosporic culture, showing distinctions between the three spore isolates of the same polysporic strain. The primers URP-30F, URP-6R, URP-17R and URP-38F were able to amplify a higher percentage of the isolates been the more efficient in the study of this phytopathogen. However, the primers URP-13R and URP-32F have shown a lower amplification profile between the B. sorokiniana isolates. The number of fragments that resulted from the amplification of each primer had varied between 41 and 77 fragments. The primers URP-17R, URP-30F, URP-32F and URP-6R generated a higher number of polymorphic fragments with the isolates. The analysis provided relevant information about the variability and genetic relationship between B. sorokiniana isolates.

O papel dualístico exercido por Enterococcus na natureza estimula a pesquisa dos fatores que determinam sua virulência. O objetivo desse estudo foi investigar a distribuição de genes envolvidos com fatores de virulência entre isolados de Enterococcus e sua correlação com a capacidade de formação de biofilme e confirmar a identificação de E. casseliflavus e E. gallinarum por PCRRFLP. Foram analisados 66 isolados clínicos e 70 alimentares quanto a presença dos genes gelE, esp, agg, ace e cylA por PCR e atividade de gelatinase e citolisina. Isolados clínicos apresentaram maior incidência de fatores de virulência quando comparados com alimentares, exceto para os genes gelE e ace. Em ambas amostragens houve a ocorrência de isolados positivos para os genes gelE e cylA, porém sem atividade enzimática, indicando a presença de genes silenciosos. A maioria dos isolados apresentou capacidade de formação de biofilme, entretanto não houve uma correlação entre os genes analisados e o fenótipo de formação de biofilme, porém é possível que o gene ace e gelE atuem como potencializadores na formação de biofilmes em Enterococcus. Para testar a técnica de PCR-RFLP, 32 e 20 isolados de E. gallinarum e E. casseliflavus, respectivamente, identifcados bioquimicamente foram avaliados. O fragmento de 661 bp correspondente a uma região conservada do 16S rDNA foi clivado com HinfI e 47% E. gallinarum e 25% E. casseliflavus apresentaram fragmentos de 589bp e 72bp, padrão esperado para o PCR-RFLP. Assim sendo, a PCR-RFLP mostrou ser uma ferramenta molecular útil na confirmação das espécies E. casseliflavus e E. gallinarum. / The dualistic role played by enterococci in the nature, encourages the study of virulence factors. The aim of this study was to investigate the distribution of genes involved in virulence among Enterococcus isolates and to correlate with biofilm formation ability and to confirm the identification of Enterococcus gallinarum and Enterococcus casseliflavus isolated from clinical and food samples by PCR-RFLP. Sixty six clinical and 70 food isolates were analyzed for the presence of gelE, esp, agg, ace and cylA genes by PCR and the gelatinase and cytolysin activities. Clinical isolates showed a higher incidence of virulence factors when compared to food isolates, except for gelE and ace genes. In both samples was observed the occurrence of isolates positive for gelE and cylA genes, but with no enzymatic activities, indicating the presence of silent genes. Most isolates showed ability to form biofilm, although there was no correlation between the presence of the genes and the phenotype of biofilm formation, but it is possible that ace and gelE genes perform as enhancers in biofilm formation in Enterococcus. To test the PCR-RFLP tecnhique, 32 and 20 strains identified by conventional biochemical exams as E. casseliflavus E. gallinarum, respectively, were were submitted to PCR amplification and digested with HinfI.. The DNA fragment of 661 bp corresponding to a conserved region of 16S rDNA was cleaved with HinfI and 47% and 25% of E. gallinarum and E. casseliflavus showed DNA fragments of 589 bp and 72 bp, expected for PCR-RFLP. Thus, PCR-RFLP proved to be a useful molecular tool for confirmation the E. casseliflavus and E. gallinarum species.

Orientador: Fernando Antônio de Ávila / Banca: Karina Paes Bürger / Banca: Hélio José Montassier / Banca: Luciano Menezes Ferreira / Banca: Adilson César Abreu Bernardi / Resumo: Assim como nos bovinos, a búfala pode ter mastite, sendo o Staphylococcus aureus o principal causador desta enfermidade. No entanto, é possível que sua prevalência possa estar superestimada. Este estudo objetivou comparar métodos fenotípico e genotípico na identificação de S. aureus em amostras de leite bubalino e ambiente de ordenha bem como propor uma nova PCR quantitativa em tempo real para identificação do mesmo. Para isso, de um total de 408 amostras obtidas de leite de búfalo, ambiente de ordenha e mãos de ordenhadores, 32 cepas presuntivas de S. aureus foram identificadas com base em seu crescimento fenotípico característico em ágar Baird Parker, reações positivas de Gram e catalase, capacidade de coagular plasma de coelho, e resultado positivo no ensaio de PCR Sa442 específico para a espécies. No entanto, testes adicionais revelaram que destas 32 estirpes, apenas 10 isolados apresentaram resultado positivo na aglutinação em látex, incluindo um S. chromogenes e um S. agentis. A análise de MALDI-TOF MS revelou que oito das 32 cepas eram S. aureus, 19 S. chromogenes, três S. agnetis e uma S. xylosus. Todas as oito cepas identificadas como S. aureus pela análise de MALDI-TOF e confirmadas pelo sequenciamento do 16S rRNA foram positivas na PCR do gene cydB específico para S. aureus. Além disso, foi encontrada uma cepa positiva para o gene sea, nove para o gene cna, uma para o gene sei, duas para o gene sem, uma para o gene seg, seis para o gene seh, 15 para o gene eno 11 p... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Like cattle, buffalo may have mastitis, with Staphylococcus aureus being its main cause. However, it is possible that its prevalence may be overestimated. This study aimed to compare phenotypic and genotypic methods for S. aureus identification in samples of buffalo milk and milking environment as well as to propose a new quantitative real time PCR for its identification. For this, a total of 408 samples obtained from buffalo milk, milking environment and milkers hand, 32 presumed S. aureus strains were identified based on their characteristic phenotypic growth in Baird Parker agar, positive reactions of Gram and catalase, ability to coagulate rabbit plasma, and positive result in the species-specific Sa442 PCR assay. However, additional tests revealed that of these 32 strains, only 10 isolates tested positive for latex agglutination, including a S. chromogenes and a S. agentis. Analysis of MALDI-TOF MS revealed that eight of the 32 strains were S. aureus, 19 were S. chromogenes, three were S. agnetis and one was S. xylosus. All eight strains identified as S. aureus by MALDI-TOF analysis and confirmed by 16S rRNA sequencing were positive in S. aureus specific cydB gene PCR. In addition, a positive strain was found for the sea gene, nine for the cna gene, one for the sei gene, two for the sem, one for the seg gene, six for the seh gene, 15 for the eno 11 gene for the gene ebps two for the fib gene and 14 for the fnbA gene. Of the isolates, only one showed resistance to clindam... (Complete abstract click electronic access below) / Doutor

Neste trabalho estudamos um sistema de equações diferenciais parabólicas que modelam um processo de difusão-reação em duas dimensões da mistura molecular e reação química irreverssível de um só passo entre duas espécies químicas A e B para formar um produto P. Apresentamos resultados analíticos e computacionais relacionados à existência e unicidade da solução, assim como estimativas do erro local e global utilizando elementos finitos. Para os resultados analíticos usamos a teoria de semigrupos e o principio do m´aximo, e a simulação numérica é feita usando diferenças finitas centrais e o esquema simplificado de Ruge-Kutta. As estimativas do erro local para o problema semi-discretizado são estabelecidas usando normas de Sobolev, e para estimar o erro global usamos shadowing finito a posteriori. Os resultados computacionais obtidos mostram que o comportamento da solução está dentro do esperado e concorda com resultados da referências. Assim mesmo as estimativas do erro local e global são obtidas para pequenos intervalos de tempo e assumindo suficiente regularidade sobre a velocidade do fluído no qual realiza-se o processo. Destacamos que a estimativa do erro global usando shadowing finito é obtida sob hipóteses a posteriori sobre o operador do problema e o forte controle da velocidade numa vizinhança suficientemente pequena.

Neste trabalho, propomos uma modificação do modelo de reação-difusão (R. M. C. de Almeida et al., Physics Review B, 61, 19 (2000)) incluindo difusividade variável com o objetivo principal de predizer, ou no mínimo descrever melhor, o crescimento de oxido de Si no regime de filmes nos. Estudamos o modelo reação-difusão a coeficiente de difusão, D, fixo e D variável. Estudamos extensivamente o modelo reação-difusão com D fixo caracterizando seu comportamento geral, e resolvendo numericamente o modelo com D variável para um intervalo amplo de relações DSiO2=DSi. Ambos casos apresentam comportamento assintótico parabólico das cinéticas. Obtivemos as equações analíticas que regem o regime assintótico de tais casos. Ambos os modelos apresentam interface não abrupta. Comparações das cinéticas com o modelo linear-parabólico e com dados experimentais foram feitas, e também para as espessuras da interface. Contudo nenhum dos dois modelos de reação-difusãao, com D fixo e com D varáavel, podem explicar a região de filmes nos, que possui taxa de crescimento superior a taxa de crescimento da região assintótica. Porém, ao incluir taxa de reação variável dentro do modelo de reação-difusão com D variável, este aponta para uma solução do regime de filmes nos.

Ureases (uréia amino-hidrolases; EC 3.5.1.5) são metaloenzimas níquel-dependentes, que catalisam a hidrólise da uréia à amônia e dióxido de carbono. Elas são produzidas por fungos, bactérias e plantas, mas não por animais. A soja produz duas isoenzimas, a urease ubíqua, que é codificada pelo gene Eu4, presente em pequenas quantidades em todos os tecidos da planta, e a urease embrião-específica, codificada pelo gene Eu1, que é sintetizada apenas no embrião em desenvolvimento. A urease ubíqua é responsável pela biodisponibilização de nitrogênio para planta, enquanto o papel da embrião-específica permanece desconhecido. Estudos prévios, sugerem que esta urease possa estar envolvida na defesa da planta.Como a urease ubíqua é encontrada em pequenas quantidades em todos tecidos da planta, tornando difícil sua obtenção, pouco é conhecido sobre esta enzima. No presente trabalho, estabeleceu-se um sistema de expressão e purificação parcial da urease ubíqua recombinante, expressa como uma proteína fusionada a uma cauda de glutationa-S-transferase (GST). O gene da urease foi amplificado por PCR e ligado em plasmídeo pGEX-4T-2 e expresso em Escherichia coli BL21 (DE3). A urease recombinante foi parcialmente purificada em resina de afinidade Glutationa Sepharose 4B, obtendo-se um rendimento de aproximadamente 2 mg/L de cultura. A proteína recombinante foi analisada para atividade enzimática e imunorreatividade para anticorpos contra urease de Canavalia ensiformis.O sucessodeste método de expressão da urease ubíqua da soja, permitirá a produção de quantidades suficientes desta proteína para estudos posteriores de caracterização. / Urease (EC 3.5.1.5, urea amidohydrolase) is a nickel-dependent metalloenzyme, that catalyzes the hydrolysis of urea to form ammonia and carbon dioxide. Ureases are produced by many organisms, including plants, fungi and bacteria. Soybean produces two isoenzymes, the ubiquitous urease, which is encoded by Eu4 gene and is present in small amounts in all plant tissues, and the embryo-specific urease, which is encoded by the Eu1 gene, and is synthesized only in the developing embryo. The ubiquitous urease is responsible for recycling metabolically derived urea while the role of the embryo-specific urease remains unkown. Previous studies had suggested that the embryo-specific urease could be involved in plant defense. Since the ubiquitous urease is found in low amounts in plant tissues making difficult to purify the enzyme, little is known about this protein.In the present work, a system for the expression and partial purification of soluble soybean ubiquitous urease was established expressing a protein fusioned with glutathione S- transferase (GST). The urease gene amplified by PCR was inserted into a pGEX-4T-2 GST fusion vector and then expressed in Escherichia coli BL21 (DE3). The recombinant urease was partially purified by a Glutathione Sepharose 4B affinity chromatography, yielding about 2 mg protein/L of culture broth. The recombinant protein was tested for enzymatic activity and imunoreactivity against anti Canavalia ensiformis antibodies. Successful expression of ubiquitous urease in E. coli provides a way to produce this protein in amounts enough for posterior studies and characterization.

Resumo não disponível.

Infecções por Chlamydia trachomatis estão entre as mais freqüentes doenças sexualmente transmissíveis (DST) em todo o mundo, apresentando grande importância epidemiológica. A identificação deste patógeno pode ser difícil e um método de detecção baseado na amplificação de ácidos nucleicos é altamente desejável, por sua acurácia e rapidez. O presente estudo avaliou a acurácia, sensibilidade e especificidade de uma reação em cadeia da polimerase (PCR) in “house” em amostras de urina de homens com e sem sintomas de DST comparados a um teste comercial, o COBAS Amplicor CT/NG (Roche, Suiça). Foram utilizados primers específicos para amplificar um segmento do plasmídio críptico de C. trachomatis gerando um fragmento de 201 pb, cuja seqüência foi confirmada por clivagem enzimática e seqüenciamento automático. A especificidade analítica dos primers foi confirmada frente ao DNA de diferentes microrganismos patogênicos e não patogênicos da microbiota urogenital masculina. A detecção limite do DNA clamidial pela PCR in house após hibridização (Southern blot), foi de 1 pg. O COBAS Amplicor CT/NG foi considerado o teste de referência por ser automatizado e conter um programa de controle interno da reação para identificar inibição da DNA polimerase. Entre as 37 amostras testadas positivas para C. trachomatis pelo COBAS Amplicor, 33 foram confirmadas positivas pela PCR in house. Foram detectados inibidores da reação nas 4 amostras que apresentaram resultados falso-negativos, utilizando-se a técnica de contaminação da reação com o DNA clamidial (spiked) e um controle interno da reação com primers que amplificam a β-globina do DNA humano. Após congelamento e descongelamento para eliminar prováveis substâncias inibidoras lábeis, as 4 amostras foram re-testadas, resultando na positividade de mais 2 amostras, completando 35 amostras positivas pela PCR in house. Entre as 74 amostras testadas negativas para C. trachomatis pelo COBAS Amplicor, 72 foram confirmadas negativas pela PCR in house. Das 2 amostras prováveis falso-positivas, apenas 1 permaneceu positiva, após re-teste. Dos 111 pacientes analisados, 108 apresentaram resultados idênticos nos dois testes, o equivalente a uma acurácia = 97,3%, sensibilidade = 94,6% e especificidade = 98,6%. A alta sensibilidade e especificidade apresentada pela PCR in house, demonstra a possibilidade de triar e diagnosticar C. trachomatis em urina de homens, importante reservatório da infecção clamidial para as mulheres. / Chlamydia trachomatis infections are among the most commum sexually transmitted diseases and of great epidemiological importance world-wide. Identification of this pathogen can be difficult, and it is highly desirable to have a rapid and accurate nucleic acid amplification based detection method. The present study was designe to evaluate the accuracy, sensitivity and specificity of a in house plasmid-based polymerase chain reaction (PCR) and hybridization on first void urine specimens from symptomatic and asymptomatic men, compared with a commercial test the PCR COBAS Amplicor CT/NG (Roche, Switzerland), for detection of C. trachomatis (CT). Specific primers for the cryptic plasmid of C. trachomatis were designed to amplify a 201 bp fragment confirmed by enzymatic cleavage and automatic sequencing. The analytic specificity was determined by submitting to the intended protocol, the DNA of normal and pathogenic urogenital microbiota, the specific primers anneling was confirmed. The detection limit of the PCR and the Southern blot hibridization, was mesured in 1 pg of chlamydial DNA. The COBAS Amplicor CT/NG was considered the reference test, it contains a internal control (IC) programme to identify DNA polymerase inhibition. Among 37 positive specimens tested by COBAS Amplicor, 33 were confirmed positive by in house PCR and inhibitors of PCR were demonstrated in the 4 possibly false-negative samples performing DNA chlamydial spiking experiments and using a positive internal control of human β-globin DNA. The specimens were freezedthowed and re-tested to remove labile inhibitors, but 2 samples remained negative. Among 74 negative specimens by COBAS Amplicor, 72 were confirmed negative by in house PCR. The 2 problaby false-positive samples were re-tested and just one remained positive. The final results of the two tests were identical for 108 of the 111 pacients, accuracy = 97,3% ; sensitivity = 94,6% and specificity = 98,6%. This study shows that the in house plasmid-based PCR is fasible for detection of Chlamydia trachomatis in male urine specimens. This test presented high accuracy, sensitivity and specificity, offering great potencial for the screening of men, an important reservoir of infection chlamydial for women.

Este trabalho trata da reação de acoplamento Suzuki (reação entre haletos de arila ou benzila e ácidos arilborônicos) catalisada por compostos de paládio, e foi dividido em duas etapas. Na primeira etapa foi desenvolvido um sistema simples para a reação de Suzuki, em meio homogêneo, utilizando um sistema ternário de solventes (MeOH, PEO e n-heptano) (figura 1), que viabiliza o reciclo do catalisador por várias vezes. No sistema proposto foi utilizado como solvente a mistura metanol / poli( óxido de etileno), e no fmal da reação a bifenila formada foi extraída com solvente apoIar (n-heptano), com elevados rendimentos. Neste estudo, também foi possível obter produtos diferentes (rendimentos 70-80%) a cada reciclo, variando apenas o haleto de arila empregado no acoplamento. Na segunda etapa deste trabalho, foi desenvolvido um sistema para a realização do acoplamento Suzuki entre haletos de benzilas e ácidos arilborônicos catalisado por paládio. Durante o estudo de otimização foi possível verificar que estas reações ocorrem com baixa concentração de catalisador (0,002-1mol%), bem como constatou-se que o tempo de reação variou de 3h30min a 11horas, dependendo da quantidade de catalisador utilizado. O sistema se mostrou eficiente para reações com cloretos de benzila, levando a diarilmetanos com elevados rendimentos (>90%). A partir de reações competitivas se constatou que grupos substituintes no anel do haleto de benzila ou do ácido arilborônico não exercem influência estérica ou eletrônica significativa, bem como foi possível constatar que os brometos de benzilas são cinco vezes mais reativos que os cloretos de benzila. Finalmente, foi possível determinar uma reatividade relativa para os diferentes substratos halogenados frente à reação de Suzuki catalisada pelo sistema Pd(OAc)2IPPh3: (ArI > PhCH2Br > PhCH2CI > ArBr). / In this work the Pd-catalyzed Suzuki cross-coupling reaction of aryl halides or benzyl halides with aryl boronic acids was studied. In the first part of this work, we have fmd out that a system of poly (ethylene oxide) / methanol can be used as solvent medium for the Pd-catalyzed Suzuki cross-coupling reaction under mild condition. Afier the end of the reaction the product is extracted with heptane and the polar phase can be reused several without any change in the activity (Fig.1). Pure biaryl products are obtained from the no polar phase in excellent isolated yields (>90%). The same catalyst-containing polar phase was used to coupling different aryl halides, furnishing the products in good to high isolated yields (70-80%). In the second part of we have developed a simple and efficent catalytic system for the Suzuki cross-coupling reaction of benzyl halides (bromides and chlorides) with aryl boronic acids. The catalyst precursor is prepared in situ from palladium acetate and triphentylphosphine showing high activity for reaction of benzylic bromides and chlorides with arylboronic acids. The reaction can be carried out at low catalys loading (0.002 - lmol%) and under mild conditions (80°C), furnishing diarylmethane derivatives in high yelds (86-99%). Compared with the aryl halides, the Suzuki crosscoupling reaction of benzyl chlorides is much less sensitive to steric and electronic effects. On the other hand, as observed the aryl halides, the cross-coupling reaction of benzyl bromide is five times faster than the coupling of benzyl chlorides. Finally we have obtained a relative reactive for the Pd(OAchIPPh3- catalyzed Suzuki cross coupling reaction: ArI> ArCH2Br > ArCH2Cl > ArBr.