Publicación a texto completo no autorizada por el autor / Evalúa la utilidad de la reacción en cadena de polimerasa para el diagnóstico de tuberculosis pulmonar en comparación con las pruebas de baciloscopía y el cultivo Bk. El estudio es observacional, descriptivo, retrospectivo transversal. Se realizó el estudio a 143 pacientes con diagnóstico de tuberculosis pulmonar de los años 2011 al 2013. Para el análisis de las variables cuantitativas se utilizó el promedio y la desviación estándar, y para el análisis de las variables cualitativas se utilizó los porcentajes, frecuencias absolutas y relativas. Los resultados obtenidos son datos de pacientes entre los 18 a 62 años de edad, donde el 64% son de sexo masculino, se ha encontrado una sensibilidad para micobacterium tuberculosis de 87,71%. Existe un 12.3% que a pesar de ser positivos, la baciloscopía no los identifica como tales, de los pacientes con diagnostico negativo de PCR, solo el 79.3% fueron confirmados como negativos mediante cultivo. La fiabilidad fue valorada a partir de la tabla ANOVA correspondiente, calculando el coeficiente de concordancia kappla Intraclase de Cohen, el resultado encontrado es de 0.608, el mismo que fue comparado con los márgenes propuestos por Landis, La frecuencia de infección por M. Tuberculosis en lavado bronquial con BK negativo es de 37.83% (14), El 70,75% es la cantidad de pacientes positivos a M. Tuberculosis según PCR confirmado con cultivo que presentan síntomas, La tos es el síntoma que se presenta con mayor frecuencia, encontrándose en el 61.84% de los pacientes, seguida del 36.84% de hemoptisis. Se concluye que al análisis inferencial de la prueba de hipótesis no paramétrica, de comparaciones proporcionales, entre los resultados de ambos medios de diagnóstico, se obtuvo una diferencia estadística altamente significativa, con lo que se prueba que el pcr es más eficaz que el cultivo. / Trabajo académico

Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario / El objetivo de este estudio fue implementar una protocolo de diagnóstico para Bordetella spp a través de la detección del gen flaA, que codifica la proteína estructural flagelina, mediante la reacción en cadena de la polimerasa semianidada. Para esto se diseñaron 3 partidores in silico mediante el uso del programa OligoPerfect™, los cuales fueron posteriormente sintetizados por la empresa BIOSCAN. Utilizando como muestras tres cepas de Bordetella bronchiseptica, se obtuvieron los fragmentos de los tamaños esperados (362 pb y 170 pb) y, tras la secuenciación del fragmento de 362 pb, se determinó un porcentaje de identidad nucleotídica del 95% respecto al dato oficial registrado en GenBank, a través del programa Clustal Ω . Este valor fue corroborado al ingresar la misma secuencia al programa online BLAST, el cual también entregó un porcentaje de identidad nucleotídica del 95% respecto al gen de la proteína flagelina de Bordetella spp / The objective of this study was to implement a diagnostic protocol for Bordetella spp, by the chain reaction of the semi-nested polymerase, through the detection of the flaA gene, which encodes the structural protein flagellin. For this, 3 in silico primers were designed through the use of the OligoPerfect ™ program, which were later synthesized by the BIOSCAN company. Using three strains of Bordetella bronchiseptica as samples, fragments of the expected sizes were obtained (362 bp and 170 bp) and, after the sequencing of the larger amplicon, a percentage of 95% nucleotide identity was determined with respect to the official data registered in GenBank, through the Clustal Ω program. This value was corroborated when entering the same sequence to the BLAST online program, which also delivered a 95% nucleotide identity percentage with respect to the flagellin protein gene of Bordetella spp

Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario / La contaminación de los cultivos celulares por Mycoplasma spp. dificulta tanto la investigación básica como el desarrollo y producción de productos biológicos. Los efectos de esta bacteria en las células cultivadas son cambios en el metabolismo, propiedades inmunológicas y bioquímicas, crecimiento, viabilidad, etc. La infección de cultivos celulares con Mycoplasma spp. puede no ser detectada por inspección visual o microscopía común, por lo tanto, es importante realizar evaluaciones periódicas de rutina con un método rápido, altamente sensible y específico. En consideración a lo anterior, esta memoria de título se basó en el diagnóstico molecular de Mycoplasma spp., mediante la detección del gen 16S rRNA utilizando la técnica de Reacción en Cadena de la Polimerasa convencional, en muestras procedentes de cultivos celulares de distintos laboratorios de la Universidad de Chile y del Instituto de Salud Pública de Chile. Los resultados obtenidos tanto en los controles positivos como en los controles negativos, permitieron validar este método en la Facultad de Ciencias Veterinarias y Pecuarias y al aplicarlo en muestras sospechosas, se logró la detección positiva en una muestra procedente del Instituto de Ciencias Biomédicas de la Universidad de Chile. Este hallazgo, fue confirmado por alineamiento de secuencias nucleotídicas respecto de datos oficiales del GenBank®, utilizando los programas Clustal W y BLAST, ambos de acceso gratuito on line que entregaron un 97% de porcentaje de identidad nucleotídica respecto de Mycoplasma spp

Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario / El Distemper Canino es una enfermedad altamente prevalente, de distribución mundial y que presenta una variada pero alta morbilidad y mortalidad. El agente causal es el Virus Distemper Canino (VDC), el cual posee un amplio rango de hospederos donde es patogénico, entre ellos algunos primates, cetáceos y numerosas familias del orden de los carnívoros. Presenta un alto tropismo por tejido linfoide, neurológico y epitelial, conduciendo a una infección de casi todos los sistemas orgánicos, por lo que los signos clínicos observados son muy variados. El diagnóstico se realiza en base a la sospecha clínica, la que debe ser confirmada por un método diagnóstico de laboratorio, como la técnica molecular denominada Reacción en Cadena de la Polimerasa previa Transcripción Reversa (RT-PCR), la cual ha sido utilizada además para caracterizar las cepas virales en base al análisis del gen H. Este análisis ha determinado la presencia de 14 linajes circulantes en el mundo, dos de los cuales se han descrito en Chile, correspondientes a los linajes América-1 y Europa-1/Sudamérica-1. El objetivo de este trabajo fue implementar un protocolo de RT-PCR múltiple, diseñando partidores in silico en base a las secuencias nucleotídicas almacenadas en la base de datos Genbank®, el cual fuera capaz de detectar los dos linajes descritos en Chile de manera diferencial, con el fin de aportar una herramienta diagnóstica de apoyo para estudios epidemiológicos y en un futuro cercano conocer la prevalencia de estos linajes en el país. Los resultados obtenidos sugieren que los partidores diseñados para cada linaje son específicos. Además de indicar que el protocolo establecido fue exitoso, las muestras analizadas corresponderían en su totalidad al linaje América-1, permitiendo en un futuro, seguir analizando muestras positivas al VDC, para conocer la prevalencia real de ambos linajes en el país. / The Canine Distemper is a highly prevalent disease, of worldwide distribution and has a variable but high morbidity and mortality. The causative agent is the Canine Distemper Virus (CDV), which has a wide host range where it is pathogenic, among them some primates, cetaceans and numerous families of the order of carnivores. It presents a high tropism for lymphoid, neurological and epithelial tissue, leading to an infection of almost all organic systems, so the clinical signs observed are very varied. The diagnosis is made based on clinical suspicion, which must be confirmed by a laboratory diagnostic method, where the molecular technique called Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction (RT-PCR), which has also been used to characterize viral strains based on the analysis of the H gene, which has determined the presence of 14 circulating lineages in the world, two of them have been described in Chile, corresponding to the America-1 and Europe-1/South America-1 lineages. The objective of this work was to implement a multiple RT-PCR protocol, designing in silico primers based on the nucleotide sequences stored in the Genbank® database, which was capable of detecting the two lineages described in Chile in a differential way, to provide a support diagnostic tool for epidemiological studies and in near future to know the prevalence of these lineages in the country. The results obtained suggest that the primers designed for each lineage are selective against these. In addition to indicating that the established protocol was successful, observing that all the samples analyzed corresponded to the America-1 lineage, allowing in the future to keep analyzing positive samples to CDV, in order to know the prevalence of both lineages in Chile.

Publicación texto completo no autorizada por el autor / El documento digital no refiere asesor / Determina la utilidad del PCR en tiempo real en líquido pleural parael diagnóstico de tuberculosis pleural (TB Pl) se seleccionaron 404 casos de pacientes que presentaron efusión pleural en el servicio de Neumología del Hospital Arzobispo Loayza entre los años 2012 y 2013. Se elaboraron tablas de contingencia y se hallaron los valores de Sensibilidad (S), Especificidad (E), Valor predictivo Positivo (VPP) y Valor Predictivo Negativo (VPN). Para el estudio de significancia estadística se empleó Chi Cuadrado. De los 404 casos incluidos en el estudio 176 tuvieron diagnostico de TB Pl. Solo 66 casos tuvieron PCR positivo. Los hallazgos fueron S: 34.8%, E: 98.2%, VPP: 90.9% y VPN: 65.7%. El PCR en tiempo real es una prueba que debe ser tomada como parte de una batería de exámenes que aportan en su conjunto al diagnóstico de TB Pl pero no muestra ser útil como prueba rápida de tamizaje ni debe ser utilizada como prueba de rutina en nuestro hospital. / Trabajo de investigación

Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario / La resistencia antimicrobiana es actualmente una problemática de salud pública, debido a que compromete la efectividad de los tratamientos realizados tanto en medicina humana como veterinaria. Este fenómeno tuvo un rápido surgimiento, casi tan pronto como la aparición de los primeros antimicrobianos y se ha diseminado globalmente debido a los mecanismos de transmisión de los determinantes genéticos de resistencia, que facilitan su propagación entre bacterias pertenecientes incluso a distintos géneros. En las últimas décadas, una de las mayores preocupaciones al respecto ha sido la utilización masiva de antimicrobianos en animales productores de alimentos para consumo humano, debido a que esta situación ejerce una presión de selección de microorganismos resistentes y acelera los procesos de mutación genética, así como la transmisión de genes de resistencia hacia la población humana. Este último proceso está favorecido en gran parte por elementos genéticos móviles, entre los que destacan los integrones, estructuras capaces de adquirir casetes génicos y transferirlos en bloque de una bacteria a otra. Dentro de ellos, las clases 1 y 2 son las que se han encontrado con mayor frecuencia en investigaciones realizadas en el ámbito de la producción animal. En este estudio se detectó la presencia de integrones clase 1 y clase 2 en cepas de Escherichia coli aisladas desde la microbiota intestinal de gallinas de postura tratadas previamente con antimicrobianos. La identificación de los integrones se hizo mediante la técnica de PCR convencional y dio como resultado la presencia de tres integrones, los que a su vez no presentaron asociación con la multi-resistencia de las cepas analizadas. Los resultados indican por tanto, que los integrones no se encuentran implicados en la transmisión de resistencia antimicrobiana en las bacterias estudiadas. Esta información difiere de la presentada en estudios similares, donde si bien la prevalencia de integrones clase 2 es variable, la clase 1 tiende a estar presente con prevalencias superiores al 40% y asociados a la transmisión de multi-resistencia, en ambos casos.

Memoria para optar al Titulo Profesional de Médico Veterinario / Entre los numerosos agentes causantes de enfermedad que los animales pueden transmitir al ser humano, está el Streptobacillus moniliformis, patógeno poco común que parece estar emergiendo en el último tiempo. Esta bacteria, que habita naturalmente en el tracto respiratorio anterior de las ratas, produce en el ser humano dos cuadros de signos y síntomas muy similares, conocidos como fiebre por mordedura de rata y fiebre de Haverhill según el modo de contagio. Además, este microorganismo puede infectar también a otros animales que viven o tienen contacto con ratas. El objetivo de este estudio es determinar la presencia o ausencia de Streptobacillus moniliformis en el tracto nasofaríngeo de ratas provenientes de un bioterio convencional. Para esto se seleccionaron 20 ejemplares adultos de la cepa Sprague- Dawley, sin distinción de sexo y clínicamente sanos. Para la extracción de la muestra clínica los animales fueron previamente sedados y se obtuvo secreción nasofaringea con una tórula fina de pequeño tamaño (torulín). Las muestras fueron sembradas en agar sangre anaerobio durante 72 hrs e incubadas a 36°C con 3% de CO2. Posterior a la siembra el contenido de la tórula se suspendió en tampón sacarosa fosfato que se almacenó a -20°C para utilizarse en el diagnóstico molecular mediante PCR. Para éste último se amplificaron 296 pb del gen 16S rRNA, empleando los partidores descritos por Boot et al., 2002. De las 20 muestras estudiadas, se detectaron 8 muestras positivas a la técnica de PCR y ninguna muestra fue positiva al cultivo microbiológico. Por análisis estadístico se obtuvo que la prevalencia de S. moniliformis en las ratas en estudio se encuentra entre 21.9% a 61.4%. Los resultados de este estudio, permiten concluir que las ratas utilizadas son portadoras de este microorganismo en porcentajes similares a los que se describen en la literatura. La técnica de PCR resultó ser más sensible en el hallazgo del patógeno en comparación con la baja sensibilidad que posee el aislamiento en cultivo para el diagnóstico de S. moniliformis a partir de muestras nasofaríngeas. Se discute la importancia de este primer diagnóstico positivo nacional de S. moniliformis en ratas de bioterio convencional y su relación con la salud humana

Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario / Con el fin de pesquisar y describir las lesiones pulmonares en Lobos marinos (Otaria flavescens), se realizó un estudio radiográfico simple de tórax a 20 ejemplares cachorros y juveniles. También se realizaron lavados traqueales para la obtención de muestras que fueron analizadas para la búsqueda de bacterias del Complejo Mycobacterium tuberculosis, mediante la prueba de Reacción de Polimerasa en Cadena (PCR), con el objetivo de investigar la presencia de tuberculosis pulmonar. Para ambos estudios los animales se encontraban bajo anestesia general mediante la utilización de Isofluorano, con buena respuesta a la inducción y recuperación. Se logró estandarizar la técnica radiográfica, kVp y mAs, y se extrapoló técnica de lavados traqueales de caninos a lobos marinos. Los resultaron mostraron que 11 animales (55%) presentaban algún tipo de lesión pulmonar, en 10 individuos (50%) se observó un infiltrado del parénquima pulmonar, en 5 de ellos este infiltrado es de tipo difuso, mientras que en los 5 restantes es de tipo celular. En cuanto a la presencia de broncogramas aéreos positivos (BAP), éste estuvo presente en 9 de los individuos en estudio (45%). En lo referente la prueba de PCR, ésta arrojó resultados negativos en la totalidad de los animales, probablemente, debido a que los animales no se hayan encontrado infectados con alguna bacteria del complejo M. tuberculosis

Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario / En la producción de carne para consumo humano, una de las características más importantes del producto para los consumidores es la terneza de la carne, la cual posee un componente genético asociado, genes que codifican las enzimas que participan en el proceso de degradación de la carne en el postmortem y que pueden sufrir cambios en sus secuencias, del tipo polimorfismo de un solo nucleótido (SNP), que generan cambios en estas enzimas y por ende cambios en la característica del producto. Este hecho, hace muy importante el tener una herramienta de detección eficiente y rápida de estas variaciones genéticas. Muestras de semen de toros procedentes del catálogo de inseminación artificial de INDAP, 2007 y muestras de tejido de novillos híbridos de Wagyu, fueron sometidas a extracción de DNA, comprobando la efectividad de ésta mediante medición de concentración de DNA en espectrofotómetro. Se implementó una técnica de reacción de polimerasa en cadena alelo específica (AS – PCR), la cual fue aplicada a las muestras con alta concentración de DNA extraído, utilizando partidores sintetizados para los SNP CAPN1 – 316, CAPN1 – 530 y CAST – 2959. Los resultados del AS – PCR fueron confirmados con secuenciación de varias muestras. La extracción de DNA fue más efectiva en las muestras de tejido de novillos Wagyu que en las muestras de semen, probablemente por el estado de conservación de la muestra, el grado de condensación del DNA en los espermatozoides y la presencia de inhibidores en el semen. La implementación y ajuste de parámetros en el PCR se hizo de la misma forma que lo observado en la literatura, obteniendo resultados similares en frecuencias genotípicas y su asociación con el rasgo fenotípico, a estudios previos en el tema. La secuenciación de las muestras dejó en evidencia la eficiencia de la Taq polimerasa en la fase de extensión y además, identificó la presencia de una secuencia extra en el alelo C de CAPN – 316, compatible con los “directos repetidos” y con el proceso de arrastre de exones que ocurren durante la recombinación genética y la evolución de los genes. Todos los datos nos permiten concluir que la técnica de AS – PCR es una herramienta efectiva para determinar variaciones del tipo polimorfismo de un solo nucleótido en genes relacionados con características de importancia productiva. / Proyecto Bicentenario PSD23

Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario / Salmonella Enteritidis (S.E) es el serotipo de Salmonella más involucrado en la presentación de enfermedades transmitidas por los alimentos en nuestro país, siendo los productos de la industria avícola la mayor fuente de infección para el hombre. Por esta razón, su diagnóstico y control se hace cada vez más importante en los productos de esta industria para evitar brotes que pongan en riesgo la salud de la población. El cultivo bacteriológico es la prueba diagnóstica tradicional para la detección de S.E en muestras de tejidos de animales, que a pesar de tener una sensibilidad y especificidad apropiada, presenta la gran limitante de tomar como mínimo 4 a 7 días para entregar resultados. Con el fin de reducir el tiempo de diagnóstico, sin disminuir la especificidad y sensibilidad, es que se han desarrollado metodologías alternativas, entre las cuales el PCR ha ocupado un lugar privilegiado, logrando reducir los tiempos de detección y procesar una gran cantidad de muestras en forma simultánea. El objetivo de este trabajo fue implementar la prueba de PCR convencional, para la detección de S.E, utilizando partidores específicos para detectar el gen invA, y un tratamiento de muestras que incluyó la incubación de éstas en caldo Rappaport Vassiliadis 37ºC por 48 horas y un complejo proceso de extracción de ADN bacteriano, para evitar la acción de inhibidores. Para esto, se realizó una primera etapa en que se implementó la técnica, utilizando bacterias inoculadas en caldo de enriquecimiento, para luego establecer la cantidad de bacterias mínima detectable por la prueba, obteniéndose un mínimo de 101 UFC/ml. No se obtuvo bandas de amplificación con cepas de E. coli y Proteus spp. El caldo Rapapport Vassiliadis no evidenció la presencia de inhibidores ni tampoco los tejidos intestinales, ni órganos internos. Posteriormente se utilizó la prueba implementada para detectar S.E en 53 muestras de tejidos y contenido intestinal de pollos experimentalmente infectados, positivas al cultivo bacteriológico y en 126 muestras negativas. En el primer caso, todas las muestras presentaron amplificación del gen invA, mientras que en el segundo, de las 126 muestras negativas, sólo 6 fueron positivas a PCR (4,8%), correspondiendo 3 de ellas a un pool de órganos y 3 a intestino y contenido intestinal. Basado en estos resultados, se puede concluir que se logró implementar la prueba de PCR convencional para la detección de S.E en tejidos y contenido intestinal de pollos en forma exitosa, con una alta capacidad de detección bacteriana y con un tiempo de ejecución de un máximo de 3 días (de los cuales 2 corresponden a incubación en caldo de enriquecimiento), la cual debiese ser utilizada como complemento a la prueba tradicional actualmente utilizada