El objetivo de esta investigación es detectar la presencia del virus en perros jóvenes mediante la técnica de PCR, usando cebadores que permitieron la amplificación de un fragmento del gen de la proteína VP2 y comparar este resultado con el diagnóstico clínico. Para tal propósito, son colectados hisopados rectales de 78 perros menores a un año de edad y sin historia de vacunaciones previas, de los cuales 39 individuos tienen un diagnóstico clínico de parvovirosis canina y los otros 39 son animales clínicamente sanos. Para la extracción de ADN viral, se usa el método fast boiling, en donde las muestras son sometidos a un hervido a 100°C con posterior centrifugación para extraer el sobrenadante, el cual es usado como molde para la reacción de PCR. Se usan cebadores específicos que amplifican un fragmento de 1316 pares de bases del gen VP2 del virus CPV-2, utilizando como control positivo una vacuna comercial. El virus es detectado en el 62% de animales con diagnóstico clínico de la enfermedad con PCR convencional, no siendo detectado en los perros del segundo grupo. El valor predictivo positivo del diagnóstico clínico indica que solo el 61% de animales clínicamente enfermos serán positivos a CPV-2 por PCR convencional, por lo que se recomienda el uso de técnicas complementarias para un buen diagnóstico de la enfermedad. / Tesis

Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario / La equinococosis, en una enfermedad zoonótica que se presenta en la mayoría de los continentes, desarrollándose especialmente en países con producción ganadera. Las características del ciclo vital de E. granulosus predispone a que el ser humano se vea afectado por éste desarrollando uno o varios quistes hidatídicos, pudiendo llevarlo incluso a la muerte. En la Región Metropolitana, la comuna de Melipilla se encuentra en segundo lugar en cuanto a la tasa de egresos hospitalarios de hidatidosis comprendida entre los años 2001 y 2008. El objetivo de este estudio fue determinar la prevalencia de equinococosis en perros pertenecientes a predios asesorados por el Programa de Desarrollo Local (PRODESAL) en el área rural del sector sur de la comuna de Melipilla, Región Metropolitana, Chile, en el año 2012. Se utilizaron muestras de heces frescas de perros pertenecientes a 64 usuarios con producción ganadera asesorados por PRODESAL distribuidos en 7 localidades de la comuna de Melipilla. Las muestras fueron procesadas por la técnica de reacción de polimerasa en cadena (PCR) en el laboratorio clínico “CAMPVS” ubicado en Santiago. De 234 perros muestreados, 17 de ellos (7,2%) resultaron positivos a la presencia de E. granulosus, por lo contrario en 217 perros (92,8%) no se identificó la presencia de dicho parásito. Además, de un total de 7 localidades muestreadas, en 4 de ellas se identificó presencia de E. granulosus en perros. También, se comprobó que no existe relación entre la presencia del parásito y el sexo (p>0,05) ni edad (p>0,05). Es importante contar con esta información para poder establecer programas de prevención y control de esta parasitosis en la población canina de la comuna de Melipilla y así, disminuir el número de animales y personas afectadas por ella

Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario / El Virus Distemper Canino (VDC) es un agente infeccioso de amplia distribución, responsable de la enfermedad denominada Distemper Canino (DC) que afecta a una amplia diversidad de carnívoros terrestres (reportándose incluso en primates) y marinos. Afecta agresivamente a perros domésticos (con una tasa de mortalidad aproximada del 50%). Por tanto, el impacto clínico del VDC es importante. El VDC es codificado por 6 genes, N, P/V/C, M, F, H y L. Casi todos ellos se han usado para identificación de linajes y diagnóstico de la enfermedad. En este trabajo y utilizando Reacción en Cadena de la Polimerasa asociada a Retrotranscripción (RT-PCR) se analizaron 22 fragmentos de Ácido Ribonucleico (RNA) obtenidos de sangre periférica de 22 perros diagnosticados con VDC clínicamente y positivos a VDC mediante RT-PCR (gen N) con el objetivo de lograr implementar la detección del gen de la proteína grande (L) como alternativa diagnóstica. En este sentido, se diseñó un par de partidores que generaron un fragmento de ácido desoxirribonucleico (DNA) de alrededor de 450 pares de bases (pb), el cual mediante análisis bioinformático confirmó su identidad (PIN>94%). Así, esta implementación abre la discusión sobre el mejor método alternativo, en conocimiento de que la detección del gen P mediante RT-PCR anidado lo es actualmente. Un análisis de sensibilidad pondría dilucidar esta incógnita prontamente. Se concluye por tanto que esta técnica molecular ofrece un efectivo método diagnóstico para la presencia de VDC en perros domésticos. / The Canine Distemper Virus (CDV) is a widespread responsible for the Canine Distemper Disease that affects a broad diversity of carnivore mammals (and some cases in primates have been reported) globally. Domestic dogs are extensively and aggressively (with a ~50% mortality rate) infected by the CDV. Therefore, the clinical impact of the CDV is remarkable. The CDV is encoded by six genes, N, P/V/C, M, F, H and L. Almost all of which have been previously studied for lineage identification and disease diagnosis. In this study we used Reverse Polymerase Chain Reaction tests (RT-PCR) to analyseobtain 22 fragments of Ribonucleic acid (RNA) from peripheral blood of 22 subject dogs clinically diagnosed with CDV and positive to CDV by RT-PCR (N gene). The aim of this study was to implement a protocol of detection of the Large Protein Gene (L) to be employed as an alternative diagnostic. To achieve this, a pair of primers that generated a fragment of deoxyribonucleic acid (DNA) of ~450 base pairs (bp) was designed, which, using a bioinformatic analysis, confirmed its identity (PIN > 94%). Therefore, the implementation of this protocol opens the discussion about the best alternative method, within the context that the detection of the P gene through Nested RT-PCR is currently the best available protocol. A sensitivity analysis may potentially elucidate this question. Consequently, the main conclusion is that the molecular technique implemented in this study offers an effective diagnostic method to optimize the detection of VDC in domestic dogs. / Financiamiento: Proyecto FIV 121014019102010.

Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario / El Virus Distemper Canino (VDC) es el agente causal de una grave enfermedad multisistémica de perros y otras especies del orden Carnívora. Distemper Canino (DC) se presenta como una enfermedad altamente contagiosa, que puede alcanzar una elevada morbilidad y mortalidad. El amplio espectro de signos clínicos dificulta el diagnóstico clínico de la enfermedad y hace necesario la confirmación a través de exámenes de laboratorio. La detección molecular de VDC presenta ventajas en el diagnóstico de la enfermedad. En el presente trabajo se implementó la técnica de Reacción en Cadena de la Polimerasa –versión anidada- previa trascripción inversa (n-RT-PCR) para la detección del gen de la fosfoproteína viral (gen P). Como controles positivos se utilizaron RNA proveniente de cepas vacunales y de muestras positivas a otros genes de VDC mediante RT-PCR. Como controles negativos se utilizó RNA de muestras de perros sin signos clínicos de la enfermedad y como control de reactivos agua libre de nucleasas. Posteriormente, se utilizó la técnica en 10 muestras de campo de perros con sospecha clínica de la enfermedad, detectándose el genoma viral en el 100% de las muestras analizadas, generando una banda cercana a los 430 pb, correspondiente a la secuencia blanco buscada del gen de la fosfoproteína de VDC. Los productos de amplificación se caracterizaron por su gran intensidad y nitidez, no observándose bandas de amplificación inespecíficas. Finalmente, se realizó la secuenciación de los productos obtenidos del n-RT-PCR, obteniendo un elevado porcentaje de identidad nucleotídica respecto a las secuencias nucleotídicas del gen P almacenadas en el GenBank®. Esto permitió establecer que el n-RT-PCR implementado en esta Memoria de Título permite la detección de VDC. La implementación de esta técnica permitirá realizar la detección antemortem del virus y, por lo tanto, facilitar el diagnóstico y tratamiento temprano de la enfermedad / Proyecto FIV 121014019102010

Aim: Assess the bacterial frencuency of chromogenic pigment, also called “black stain” through the biomolecular technique Polymerase chain reaction (PCR) and the technique automatic sequencing. Methods and materials: In this study was performed the genetical amplification of bacteria strictly isolated after collection of free biofilm dental plaque in 30 deciduous and permanent teeth of 10 patients who presented these pigmentations and were attended at the pediatric dentistry service of the UPC teaching dental clinic. Stata 12.0 statistical software was used for the frequency anda proportion analysis. Results: Bacterial genus Actinomyces was found with higher prevalence 33% (n = 34) Likewise, gender Streptococcus was found in 12.62% (n = 13) in the chromogenic pigmentations. Actinomyces naeslundii was the most frequently isolated bacteria 17.48% (n = 18), within the 103 isolates bacteria identified by the technique of replication and genetic identification. Conclusion: It was possible to identify the bacterial composition of the chromogenic pigmentation by using advanced and accurate biomolecular techniques. However, known the colonizing bacteria, is just the first step in understanding the etiology, because this phenomenom is multifactorial, and more research is required to know the production of these pigments. / Objetivo: Evaluar la frecuencia bacteriana de las pigmentaciones cromógenas, llamadas también “black stain” mediante la técnica de biología molecular Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) y la técnica secuenciación automática. Materiales y métodos: En este estudio se realizó la amplificación genética de bacterias estrictamente aisladas luego de la recolección del biolfilm libre de placa dental en 30 piezas deciduas y permanentes de 10 pacientes portadores de estas pigmentaciones que acudieron al servicio de odontopediatría de la clínica docente de la UPC. Para el análisis de frecuencia y proporción se usó el software estadístico Stata® 12.0 Resultados: Actinomyces fue el género bacteriano encontrado con mayor prevalencia 33% (n=34) así mismo, fue encontrado el género Streptococcus en un 12.62% (n=13) en las pigmentaciones cromógenas. El Actinomyces Naeslundii fue la bacteria aislada con mayor frecuencia 17.48% (n=18), dentro de las 103 bacterias identificadas por la técnica de replicación e identificación genética. Conclusión: Se logró identificar la composición bacteriana de las pigmentaciones cromógenas mediante el uso de técnicas biomoleculares avanzadas y certeras. No obstante, conocer el tipo bacteria colonizadora, es solo el primer paso para entender la etiología, ya que este fenómeno es multifactorial y se requiere mayor investigación para saber la producción de los pigmentos. / Tesis

Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario / El virus influenza A (FLUAV) ha sido ampliamente estudiado debido a su gran importancia en salud pública y animal. Una de las razones de esto es su gran variabilidad genética otorgada en gran medida por el proceso de reassorment o reordenamiento genético. Este estudio consistió en la determinación de la diversidad genética de los genes que componen el complejo polimerasa del virus, es decir, los genes que codifican para la polimerasa básica 2 (PB2), la polimerasa básica 1 (PB1) y la polimerasa ácida (PA) de virus aislados de planteles porcinos de producción intensiva en Chile y evidenciar procesos de reordenamientos genéticos independientes de dichos genes. Para esto, se analizaron 2824 muestras desde 33 planteles porcinos mediante diagnóstico viral por RT-PCR en tiempo real, aislamiento viral, amplificación de segmentos virales por RT-PCR multisegmento y secuenciación por Illumina. Se obtuvieron un total de 89 secuencias genómicas de PB2 y 92 tanto de PB1 como de PA. Luego se realizó un análisis filogenético con estas secuencias nucleotídicas, más secuencias de referencia mediante el método Maximum likelihood. Todas las secuencias para los tres genes estudiados pertenecen al linaje pandémico del 2009. Se constató además la presencia de reordenamientos de estos genes en aproximadamente un 35% de los casos. Estos resultados permitieron conocer sobre la diversidad genética de los genes que componen el complejo polimerasa de FLUAV en Chile y pesquisar fenómenos de reordenamientos de estos. Además, permitieron evidenciar posibles quiebres de bioseguridad en parte de las producciones porcinas intensivas en Chile, debido a las relaciones filogenéticas encontradas entre virus de diferentes planteles. Futuros estudios son necesarios para confirmar y entender estos hallazgos / The influenza A virus (FLUAV) has been extensively studied for the importance in public and animal health. The virus presented high genetic diversity, due to in part, by the reassortment events. The aim of this study it was to determinate the genetic diversity of the segments 1 (PB2), 2 (PB1) and 3 (PA) of FLUAV isolated from swine in intensive production farms in Chile and too evidence reassortment events in these genes. For this, 2824 samples were collected from 33 pig farms. Real time RT-PCR, viral isolation, and full genome sequencing were performed. A total of 89 genomic sequences of PB2 and 92 genomic sequences for PB1 and PA were obtained. Using phylogeny, we determinate that all segment belonged into the pandemic 09 cluster. The results suggest reassortment events of these genes in approximately 35% of the cases. This is the first study about the genetic diversity of the PB2, PB1 and PA, internal genes and to evidence reassortment events of them in swine population. In addition, the phylogeny suggests direct or indirect transmission between farms. Further studies are needed to better understand the viral dynamic of polymerase genes / FONDECYT 11170877 y ANILLO ACT 1408

Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario / El Distemper Canino (DC) es una de las patologías que provoca mayor tasa de morbilidad y mortalidad en los caninos domésticos a nivel mundial y representa también una importante enfermedad en varias familias de mamíferos terrestres: Canidae, Procyonidae, Mustelidae, Mephitidae, Hyaenidae, Ursidae, Ailuridae, Viverridae, Felidae y algunos mamíferos marinos, como la foca cáspica (pusa caspica). Esta enfermedad es causada por el Virus Distemper Canino (VDC), un virus ARN de hebra simple y polaridad negativa, cuyo genoma constituido por seis genes, codifica para seis proteínas estructurales. Entre ellas, la Hemaglutinina codificada por el gen H, presenta la mayor variabilidad aminoacídica, induce la producción de anticuerpos neutralizantes sintetizados por el sistema inmune del hospedero. Basado en la variabilidad del gen H, se ha descrito que a nivel mundial existirían al menos catorce linajes distintos del VDC y en nuestro país se ha descrito la presencia de al menos dos linajes circulando entre nuestros perros enfermos con la patología: América-1 y Europa-1/Sudamérica-1. Así, el objetivo de esta memoria de título fue implementar la detección del linaje América-1 del Virus Distemper Canino mediante la Reacción en Cadena de la Polimerasa asociada a transcripción reversa (RT-PCR) mediante partidores diseñados in silico. Para esto, los partidores se diseñaron a partir de las secuencias nucleotídicas usadas en el árbol filogenético del gen H de VDC realizado por (Ke et al., 2015, las que se encuentran en la base de datos Genbank®, Los partidores diseñados resultaron ser eficaces para la detección del VDC y la RT-PCR fue capaz de detectar un fragmento específico del gen H de las muestras positivas, por lo tanto se podría sugerir que estos partidores diseñados in silico efectivamente se pueden ocupar para detectar el linaje América-1 del VDC. / The Canine Distemper is one of the pathologies that causes the highest rate of morbidity and mortality in domestic dogs worldwide and represents an important disease in several families of terrestrial mammals: Canidae, Procyonidae, Mustelidae, Mephitidae, Hyaenidae, Ursidae, Ailuridae, Viverridae, Felidae and some marine mammals, like the cape seal (pusa caspica). This disease is caused by Canine Distemper Virus (CDV), a single-stranded RNA virus with negative polarity, whose genome consists of six genes codifying for six structural proteins. Among them, the Hemagglutinin encoded by the H gene, has the highest amino acid variability, inducing the production of neutralizing antibodies synthesized by the host's immune system. Based on the variability of the H gene, it has been described that worldwide there would be at least fourteen different VDC lineages and in our country the presence of at least two lineages circulating among our sick dogs has been described with the pathology: America-1 and Europe-1/South America-1. The objective of this title report was to implement the detection of the America-1 lineage of the Canine Distemper Virus through the Polymerase Chain Reaction associated with reverse transcription (RT-PCR) by means of in silico designed primers. For this, the primers were designed using the nucleotide sequences used in the phylogenetic tree constructed using the VDC H gene performed by Ke et al., 2015, and stored in the Genbank® database. The designed primers were found to be effective for the detection of VDC and the RT-PCR was able to detect a specific fragment of the H gene from the positive samples, therefore it could be suggested that these in silico designed primers can effectively be used to detect the VDC lineage America-1.

Evalúa la capacidad de detección de Salmonella Typhimurium y Enteritidis mediante el método de la Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) Múltiple a partir de muestras en pre-enriquecimiento no selectivo (utilizando secuencias blanco de los genes InvA, fliC y prot6E) y hallar la concordancia entre ésta y el método de detección microbiológico convencional que consta de preenriquecimiento no selectivo, enriquecimiento selectivo, aislamiento en agar diferencial y pruebas bioquímicas. Se analizan simultáneamente mediante ambos métodos un total de 111 muestras de hígado de cobayos con diagnóstico presuntivo de Salmonelosis provenientes de Chancay (Lima) y El Mantaro (Junín), llegando a detectar Salmonella Typhimurium por PCR Múltiple en 54% (60/111) de muestras y por análisis microbiológico en 41% (45/111) de ellas. Las pruebas muestran una concordancia substancial con un valor de Kappa de 0.64 y la prueba de McNemar demuestra que los resultados de ambas pruebas son estadísticamente diferentes (p>0.05), por lo tanto se concluye que la PCR Múltiple a partir de muestras en pre-enriquecimiento no selectivo sirve como una prueba tamiz que detecta Salmonella Typhimurium en volúmenes grandes de muestras de hígado de cobayos, siendo esta menos laboriosa y más rápida que la detección microbiológica convencional, sin embargo se recomienda utilizar ambas técnicas en combinación para mejorar los resultados. / Tesis

Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario / En el presente trabajo se desarrolló y validó un ensayo inmunoabsorbente ligado a un enzima (ELISA), usando antígeno lipopolisacárido rugoso (LPS-R) de la cepa RB51 de Brucella abortus para el diagnóstico de infección con B. ovis en ovinos. Se probaron 2 tipos de placas de poliestireno NUNC 69620 y Maxisorp, 2 tipos de tampones de distinto pH con 2 diferentes conjugados: policlonal anti IgG-ovina (Sigma A3415) y monoclonal anti IgG-caprino/ovino (Sigma A9452), las diluciones del antígeno y del conjugado del trabajo se obtuvieron mediante una titulación en tablero de ajedrez. El ensayo se validó utilizando la placa NUNC 69620 con una sensibilización del antígeno 1:50 en el tampón carbonato-bicarbonato y el uso del conjugado monoclonal, en 55 sueros de ovinos positivos a examen clínico y a la prueba de reacción en cadena de la polimerasa (PCR) y 338 sueros de ovinos provenientes de un rebaño libre de la enfermedad, confirmados por medio de fijación del complemento (FC). Para comparar las placas, las densidades ópticas (DO) fueron llevadas a porcentajes de positividad (PP), el punto de corte fue un 39,5% utilizando la metodología “Receiver-Operator Characteristic” (ROC), estimando la sensibilidad y la especificidad en un 92.7% y un 98,5% respectivamente. Estos resultados permiten establecer que el ELISA desarrollado sea una alternativa real, para el diagnóstico serólogico de B. ovis en el país

Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario. / Mycoplasma gallisepticum (MG) y Mycoplasma synoviae (MS) son patógenos que afectan el sistema respiratorio de las aves de producción y pueden ser transmitidos verticalmente a la progenie. Ambos forman parte de la lista de enfermedades de denuncia obligatoria a la Organización Mundial de Sanidad Animal (OIE). La medida más efectiva para controlar la enfermedad, ha sido por muchos años la erradicación mediante la mantención de abuelas y reproductoras libres de la infección, generando una progenie libre de MG y MS. En Chile, el diagnóstico de la micoplasmosis en planteles avícolas es realizado mediante técnicas serológicas capaces de detectar anticuerpos contra MG y MS, utilizando las técnicas de enzimoinmunoensayo (ELISA) e inhibición de la hemoaglutinación (IHA). Además se utiliza la técnica de cultivo y aislamiento bacteriano. Estas pruebas son utilizadas en el Programa de Control de Mycoplasma sp. dirigido a los distintos estratos de aves, pertenecientes a empresas avícolas productoras de carne de pollo, carne de pavo y de huevos de mesa. Al ser MG y MS patógenos de denuncia obligatoria, se vuelve de suma importancia implementar nuevas técnicas de laboratorio capaces de brindar resultados fidedignos y en tiempos acotados. Con el propósito de que, de existir un brote de la enfermedad, se pueda poner en marcha rápidamente las medidas de control propuestas por el Servicio Agrícola y Ganadero (SAG). La técnica de la Reacción de la Polimerasa en Cadena (PCR), desarrollada más recientemente, ha sido introducida en los laboratorios de diagnóstico de Chile y de otros países como una herramienta útil para analizar el estado sanitario de las aves de corral, principalmente, para confirmar los resultados positivos expresados por las pruebas de ELISA e IHA. La PCR es capaz de identificar el DNA específico de MG y MS, de forma rápida y certera. En el siguiente estudio, se buscó implementar un protocolo de PCR en cepas de referencia de MG y MS en un laboratorio de diagnóstico autorizado por el SAG y participante del programa oficial de control de Mycoplasma sp. y posteriormente, puesto a prueba en muestras de campo. Las muestras recolectadas para poner a prueba el protocolo de PCR, fueron tomadas en una población de gallinas de postura comerciales, clínica y productivamente sanas, pertenecientes a un plantel de aves serológicamente positivas a MG y MS mediante la prueba de ELISA. Para cumplir con el propósito del estudio, se realizó un paso de extracción y purificación del DNA genómico. A continuación se realizó la PCR con partidores diseñados para amplificar un fragmento de la secuencia del gen que codifica para el RNA ribosomal 16S de ambos patógenos. Posteriormente, se realizó la electroforesis de los productos de PCR en gel de agarosa al 2%, a 80 Voltios durante 40 minutos. Finalmente, se visualizaron las bandas de amplificación en un transiluminador UV, dejando registro fotográfico de las imágenes. El protocolo de PCR puesto en marcha demostró la capacidad de amplificar el DNA de las cepas de referencia, así como el DNA de MG y de MS presente en las muestras de campo. / Mycoplasma gallisepticum (MG) and Mycoplasma synoviae (MS) are two important pathogens that cause infections of the respiratory system of poultry. Also, they can be transmitted vertically to the progeny. Both are part of the reportable list of diseases to the World Organization for Animal Health (OIE). For many years, the main and most effective measure to control the disease has been the eradication of infection by maintaining batches of Grandparent lines and Parent Stock free of infection and thus generating a progeny free of MG and MS. The diagnosis of avian mycoplasmosis in poultry in Chile, is performed by serological methods capable of detecting antibodies against MG and MS, using the techniques of Immuno-Assays (ELISA) and hemagglutination inhibition (HI). Also, by employing cell culture and bacterial isolation. These tests are used as a part of the Mycoplasma sp. Control Program and are aimed at different types of birds of the Chilean Poultry Industry such as meat chicken, meat turkey and table eggs. Since MG and MS are pathogens notifiable to the OIE, it is very important to implement new laboratory techniques that are capable of providing reliable and fast results. In order to, in the case of an outbreak of the disease, begin as soon as possible with the control measures proposed by the Agriculture and Livestock Service. Developed more recently, the assay of Polymerase Chain Reaction (PCR) has been introduced in diagnostic laboratories of Chile and other countries as a useful tool for analyzing the health status of batches of poultry, and mainly, to confirm positive results expressed by the ELISA and HI. PCR test, is able to identify the specific DNA sequences of MG and MS, rapidly and accurately. In this study, we first implemented a PCR protocol with reference strains of MG and MS in a diagnostic laboratory authorized by the SAG and participant of the official program control Mycoplasma sp. and then we tested it with field samples. Tracheal swabs samples were collected, processed and tested with PCR protocol implemented. The samples were taken from a commercial population of laying hens, clinically and productively healthy, from a farm that was serologically positive to MG and MS by ELISA. To fulfill the purpose of this study, a preliminary step to extract and purify the genomic DNA was made. Then PCR was performed with primers designed to a fragment of the gene sequence coding for 16S ribosomal RNA of both pathogens. Subsequently, we performed 2% agarose gel electrophoresis, where the PCR products were subjected to a potential difference of 80 volts, for 40 minutes. We finally visualized the amplification bands on a UV lamp and kept photographic records. The protocol implemented demonstrated the ability to amplify DNA from both reference strains, as well as the DNA present in field samples for PCR of MG and MS.