Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario / Con el fin de detectar, por primera vez en Chile, la presencia de Helicobacter pylori y organismos Helicobacter heilmannii-like en el estómago de perros, se realizó la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) a biopsias gástricas de 10 perros que fueron positivos a la prueba de ureasa. Para la detección de H. pylori se utilizó una secuencia génica de la citotoxina vacuolizante (vac A) y para la detección de H. heilmannii-like se utilizó una secuencia génica de 112 pares de bases (pb) de ARN 16S, específico para este grupo de bacterias. Se obtuvo positividad en 5/10 perros para H. pylori y positividad en 6/10 perros para H. heilmannii-like. Dos individuos fueron positivos a ambas bacterias y un individuo negativo para ambas bacterias. A partir de estos resultados y con el fin de diagnosticar bacterias H. pylori y/o bacterias H. heilmannii-like en biopsias gástricas endoscópicas de perros, se recomienda la utilización de PCR, idealmente antecedido por la prueba rápida de ureasa. / Proyecto FIV no. 4602019

Memoria para optar al Titulo Profesional de Médico Veterinario / Quince machos y quince hembras de ratones de la cepa AKR fueron infectados experimentalmente con 2000 tripomastigotes del clon Dm 28c de Trypanosoma cruzi. En ambos grupos se midieron los niveles de parasitemia y la mortalidad. Los días 14, 26 y 100 post infección se tomaron muestras de corazón, hígado, riñón, intestino grueso, músculo esquelético y cerebro de 2 ratones sacrificados en cada grupo, para detectar la presencia del parásito mediante la técnica de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Los animales de ambos sexos se comportaron como susceptibles a la infección, falleciendo un 100% de los machos y un 73% por ciento de las hembras durante el experimento. Las hembras mostraron un pico de parasitemia significativamente mayor que los machos (p<0,05). De las muestras sometidas a PCR, corazón resultó positivo en todos los ratones, tanto machos como hembras, en todos los días muestreados. Todas las muestras obtenidas de machos resultaron positivas a la presencia del parásito, mientras que en los tejidos de hembras se observaron numerosas muestras negativas, dependiendo del individuo muestreado. Los resultados del presente trabajo apoyan la idea que los individuos nunca se curan de la infección, y que a pesar de desaparecer los signos clínicos, el parásito permanece en forma latente en diferentes tejidos, tal vez durante todo el resto de la vida del individuo

Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario / Las enfermedades infecciosas emergentes constituyen uno de los mayores desafíos que enfrenta tanto la salud humana como animal, así como la conservación de la biodiversidad. El virus distemper canino ha llamado fuertemente la atención en este aspecto, ya que posee una alta prevalencia en la población canina mundial. El distemper canino es una enfermedad viral sistémica y altamente contagiosa, siendo una de las principales causas de muerte en caninos domésticos y otros carnívoros. En los últimos años, la incidencia de distemper canino parece haber aumentado, documentándose la aparición de nuevas e inusuales cepas; las razones que explicarían estos cambios y sus efectos en su epidemiología aún son desconocidas. El virus distemper canino posee un alto grado de heterogeneidad genética, principalmente dado por la proteína hemaglutinina, la que demuestra patrones geográficos de diversificación que se utilizan para monitorear la epidemiología molecular del virus. En esta memoria de título se detectó el gen de la hemaglutinina (gen H) del virus distemper canino mediante la Reacción en Cadena de la Polimerasa previa transcripción reversa, se secuenció el fragmento de ADN amplificado y esta secuencia nucleotídica se incluyó en el análisis filogenético para el gen H utilizando secuencias oficiales y conocidas de virus distemper canino, incluyendo a las cepas vacunales utilizadas para la prevención de la enfermedad (Genbank®). Los resultados evidencian que en Chile al menos existirían dos de los linajes conocidos para VDC: Europa y América 1 / Financiamiento: Proyecto FIV 121014019102010

Memoria para optar al Titulo Profesional de Médico Veterinario / Los felinos domésticos son susceptibles a afecciones de variada etiología y la principal enfermedad respiratoria que los afecta es el denominado Complejo Respiratorio Felino (CRF), de etiología multifactorial y de distribución mundial, produce lesiones que sólo se tratan de forma sintomática y que, además, pueden dejar secuelas inhabilitantes para el animal. Entre los agentes virales asociados al CRF se encuentra el Virus Herpes Felino (VHF-1), un patógeno común en la clínica de animales de compañía y que al no existir un tratamiento definitivo y certero para esta enfermedad, hace necesario contar con un diagnóstico eficaz que permita detectarlo precozmente y así evitar su propagación. En consideración a lo anterior, esta Memoria de Titulo corresponde a un tercer estudio en paralelo a fin de establecer un protocolo para el diagnóstico molecular de VHF-1, mediante la detección del gen de la proteína UL37 utilizando la técnica de Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) convencional. Con el antecedente de que el gen del virus herpes canino tiene una similitud de un 90% con el gen del virus herpes felino, esta técnica podría detectar ambos virus. Sin embargo, pese a tener alta similitud genómica los resultados de la prueba mediante esta técnica fueron negativos, estableciéndose la alta especificidad que tiene el virus con cada especie hospedadora

Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario / En este estudio demostramos la detección de Trypanosoma cruzi en el roedor silvestre Octodon degus por medio de PCR en sangre y xenodiagnóstico usando los vectores doméstico (Triatoma infestans) y silvestre (Mepraia spinolai) de la enfermedad de Chagas. Se estudiaron 35 Octodon degus y 33 Oryctolagus cuniculus capturados en un área endémica de Chile. Para realizar el PCR se usaron muestras de sangre y contenido intestinal de los vectores alimentados con los animales. Los resultados muestran que el porcentaje de roedores naturalmente infectados con Trypanosoma cruzi depende de la muestra biológica usada en el PCR y la especie de vector usada en el xenodiagnóstico. Los PCR realizados en muestras de sangre no detectaron el DNA de Trypanosoma cruzi, pero el PCR del contenido intestinal indicó que ambos vectores fueron positivos al protozoo. Por lo tanto esta prueba resultó más sensible para detectar el Tripanosoma cruzi en estas especies. Por su parte Mepraia spinolai resultó 4 veces más sensible en detectar la infección por Trypanosoma cruzi en Octodon degus que Triatoma infestans, 22.9% y 5.7% respectivamente. Los resultados en Oryctolagus cuniculus fueron negativos tanto en las muestras de sangre como en los insectos. Todas las muestras positivas al PCR fueron analizadas con pruebas específicas de hibridación usando cuatro genotipos diferentes de Trypanosoma cruzi. Los resultados de la hibridación indican que Mepraia spinolai detectó más genotipos de Trypanosoma cruzi que Triatoma infestans. Estos resultados plantean que Mepraia spinolai es un insecto con una mejor capacidad vectorial que Triatoma infestans. Finalmente se informa el mejoramiento de la detección de Tripanosoma cruzi en animales silvestres con una combinación de PCR y xenodiagnóstico usando el vector endógeno y silvestre Mepraia spinolai / Proyecto FONDECYT No. 1040762 y Proyecto FONDECYT No. 1040711

Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario / El Distemper Canino (DC) es una de las principales enfermedades infecciosas en canes domésticos. La introducción de vacunas de virus vivos modificados ha ayudado a mantener controlada la enfermedad. No obstante, en las últimas décadas se ha observado un aumento de la incidencia de esta patología en poblaciones de canes de todo el mundo, desarrollándose inclusive en animales vacunados. Los linajes de virus distemper canino (VDC) circulantes en el mundo se han descrito en base al análisis de la hemaglutinina (H) debido a que posee un alto grado de variabilidad genética. Sin embargo, nuevos estudios han detectado mayores variaciones en la secuencia aminoacídica de una región de la proteína de fusión (F). Para determinar la variabilidad de las cepas de campo en comparación con las vacunas y las cepas de otros linajes, en esta memoria de título se analizó la variabilidad genómica de la región Fsp del gen de la proteína de fusión de VDC. Para esto se implementó una técnica de reacción en cadena de la polimerasa con transcripción reversa (RT-PCR) capaz de amplificar esta región variable, la cual fue identificada mediante su secuencia nucleotídica. Estas secuencias se compararon con cepas vacunales y con cepas de campo de los linajes conocidos. Además, se construyó un árbol filogenético para esta región variable. Los resultados de la comparación de nucleótidos arrojaron que las secuencias de las cepas de campo tienen mayor homología a la cepa vacunal Onderstepoort y según la filogenia pertenecerían al linaje América 1. PALABRAS / FIV 121014019102010

Memoria para optar al Titulo Profesional de Médico Veterinario / Salmonella spp. es uno de los principales agentes bacterianos responsables de toxiinfecciones alimentarias, siendo los diferentes productos de la industria avícola la mayor fuente de infección para el hombre. Esto hace necesario un constante monitoreo de Salmonella en los productos avícolas, para evitar brotes de Salmonelosis en la población. El aislamiento de Salmonella mediante el cultivo bacteriológico estándar implica como mínimo 4 a 7 días, después de procesos de pre-enriquecimiento y enriquecimientos en las etapas preliminares, antes de su identificación con pruebas bioquímicas y serológicas. Para reducir los tiempos y costos que involucra la utilización del cultivo bacteriológico estándar, se han desarrollado técnicas rápidas de detección de Salmonella spp. El Lightcycler PCR (Roche) de tiempo real permite reducir los tiempos de detección, procesar hasta 32 muestras simultáneamente y realizar el diagnóstico con una alta especificidad y sensibilidad. El objetivo de este trabajo fue comparar el PCR de tiempo real con detección por sondas fluorescentes, mediante la utilización de un kit diagnóstico comercial diseñado originalmente para muestras de alimentos, con el cultivo bacteriológico estándar, para la detección de Salmonella typhimurium en los dos tipos de muestras que oficialmente son remitidas, directamente desde las plantas faenadoras, al Servicio Agrícola y Ganadero (SAG) del Ministerio de Agricultura. Las muestras de piel de cuello y agua de lavado de canales de pollos fueron inoculadas experimentalmente con 104 ufc/ml de S. typhimurium nal r rif r. De las 132 muestras de piel de cuello de pollo analizadas por PCR tiempo real, 46 muestras (34,8%) fueron positivas y 86 muestras (65,2%) fueron negativas. De las 132 muestras de agua de lavado de canales de pollo analizadas por PCR tiempo real, 116 muestras (87,9%) fueron positivas y 16 muestras (12,1%) fueron negativas. Todas las muestras analizadas por cultivo bacteriológico estándar fueron positivas. Basado en estos resultados, se puede afirmar que existen diferencias significativas en la detección de Salmonella spp. entre el cultivo bacteriológico estándar y el PCR tiempo real realizado con un kit diagnóstico comercial originalmente diseñado para muestras de alimentos, por lo que el ensayo diagnóstico más apropiado para la detección de Salmonella spp. desde piel de cuello y agua de lavado de canales de pollos es el cultivo bacteriológico estándar / Financiada parcialmente por Laboratorio Roche Chile S.A.

Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario / Los serotipos de Salmonella tradicionalmente se han clasificado mediante métodos serológicos que determinan antígenos somáticos y flagelares específicos. Sin embargo, este método diagnóstico es caro y tarda mucho tiempo en dar un resultado ya que requiere implementar una batería de anticuerpos para detectar los más de 2.500 serotipos de Salmonella enterica que se han identificado. Por otra parte, la identificación molecular de los genes responsables de la expresión de antígenos flagelares son más rápidos y más sensibles que la identificación serológica. Es por esto que, en la presente memoria se implementaron pruebas de PCR para identificar S. enterica serotipos Typhimurium y Hadar, ambas incluidas en un plan nacional de control de Salmonella en establecimientos comerciales de aves. Se analizaron 135 cepas, 50 correspondientes a S. Typhimurium, 50 a S. Hadar y 35 enterobacterias como controles negativos. Estas cepas, previamente serotipificadas en el Instituto de Salud Pública (ISP), fueron sometidas a la prueba de PCR para determinar si existen diferencias de diagnóstico entre ambas técnicas. Del total de cepas analizadas, sólo 46 cepas de S. Typhimurium dieron positivas a la prueba de PCR y cuatro dieron negativas, mientras que las 50 cepas de S. Hadar dieron positivas a las dos pruebas de PCR. Las 35 enterobacterias dieron negativas a las 3 pruebas de PCR. De acuerdo a los resultados obtenidos en el estudio, la detección de antígenos mediante serotipificación y PCR para las cepas de S. Typhimurium fue menor al esperado (92%), a diferencia de lo que ocurrió con las cepas de S. Hadar en que hubo 100% de acuerdo entre ambas técnicas, sugiriendo que esta prueba de detección de Salmonella es posible reemplazarla por los métodos tradicionales de identificación y así poder acelerar el diagnóstico de esta bacteria de gran importancia para la salud pública

Determina la dinámica poblacional de bacterias ácido lácticas (BAL) en la fermentación controlada de Capsicum frutescens, ají “charapita” por qPCR y los métodos tradicionales. Previamente, se determinó la especificidad de los cebadores WLAB1 y WLAB2 con cepas BAL aisladas de frutos de la región Loreto, así como se elaboró una curva estándar de L. plantarum ATCC 14917 a partir del cultivo en medio MRS y fermentación formulado para determinar los límites de detección de la qPCR. Durante la fermentación, se realizaron análisis microbiológicos para enumerar las BAL por recuento en microscopio, placa y qPCR. Así mismo, se determinaron los azúcares reductores, acidez total titulable y pH. Los recuentos de BAL por microscopía y qPCR fueron similares durante la fermentación. Sin embargo, el recuento de colonias en agar MRS fue menor a los obtenidos con las otras técnicas empleadas. En conclusión, qPCR permitió detectar y cuantificar BAL en la fermentación controlada de chile "charapita". / Tesis

Tesis para optar al Grado de Magíster en Ciencias Agropecuarias Mención Sanidad Vegetal / La Enfermedad del Mosaico de la Higuera está ampliamente distribuida en el mundo y ha sido reportada en varios países, especialmente en la cuenca del Mediterráneo. Sin embargo, para Chile no existe ningún registro de la situación viral de la higuera. En este trabajo se realizó una prospección en los principales cultivos comerciales de este frutal distribuidos en las Regiones de Coquimbo (IV), Valparaíso (V), Libertador Bernardo O´Higgins (VI) y Región Metropolitana. Las variedades “Black Mission” (higo negro) y “Kadota” (higo blanco) fueron encontradas más comúnmente. La detección en las 120 muestras estudiadas se realizó mediante la técnica de RT-PCR. Los virus prospectados fueron FLMaV-1, FLMaV-2, FMV, FMMaV, FFkaV, AFCV-2, FBV-1, FCV, FLV-1 y AFCV-1, de los cuales no fueron detectados los tres últimos. El virus que fue encontrado con mayor frecuencia fue FBV-1 (84,03%), seguido por FMV con una incidencia de 69,75% y FLMaV-1 en 62,18% de las muestras. Las infecciones virales fueron simples (20%), dobles (20,83%), triples (29,17%), cuádruples (25,83%) o quíntuples (0,83%), y 3,33% de las plantas no presentaron ninguno de los virus prospectados. Finalmente, se realizó una caracterización molecular de los aislados virales encontrados en Chile para los virus FMV, FLMaV-1, FLMaV-2, FFkaV, FMMaV y AFCV-2, que confirman esta prospección y clasifican a estos virus a nivel molecular con otras cepas encontradas en diversos países. / The Fig Mosaic Disease (FMD) is widely distributed worldwide and it has been reported in several countries, especially around the Mediterranean basin. However, there is no record of the viral situation of fig trees in Chile. In this research, a viral prospection was done in the main commercial fig orchards, distributed in the regions of Coquimbo (IV), Valparaíso (V), Libertador Bernardo O´Higgins (VI) and Metropolitan Region. “Black Mission” (black fig) and “Kadota” (white fig) were the fig varieties that were most commonly found. 120 samples were analyzed and the detection was made with RT-PCR. FLMaV-1, FLMaV-2, FMV, FMMaV, FFkaV, AFCV-2, FBV-1, FCV, FLV-1 and AFCV-1 were analyzed in each sample, and the last three viruses named here were not found. The most frequent virus was FBV-1, found in 84,03% of the samples, followed by FMV (69,75%) and FLMaV-1 (62,18%). The viral infections were simple (20%), double (20,83%), triple (29,17%), quadruple (25,83%) or quintuple (0,83%), and 3,33% of the plants did not present any of the analyzed virus. Finally, a molecular characterization of the viral isolates found in Chile was conducted for FMV, FLMaV-1, FLMaV-2, FFkaV, FMMaV and AFCV-2, which confirms the results of this prospection and classifies these viruses at a molecular level with viral isolates of other countries.