Publicación a texto completo no autorizada por el autor / Evalúa un panel de marcadores genéticos de tipo microsatélite en muestras de ADN de los cuatro tipos de camélidos sudamericanos; alpacas, llamas, vicuñas y guanacos. Así mismo se busca conocer la estructura poblacional de alpacas y llamas y su relación con la vicuña y guanaco (especies silvestres). Para ello se evalúa un panel de 11 marcadores microsatélites y un marcador mitocondrial. Del análisis se confirma la existencia de sólo dos haplotipos para los camélidos sudamericanos (I y II) y la presencia de alpacas y llamas híbridas entre ellas. Además, se confirma las relaciones genéticas entre alpacas con vicuñas y llamas con guanacos, contribuyendo a entender el origen de los camélidos domésticos. Los marcadores microsatélite evaluados permiten confirmar que los dos fenotípos de alpacas (huacaya y suri) constituyen un solo grupo genético y que los dos tipos de llamas evaluadas (Q´ara y ch´aku) son genéticamente distintas. Finalmente los análisis desarrollados permiten identificar alpacas y llamas híbridas, animales que podrían poner en riesgo la conservación de nuestros recursos genéticos animales. / Consejo Nacional de Ciencia y Tecnología (Perú) Universidad Nacional Mayor de San Marcos (Lima). Vicerrectorado de Investigación y Posgrado / Tesis

Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario / La piscirickettsiosis es una enfermedad bacteriana producida por Piscirickettsia salmonis (P. salmonis) que provoca severas pérdidas económicas a la industria del salmón en el sur de Chile por conceptos de mortalidad, tratamientos antimicrobianos y el uso de vacunas. Debido a que su signología no es patognomónica se debe recurrir a pruebas de laboratorio para determinar la presencia de su agente etiológico con el fin de establecer medidas de control y tratamientos adecuados. A pesar de que la enfermedad fue descrita en 1989, la patogénesis y las vías de transmisión de la bacteria se encuentran insuficientemente descritas, por lo que la presente Memoria de Título tuvo como uno de sus objetivos determinar la presencia y asociación de P. salmonis en distintas muestras de 19 peces de la especie salmón coho (Oncorhynchus kisutch) afectados por piscirickettsiosis. En esta Memoria de Título se determinó la presencia de P. salmonis mediante la técnica de Reacción en Cadena de la Polimerasa anidada (PCR anidado) en el 79%, 95% y 87% de las muestras de hígado, riñón y heces respectivamente. El análisis estadístico realizado mediante el coeficiente de Kappa, determinó que hígado-riñón y riñón-heces están considerablemente asociados, mientras que hígado-heces poseen una moderada asociación. Adicionalmente, de cada órgano estudiado se realizó un análisis por separado de tres fragmentos de tejido con el fin de establecer si existía consistencia en el diagnóstico entre ellas. Los resultados (analizados también con el coeficiente de Kappa), indicaron débil asociación entre las muestras analizadas, lo que sugiere un riesgo para la detección del agente según el fragmento que se utiliza. Al aumentar la cantidad de tejido analizado se demostró que aumenta la posibilidad de detección de la bacteria. Por otra parte, este estudio constituye el primer reporte de la presencia de la bacteria en heces de salmón coho en condiciones de cultivo en mar a través de la técnica de PCR anidado. No obstante lo anterior, son necesarios más estudios para establecer la viabilidad de la bacteria en el contenido fecal. / Piscirickettsiosis is a bacterial disease caused by Piscirickettsia salmonis. It causes severe economic losses in the salmon industry in southern Chile by concepts of mortality, antimicrobial treatments and the use of vaccines. The clinical signs are not pathognomonic and because of that laboratory tests are required to determine the presence of its causative agent in order to establish control measures and treatments. Piscirickettsiosis was described in 1989 but up to this day, the pathogenesis and transmission routes of the bacteria are still inadequately described, because of that reason one of the main objectives of this work was to determine the presence and association of P. salmonis in different samples of 19 coho salmon (O. kitsuch) affected by piscirickettsiosis. The presence of P. salmonis was determined by the technique of Nested Polymerase Chain Reaction (nested PCR) in 79%, 95% and 87% of the samples of liver, kidney and feces respectively. The statistical analysis performed using the Cohen's Kappa coefficient, found that liver-kidney and kidney-feces are significantly associated, whereas liver-feces have a moderate association. Additionally, separate analysis was made of three pieces of tissue in order to establish whereas the diagnosis between them was consistent. The results (also analyzed with Cohen's Kappa coefficient) indicated weak association between the samples analyzed, suggesting a detection risk according to the fragment analyzed. It was demonstrated that increasing the amount of analyzed tissue increases the detectability of the bacteria. Moreover, this study is the first report about the presence of P. salmonis in coho salmon feces in sea farming conditions through technical of nested PCR. Further studies are necessary to establish the viability of the bacteria in the fecal content. / Financiamiento: Laboratorio Nacional de Referencia para el Diagnóstico de Enfermedades de Especies Hidrobiológicas, U. de Chile. Salmones Humboldt Ltda.

Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario / La brucelosis canina es una enfermedad zoonótica causada por Brucella canis, la cual produce signos reproductivos como abortos en hembras e infertilidad en machos, siendo transmitida al hombre a través de contacto con perras que hayan parido o abortado recientemente o por exposición a la bacteria en laboratorios. La enfermedad actualmente presenta tres puntos críticos y que afectan directamente su control y prevención: i) no existen vacunas comerciales, ii) no hay tratamientos antimicrobianos exitosos y iii) existen problemas en el diagnóstico por cultivo tradicional debido a su lento crecimiento e intermitencia en la bacteremia, y problemas en la sensibilidad y especificidad de las técnicas serológicas en el diagnóstico indirecto. La Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) surge entonces como una opción de diagnóstico por ser altamente sensible y específica, otorgando además una pesquisa rápida. En el presente estudio se estableció la sensibilidad analítica de un protocolo de PCR convencional con partidores diseñados en el país en cultivo puro, muestras de sangre y orina para el diagnóstico de B. canis. La sensibilidad analítica en cultivo puro fue de 22,24 fg/μL de DNA y en muestras de sangre y orina experimentalmente contaminadas de 4,4x100 UFC/mL. La elevada sensibilidad analítica determinada sugiere que este protocolo puede ser utilizado como una alternativa de alto valor para el diagnóstico de B. canis en las muestras mencionadas, siendo importante continuar con esta línea de investigación, orientando estos hacia un estudio más detallado de especificidad y estudios de sensibilidad analítica en otras matrices. / Canine brucellosis is a zoonotic disease caused by Brucella canis, which produces reproductive signs such as abortion in bitches and infertility in dogs. These being transmitted to humans by contact with bitches that have recently given birth or aborted or by exposure to the bacteria in laboratories. Currently, the disease has three critical points that, to date, have not been resolved and that directly affect the control and prevention of this: i) there are no commercial vaccines, ii) no successful antimicrobial treatments and iii) problems in diagnosis; existing both difficulties to isolate the agent because of its slow growth and intermittent bacteremia in bacterial culture, and sensitivity and specificity problems in the numerous serological techniques. The PCR, thus, emerges as a diagnostic option due to its highly sensitive and specific nature, providing a fast diagnosis as a result. In the present study, the analytical sensitivity of conventional PCR protocol with primers designed in the country in pure culture, blood and urine samples for diagnosis of B. canis was established. The analytical sensitivity in pure culture was 22,24 fg/μL of DNA, and in experimentally contaminated blood and urine samples 4,4x100 UFC/mL. Given the high analytical sensitivity suggests that this protocol can be used as a highly valuable alternative for the diagnosis of this disease in the samples mentioned, understanding - consequently -, the major importance to continue this line of research, orienting these to a more detailed study of specificity, and analytical sensitivity studies in other matrices.

Tesis presentada como parte de los requisitos para optar al grado de Magíster en Ciencias de la Acuicultura / La creciente demanda mundial de productos pesqueros y el estancamiento de la pesca extractiva, ha llevado a la acuicultura a la búsqueda de nuevas especies para ser cultivadas. Nowadays, en la región del Bío Bío se potencia al Camarón de Roca como recurso cultivable. La presente investigación genera información base para desarrollar su cultivo, estableciendo parámetros de diversidad genética de sus poblaciones naturales y determinando su grado de estructuración genética. Para ello se utilizaron marcadores moleculares tipo RAPD (Random Amplified Polimorphic DNA) y el gen mitocondrial de la Citocromo Oxidasa subunidad I (COI). Las zonas de muestreadas fueron Guayacán (29°58’0,02”S, 71°21’0,312”W), Zapallar (32º33’01,5”S, 71º27’35,6”W) y Chome (36º46’26”S; 73º12’47”W). De un total de 186 individuos colectados, 170 fueron genotipados con 5 primer RAPD identificándose 34 fragmentos polimórficos. En cuanto a COI se analizaron 54 secuencias que contienen 18 haplotipos. Los resultados de los estadísticos genéticos en el caso de los marcadores RAPD (GST, FST (θ) y Nm) al comparar todas las poblaciones fueron de 0,0425, 0,0486 y 11,27 respectivamente, observándose además identidades genéticas de Nei de 0,926 (Chome- Guayacán), 0,952 (Zapallar-Guayacán) y 0,966 (Chome-Zapallar). Para el caso de COI, el índice de diversidad genética total fue de 0,786. El estadístico FST fluctuó entre -0,029 y - 0,017, las correlaciones de distancias genéticas con las geográficas mediante pruebas de Mantel resultaron ser bajas 0,32 (RAPD) y 0,62 (COI). En el análisis network usando la aproximación Median Joining, se observa una forma de estrella, patrón consistente con una expansión poblacional geográfica reciente. Los análisis realizados indican que no hay presencia de estructuración genética entre las localidades muestreadas. Este estudio es una primera aproximación al conocimiento a nivel genético de esta especie y su estructura poblacional. El análisis de la estructura genética poblacional brindó información importante con respecto a la forma en que se encuentra distribuida la diversidad genética dentro y entre las áreas muestreadas y que estaría apoyando la hipótesis de que no existe estructuración poblacional a una escala geográfica, no obstante para tomar decisiones de manejo en esta especie se recomienda incluir un mayor número de localidades a lo largo de la distribución de la especie. La información aquí expuesta nos permite inferir además la forma de plantear futuros programas de selección asistida por marcadores (MAS) en esta especie. / The growing global request for sea food and the decrease of capture fisheries, aquaculture has led to the search for new species for cultivate. Actually, the rock shrimp (Rhynchocinetes typus) in the Bío Bío is enhanced as the resource rock shrimp cultivation. This research generates basic information to develop this commodity, determining parameters of genetic diversity in natural populations and their degree of genetic structuring. For this objective we used molecular markers RAPD (Random Amplified Polimorphic DNA) and the mitochondrial gene Cytochrome Oxidase Subunit I (COI). The areas sampled were Guayacán (29 ° 58'0, 02 "S, 71 ° 21'0, 312" W), Zapallar (32 º 33'01, 5 "S, 71 º 27'35, 6" W) and Chome (36 ° 46'26 "S, 73 º 12'47" W). From a total of 186 individuals collected, 170 were genotyped with 5 RAPD primers identifying 34 polymorphic fragments. Regarding COI 54 sequences were analyzed containing 18 different haplotypes. The results of genetic analysis in the case of RAPD markers (GST, FST (θ) y Nm) when comparing all populations were 0.0425, 0.0486, and 11.27 respectively, also the observed Nei genetic identities were 0.926 (Chome-Guayacán), 0.952 (Zapallar- Guayacán) y 0.966 (Chome-Zapallar). For the case of COI, the total genetic diversity index was 0.786. The FST statistic ranged between -0.029 and -0.017, genetic correlations with geographic distances using Mantel tests were found to be low 0.32 (to RAPD markers) and 0.62 (COI gene). In network analysis using Median Joining approximation, there is a starshaped pattern consistent with a recent geographic population expansion. Analyses indicate no presence of genetic structure among localities sampled. This study is a first approach to knowledge at the genetic level of this species and its population structure. Analysis of population genetic structure provided important information regarding the manner in which genetic diversity is distributed within and between sampled areas, that would support the hypothesis that there is no population structure at a geographical scale, however to take management decisions in this species is recommended to include a greater number of locations along the distribution of the species. The information presented also allows us to infer how to approach future programs of marker assisted selection (MAS) in this species.

El documento digital no refiere asesor / Caracteriza a nivel molecular las cepas del virus de la Enfermedad de Newcastle (ENC) aislado de aves domésticas de diferentes regiones del Perú mediante la prueba de Transcripción Reversa- Reacción en Cadena de la Polimerasa (RT-PCR) y secuenciación del gen de la proteína de fusión. Las muestras clínicas de aves de traspatio, riña y granjas avícolas comerciales procedentes de brotes de ENC ocurridos en el país, fueron recolectados entre los años 2009 al 2011. Las pruebas de RT-PCR detectaron la presencia del virus de la ENC en todas las muestras de aves, se determinó cepas ENC de alta patogenicidad en aves de traspatio y riña y de baja patogenicidad en aves de traspatio y granjas avícolas comerciales. Con el propósito de evaluar la virulencia de los aislamientos virales, se amplificó y secuenció la principal región funcional del gen de la proteína de fusión, para así realizar el análisis filogenético y determinar el patotipo. La secuenciación del gen de la proteína de fusión de los aislamientos virulentos, presentó la secuencia 113RQKRF117 con aminoácidos básicos entre las posiciones 113 al 116 y una fenilalanina en la posición 117; lo cual es característico de los aislamientos virulentos velogénicos. Además, se agruparon en el genotipo VII y poseen mayor similitud con los virus Newcastle virulentos reportados en Perú y Malasia. La proteína fusión en las cepas de baja virulencia presentaron aminoácidos básicos en la posición 113 y 116 y una leucina en la posición 117, lo cual es característico de los virus ENC lentogénicos. Además se agruparon en los genotipos I y II, presentando ambos genotipos mayor similitud con los virus ENC de EEUU. / Tesis

La reacción en cadena de polimerasa (PCR, por sus siglas en inglés) es un proceso ubicuo en laboratorios biológicos. Su uso específico que nos interesa en este trabajo es el de bio identificación de micro organismos en muestras biológicas ambientales, área conocida como metagenómica. Un PCR exitoso requiere pequeñas secuencias de nucleótidos llamadas “partidores”, las cuales deben satisfacer variadas condiciones termodinámicas y biológicas. El proceso de diseño de ellos es un tema de amplio estudio en bioinformática, pues es un proceso maduro y que necesita cada vez más contar con predicciones computacionales de su desempeño. El objetivo de esta memoria es desarrollar una herramienta de uso intensivo para el diseño de partidores de PCR en metagenómica, basándose en el trabajo previo del Laboratorio de Bioinformática y Matemática del Genoma (LBMG) de la Universidad de Chile. El sistema existente es una colección de programas, algunos de cómputo paralelo, que permiten definir un universo taxonómico, calcular partidores para dicho universo y simular su comportamiento numéricamente. Sin embargo, el sistema es de difícil operación e insuficiente extensibilidad. La metodología para este trabajo consiste de una revisión bibliográfica del estado del arte en la literatura científica y del LBMG, para posteriormente proceder a un re diseño que contemple las extensiones de interés y una re implementación del sistema acorde al re diseño. El resultado obtenido es el núcleo de la herramienta, con un diseño claro y escalable, junto con su correspondiente implementación, que tiene las mismas funcionalidades del sistema existente exceptuando la paralelización. Se obtiene además una especificación de las cualidades que se deben añadir o completar para contar con un sistema finalizado y operativo de uso intensivo. Se concluye que el trabajo realizado representa un avance importante en la sistematización del diseño de partidores para PCR sobre el cual basar trabajos futuros de extensión, aplicación a distintos dominios biológicos y como muestra de desarrollos concretos realizados íntegramente en el LBMG.

Detecta Mycobacterium tuberculosis en muestras de heces de niños del Instituto Nacional de Salud del Niño, mediante la técnica molecular de reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Para esto se toman muestras biológicas de heces de 236 niños menores de 12 años de edad pertenecientes al Instituto Nacional de Salud del Niño, estas muestras son sometidas a dos métodos de extracción de ADN una denominado “FastDNA® SPIN Kit for Soil” (Qbiogene) y el otro “Chelex 100”. Este estudio demuestra que se puede estandarizar la técnica de PCR para detección de M. tuberculosis en muestras de heces, y sus posibles aplicaciones como método rápido de diagnóstico, en una población en donde la naturaleza paucibacilar de las muestras convencionales no permite la detección inmediata del bacilo. / Tesis

Establece un protocolo de validación dirigido a la estandarización, optimización y validación de una prueba de PCR convencional para el diagnóstico confirmatorio del HTLV-1 en PBMCs. Las pruebas de reacción en cadena de la polimerasa convencional (PCR) o en tiempo real de tipo cuantitativa (qPCR) son propuestas debido a su versatilidad a materiales biológicos, alta sensibilidad y especificidad y relativo bajo costo. La detección del provirus del HTLV-1 por pruebas de PCR convencional tiene bajo costo y es aplicable a diversos formatos como placas de 96 pozos, tiras de 8 pozos y tubos individuales. En contraparte, las pruebas de qPCR generalmente usan master mix universales que limitan las oportunidades de optimización y requiere del uso de una placa de reacción de 96 pozos para el procesamiento de 16 muestras. Por tanto, se desarrolla una prueba de PCR convencional priorizando su utilidad como prueba cualitativa confirmatoria del HTLV-1 de bajo costo y aplicación a diversos formatos de procesamiento. / Tesis

Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario / El Distemper Canino es una enfermedad viral de distribución mundial, letal y altamente contagiosa, producida por el Virus Distemper Canino, el cual afecta a un amplio rango de hospederos, como perros domésticos y representantes silvestres de distintas familias de carnívoros, comprometiendo drásticamente la conservación de especies amenazadas. Para el diagnóstico definitivo ante-mortem de la enfermedad, se han sugerido una gran variedad de parámetros clínicos y diferentes tipos de ensayos, sin embargo, debido al curso imprevisible y variable de ésta, el diagnóstico final para algunos animales continúa siendo incierto. En consideración a lo anterior y a que el desarrollo de técnicas moleculares ofrece diversos procedimientos para pruebas diagnósticas, el objetivo de esta memoria de título postuló la detección del gen de la proteína de la nucleocápside del Virus Distemper Canino mediante la reacción en cadena de la polimerasa asociada a transcripción inversa, como una forma de diagnóstico rápido y específico para la detección del virus. La especificidad del método se evidenció por la amplificación del fragmento esperado en el 100% de los controles positivos a Virus Distemper Canino, tanto los tres controles vacunales (cepa Onderstepoort, Lederle y Snyder Hill), como los diez controles de RNA viral provenientes desde aislados nacionales, y en la no amplificación del fragmento esperado en los controles negativos (perros no infectados con y sin vacunación). Sumado a esto, los fragmentos de DNA amplificados fueron enviados a secuenciar y mediante el programa BLAST, se confirmó que éstos correspondían a Virus Distemper Canino. Además, se propone que el método podría tener una alta sensibilidad, debido a la amplificación del fragmento esperado en el 91% de las muestras de campo provenientes de perros sospechosos de Distemper Canino. En base a lo anterior, el método implementado puede colaborar con la prevención y el control del aumento de Distemper Canino, tanto en la población canina, como en otros animales susceptibles a la enfermedad / Financiamiento: Proyecto FIV 121014019102010

Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario / El Cadmio (Cd2+) es un contaminante ampliamente distribuido en el ambiente; la exposición de la población ocurre principalmente a través del humo de tabaco. Se han descrito efectos adversos en la salud, algunos de los cuales son dependientes del sexo. Específicamente, en crías expuestas durante la gestación, disminuye el peso de nacimiento (PN) lo que se asocia a una exposición fetal aumentada a glucocorticoides (GC). Los GC actúan a través de sus receptores específicos (GR) localizados en los tejidos blancos; en el hígado, la unión GC-GR activa la expresión de genes involucrados en el metabolismo de carbohidratos (CH) y lípidos. Entre éstos se encuentra el gen de la enzima fosfoenol piruvato carboxiquinasa (PEPCK, limitante en el proceso de gluconeogénesis) y el de la enzima acetil Co-A oxidasa (AOX, limitante en el proceso de β-oxidación peroxisomal). En este estudio, se postuló que el Cd2+ administrado durante la gestación induce en las crías neonatas una alteración en la expresión hepática del GR y consecuentemente, de sus genes blancos, PEPCK y AOX, con una concomitante alteración en los niveles hepáticos de glicógeno, triacilglicerol (TAG) y colesterol, de manera diferenciada en machos y hembras. El modelo de estudio utilizado fue ratas de la cepa Wistar tratadas con 10 ppm de Cd2+ (como CdCl2 en el agua de bebida) desde el destete hasta el cruzamiento, y luego con 50 ppm de Cd2+ durante toda la gestación. Posteriormente, en el hígado de las crías neonatas se determinó la expresión de GR (proteína, mediante Western Blot y mRNA por qRT-PCR), PEPCK (mRNA) y AOX (mRNA). También se analizó el contenido de glicógeno, TAG y colesterol. Los resultados indican que GR hepático aumenta su expresión en hembras y en machos disminuye. También hay efectos diferenciados en los niveles de mRNA para PEPCK, y AOX. Se concluye que la exposición a Cd2+ durante el desarrollo induce alteraciones tempranas en el patrón de expresión de genes relacionados con el sistema GC y metabolismo de CH y lípidos. Los efectos son dependientes del sexo y pueden inducir una reprogramación fetal a largo plazo explicando el desarrollo de ciertas patologías / Fondecyt No. 1071110