Thesis (MScMedSc)--Stellenbosch University, 2011. / ENGLISH ABSTRACT: Non-Alcoholic Fatty Liver Disease (NAFLD) is the most prevalent chronic liver disease in Western countries and is considered the hepatic manifestation of the Metabolic Syndrome (MetS). Its heterogeneous nature ranges from hepatic steatosis through steatohepatitis to advanced fibrosis and cirrhosis where the ingestion of significant amounts of alcohol has been excluded. The disease profile of NAFLD and its necro-inflammatory subset Nonalcoholic Steatohepatitis (NASH) were described in the parent study, which provided a clinically well-characterised patient cohort for the present investigation. South African patients with NASH had significantly higher mean serum cholesterol and triglyceride levels than those with fatty liver only. The objective of this study was to implement a high-throughput real-time polymerase chain reaction (PCR) method in our laboratory to enable the assessment of cardiovascular genetic risk factors in NAFLD patients. The specific aims were to determine the clinical utility and perform analytical validation of each mutation included in the multi-gene cardiovascular disease (CVD) screening assay. The Pathology Supported Genetic Testing (PSGT) concept developed at our department provides a practical approach to personalized medicine. The CVD multi-gene screen analyses key metabolic pathways relating to atherogenic dyslipidaemia, chronic inflammation, hypercoagulation and iron dysregulation implicated in insulin resistance, which is known to be a universal factor in the pathogenesis of NAFLD. Deleterious low-penetrance mutations in the APOE (APOE2 and E4 alleles), MTHFR (677C>T and 1298A>C), F2 (20210G>A), FV (1691G>A, Leiden) and HFE (C282Y and H63D) genes were included for analysis due to their important role as genetic contributors to these biological processes. A total of 178 patients diagnosed with NAFLD and 75 controls were studied using direct DNA sequencing and a RT-PCR system for mutation detection. In addition, two patients with high ferritin levels were included as case studies. A significant association was found between HFE mutations and elevated Alanine Transaminase (ALT) levels in the NAFLD population (p = 0.04). This discovery is interpreted as the identification of a subset of patients at greater risk of developing progressive liver damage who would benefit most from genetic testing to direct more aggressive therapy at an earlier stage. The necessity of an integrative, systems-based network approach was demonstrated to more accurately distinguish between Hereditary Haemochromatosis (HH) and Insulin Resistance-associated Hepatic Iron Overload (IR-HIO) syndrome in obese patients. The PSGT approach to personalized medicine facilitates diagnosis of CVD subtypes, prevention of cumulative risk and the formulation of gene-based intervention programs tailored to the needs of the patient. These findings support the clinical utility of the CVD multi-gene test to guide chronic disease risk management in patients with NAFLD. The HFE mutation detection component of this test is of particular relevance in directing an effective treatment strategy in patients with a medical history of CVD and/or high iron stores. / AFRIKAANSE OPSOMMING: Nie-Alkoholiese Vettige Lewer Siekte (NAFLD) is die mees algemene kroniese lewer siekte in Westerse lande en word bestempel as die hepatiese manifestasie van die Metaboliese Sindroom (MetS). Die heterogene natuur van NAFLD strek van hepatiese steatose deur steatohepatietis tot gevorderde fibrose en sirrose waar grootskaalse alkohol inname uitgesluit is. Die siekte-profiel van NAFLD en sy nekro-inflammatoriese subtipe Nie-Alkoholiese Steatohepatietis (NASH) is reeds beskryf in die ouer studie, wat ‗n klinies goed-gekarakteriseerde pasiënt groep vir die huidige ondersoek daar gestel het. Suid-Afrikaanse pasiënte met NASH het beduidend hoër gemiddelde serum cholesterol en trigliseried vlakke in vergelyking met slegs vettige lewer. Die doel van hierdie studie was om ‗n hoë deurvoer rieëltyd polimerase kettingreaksie (RT-PCR) metode in ons laboratorium te implimenteer om kardiovaskulêre genetiese risiko faktore in NAFLD pasiënte te ondersoek. Die spesifieke mikpunte was om die kliniese nut en analitiese geldigheid van elke mutasie wat ingesluit is in die multi-geen kardiovaskulêre siekte (KVS) siftings toets vas te stel. Die Patologie Ondersteunde Genetiese Toetsing (PSGT) konsep wat by ons departement ontwikkel is, verskaf ‗n praktiese benadering tot persoonlike medisyne. Die KVS multi-geen toets analiseer belangrike metaboliese weë verwant aan atherogene dyslipidemie, kroniese inflammasie, oormatige bloedstolling en yster disregulering wat betrokke is by insulien weerstand wat bekend is as ‗n universele factor in the patogenese van NAFLD. Nadelige lae-penetrasie mutasies in die APOE (APOE2 en E4 allele), MTHFR (677C>T en 1298A>C) F2 (20210G>A), FV (1691G>A, Leiden) en HFE (C282Y en H63D) gene was ingesluit vir analise as gevolg van hul belangrike rol as genetiese bydraers tot die bogenoemde biologiese prosesse. ‗n Totaal van 178 pasiënte gediagnoseer met NAFLD en 75 kontroles is bestudeer deur gebruik te maak van direkte DNA volgordebepaling en ‗n RT-PCR metode vir mutasie opsporing. Twee pasiënte met verhoogde ferritien vlakke is ook as gevalle studies ingesluit. ‗n Beduidende assosiasie is gevind tussen HFE mutasies en verhoogde Alanien Transaminase (ALT) vlakke in die NAFLD studiepopulasie (p = 0.04) wat aanduidend is van ‗n subgroup van pasiënte wat die meeste baat sal vind uit genetiese toetsing om meer aggressiewe behandeling te rig op' n vroeër stadium. Die noodsaaklikheid van 'n geïntegreerde, stelsels-gebaseerde netwerk benadering is gewys om meer akkuraat te onderskei tussen Oorerflike Hemochromatose (HH) en Insulien Weerstand-geassosieerde Hepatiese Yster Oorlading (IR-HIO) sindroom in vetsugtige pasiënte. Die PSGT benadering tot persoonlike medisyne formuleer geen-gebaseerde intervensie programme aangepas tot die behoeftes van die pasiënt ek maak diagnose van KVS-subtipes en voorkoming van kumulatiewe risiko moontlik. Hierdie bevindinge ondersteun die kliniese nut van die KVS multi-geen toets om riglyne vir die risikobestuur van kroniese siektes soos NAFLD daar te stel. Die HFE mutasie opsporings komponent van hierdie toets is van besondere belang om 'n effektiewe strategie vir die behandeling van pasiënte met 'n mediese geskiedenis van KVS en/of hoë yster vlakke daar te stel.

INTRODUÇÃO: A leishmaniose tegumentar americana (LT) é uma doença infecciosa, não contagiosa, de transmissão vetorial com ciclo heteroxênico causada por parasitos do gênero Leishmania. É considerada uma enfermidade polimórfica que acomete pele e mucosas. Os medicamentos atualmente disponíveis para o tratamento da doença são insatisfatórios devido à sua eficácia limitada e seus efeitos colaterais, além do alto custo e a resistência que os protozoários acumulam contra essas drogas. O aumento da tolerabilidade é fundamental para o êxito global do tratamento. As formulações lipídicas comerciais da anfotericina B (AB), Ambisome®, Abelcet®e Amphocil®, apresentaram-se como um avanço no tratamento da (LT). Sistemas de nanoemulsões lipídicas reduzem a toxicidade de quimioterápicos e, ao mesmo tempo, aumentam sua ação farmacológica. Emulsões lipídicas com composição semelhante aos quilomícrons tem potencial aplicabilidade para vetorização de AB. OBJETIVO: Avaliar a citotoxicidade in vitro da anfotericina B desoxicolato (AB) e sua associação à nanoemulsão lipídica, o quilomícron artificial (QMA-AB), e in vivo, a tolerabilidade e eficácia terapêutica no tratamento da leishmaniose tegumentar em camundongos BALB/c. MÉTODOS: Para os testes in vitro, foi determinada a concentração inibitória (IC50) em formas promastigotas, a concentração citotóxica (CC50) em macrófagos sem infecção e a taxa de macrófagos infectados quando tratados com as formulações QMA, AB e QMA-AB. Já para os testes in vivo, camundongos BALB/c foram infectados com L. amazonensis e tratados com 2,5 mg/kg/dia de AB e 17,5 mg/kg/dia de QMA-AB e QMA. Durante o tratamento os animais foram monitorados semanalmente acerca do peso corporal e do diâmetro das patas. Ao término do tratamento os camundongos foram eutanasiados e amostras de sangue e tecido foram coletadas para análises bioquímicas, hematológicas, histopatológicas e quantificação da carga parasitária por método molecular qPCR. A análise estatística foi realizada com teste ANOVA seguido de Bonferroni ou Kruskal-Wallis com pós-teste de Dunn. As variáveis categóricas foram reportadas em tabelas de contingência (teste exato de Fisher). As análises foram consideradas estatisticamente significantes com p < 0,05. RESULTADOS: A formulação QMA-AB foi mais efetiva contra formas promastigotas apresentando IC50 em torno de 0,012 micro g/mL, enquanto que o IC50 de AB foi de 0,023 micro g/mL. AB foi mais tóxica para os macrófagos J744 com baixa concentração, 2,324 micro g/mL. QMA-AB foi menos tóxica para os macrófagos com CC50 de 8,106 micro g/mL, superior à AB, e apresentou alto índice de seletividade (IS=675,5). A formulação QMA-AB diminuiu a taxa de infecção em macrófagos, foi menos tóxica, mais eficaz no tratamento dos animais infectados e reduziu em torno de 60% o tamanho do diâmetro das lesões em relação à AB e 95% da carga parasitária. CONCLUSÕES: A associação QMA-AB apresentou-se como uma alternativa em potencial no tratamento da LT na busca de uma preparação de alta eficácia terapêutica, baixa toxicidade e baixo custo para o Sistema Único de Saúde / INTRODUCTION: American tegumentary leishmaniasis (ATL) is an infectious, non-contagious, vector-borne disease with heteroxenic cycle caused by parasites of the genus Leishmania. It is considered a polymorphic disease that affects skin and mucous membranes. Medications currently available for the treatment of the disease are unsatisfactory because of their limited effectiveness and side effects, and the high cost and resistance that protozoa accumulate against these drugs. Increased tolerability is critical to the overall success of treatment. The commercial lipid formulations of amphotericin B (AB), Ambisome®, Abelcet® and Amphocil®, presented as an advance in the treatment of (ATL). Lipid nanoemulsion systems reduce the toxicity of chemotherapeutics and, at the same time, increase their pharmacological action. Lipid emulsions with composition similar to chylomicrons have potential applicability for vectorization of AB. OBJECTIVE: This study evaluated the in vitro cytotoxicity of amphotericin B deoxycholate (AB) and its association with lipid nanoemulsion, artificial chylomicron (ACM), and in vivo, the tolerability and therapeutic efficacy in the treatment of cutaneous leishmaniasis in BALB/c. METHODS: For in vitro tests, the inhibitory concentration (IC50) in promastigote forms, the cytotoxic concentration (CC50) in non-infected macrophages and the rate of infected macrophages when treated with the ACM, AB and ACM-AB formulations were determined. For the in vivo tests, BALB/c mice were infected with L. amazonensis and treated with 2,5 mg/kg/day of AB and 17,5 mg/kg/day of ACM-AB and ACM. During the treatment the animals were monitored weekly about body weight and leg diameter. At the end of the treatment the mice were euthanized and blood and tissue samples were collected for biochemical, hematological, histopathological and quantitative analysis of the parasite load. Statistical analysis was performed using ANOVA followed by Bonferroni or Kruskal-Wallis with Dunn post-test. Categorical variables were reported in contingency tables (Fisher\'s exact test). The analyzes were considered statistically significant at p < 0.05. RESULTS: The ACM-AB formulation was more effective against promastigote forms exhibiting IC50 around 0,012 Micro g/mL, while the IC50 of AB was 0,023 Micro g/mL. AB was more toxic to J744 macrophages with low concentration, 2,324 Micro g/mL. ACM-AB was less toxic to macrophages with CC50 of 8,106 Micro g/mL, higher than AB, and presented a high selectivity index (IS = 675.5). The ACM-AB formulation decreased the rate of macrophages infected, was less toxic, more effective in the treatment of infected animals and reduced the size of the lesion diameter by about 60% in relation to AB and 95% of the parasite load. CONCLUSIONS: The ACM-AB association was presented as a potential alternative in the treatment of ATL in the search for a high therapeutic efficacy, low toxicity and low cost preparation for the Unified Health System

Introdução: O Câncer de próstata (CaP) é o tumor mais comum e a segunda causa de óbito por câncer no homem. O diagnóstico é feito pelo toque retal, nível sérico do antígeno prostático específico (PSA) e biópsia. A avaliação prognóstica é definida pelo PSA, estádio e escore de Gleason, porém, nenhum destes fatores clássicos, mesmo quando avaliados em conjunto, tem excelente performance na determinação prognóstica desta neoplasia. O CD44 é uma glicoproteína transmembrana envolvida em múltiplos processos celulares entre eles a adesão, migração, transmissão de sinal e apoptose. Tem como seu principal ligante o ácido hialurônico sendo assim um importante elemento na interação entre a célula e a matriz e por isso tem sido estudada como potencial marcador em várias neoplasias. Além da forma padrão (CD44s), apresenta ainda dez isoformas resultantes de splicing. São poucos os estudos de CD44 no CaP, principalmente relacionados a expressão de suas isoformas. Objetivo: Analisar e correlacionar a expressão de CD44s e de suas isoformas CD44v2, CD44v3, CD44v4, CD44v5, CD44v6, CD44v7, CD44v8, CD44v9 e CD44v10 no câncer localizado de próstata com os fatores prognósticos clássicos. Material e métodos: Analisamos retrospectivamente os espécimes cirúrgicos de 94 pacientes submetidos a prostatectomia radical (PR) entre outubro de 1997 e abril 2002. A expressão da forma standard, assim como das suas oito variantes resultado de splicing alternativo foi analisada através da reação em cadeia da polimerase quantitativa em tempo real (qRT-PCR). O grupo controle foi constituído pelos espécimes cirúrgicos de 14 pacientes com hiperplasia prostática benigna (HPB) submetidos a cirurgia aberta. Correlacionamos o perfil de expressão da forma padrão e suas variantes com escore de Gleason, estadiamento patológico, nível de PSA pré-operatório e recidiva bioquímica definida por níveis de PSA acima de 0,2ng/ml em seguimento médio de 53,3 meses. Resultados: Encontramos subexpressão de CD44s e superexpressão de todas as isoformas resultado de splicing alternativo no CaP localizado quando comparado a HPB. Observamos que a média de expressão da maioria das variantes foi maior nos pacientes que não recidivaram, porém apenas a maior expressão de CD44v2 esteve significativamente associada a menor chance de recidiva bioquímica (p=0,044). Conclusão: No CaP, existe uma alteração na expressão de CD44, com perda de CD44s e aumento de expressão de todas as suas variantes. No entanto, a recorrência tumoral mostrou-se significativamente associada a perda da expressão de CD44v2 / Introduction: Prostate cancer (PC) is the most common tumor and the second leading cause of cancer death in men. The diagnosis is made by rectal examination, serum prostate-specific antigen (PSA) and biopsy. The prognosis is defined by the PSA, tumor stage and Gleason escore, however, none of these classical factors, even when combined, have excellent accuracy in determining tumor behavior. The CD44 is a transmembrane glycoprotein related to many cell processes including adhesion, migration, signaling transduction and apoptosis, being considered a potential marker in many tumors. Besides the standard form (CD44s) there are ten isoforms resulted from alternative splicing. There is scarce data in the literature regarding the role of CD44 and its isoforms in PC prognosis. Objective: To analyze the expression of the CD44s and its isoforms CD44v2, CD44v3, CD44v4, CD44v5, CD44v6, CD44v7, CD44v8, CD44v9 and CD44v10 in in surgical specimens of localized PC correlating the expression profile with the classical prognostic factors and biochemical recurrence. Methods: We retrospectively analyzed the surgical specimens of 94 patients that underwent radical prostatectomy between October 1997 and April 2002. The standard form as well as its nine variants were analyzed by quantitative, real time polymerase chain reaction (qRT-PCR). The control group consisted of 14 specimens of patients with benign prostatic hyperplasia (BPH) submitted to open surgery. We correlated the expression of the variants with the Gleason escore, pathological stage, pre-operatory PSA and the occurrence of biochemical recurrence defined as PSA higher than 0.2 ng/ml in a mean follow up of 53.3 months. Results: CD44s was underexpressed, and all isoforms were overexpressed in PC when compared with BPH. However, the mean expression of most variants was higher in patients without recurrence, while a higher expression of CD44v2 correlated with higher recurrence free survival rate (p=0.044). Conclusion: In PC, there is a change in CD44 expression with a loss of CD44s and an overexpression of all of the CD44 variants. We also found that biochemical recurrence was significantly associated with loss of CD44v2 expression.

O cão (Canis familiaris) é o principal reservatório de Leishmania (Leishmania) infantum. Sua alta competência em transmitir o parasito para o inseto vetor contribui para a manutenção do ciclo e aumento do risco para os humanos em áreas endêmicas. O amplo espectro de manifestações clínicas da leishmaniose visceral canina (LVC) torna seu diagnóstico bastante complexo, já que essas manifestações podem se sobrepor àquelas causadas por outros agentes infecciosos. Fator agravante é que a infecção, na maior parte das vezes, tem caráter subclínico, podendo passar despercebida. Diante disto, um diagnóstico confiável se faz necessário para confirmar uma suspeita clínica ou infecção inaparente. A reação em cadeia da polimerase (PCR) tem contribuído em muito para o aumento da sensibilidade do diagnóstico, e seu uso mostra que a prevalência da infecção canina por L. (L.) infantum em áreas endêmicas pode ser bem maior do que a apontada pela sorologia. É sabido que um dos fatores limitantes do emprego de uma técnica diagnóstica em larga escala refere-se à coleta do material clínico que, idealmente, deve ser simples, rápida e indolor. Assim, entende-se que a associação da PCR com amostras não invasivas, de fácil coleta, poderia representar uma contribuição importante para o diagnóstico da LVC. Dessa forma, a proposta do presente projeto foi investigar o valor do swab oral (SO) na detecção de L. (L.) infantum em cães oriundos de áreas onde ocorre transmissão do parasito, através do uso da PCR em tempo real, considerada a mais sensível dentre as técnicas moleculares. Para tanto, comparamos sua positividade com a encontrada em outra amostra não invasiva (swab conjuntival= SC), pouco invasiva (sangue periférico= SG) e invasiva (aspirado de linfonodo=LN) e com a sorologia, considerando grupos clínicos, carga parasitária, índice de concordância entre os resultados, e a combinação dos resultados das diferentes amostras e a sorologia com aqueles obtidos no SO. Noventa e dois cães com comprovada infecção participaram do estudo. Os animais foram classificados em sintomáticos (n=63) e assintomáticos (n=29), de acordo com o exame físico e provas laboratoriais. No presente estudo a positividade do SO (67,4%) foi equivalente a do SC (68,5 %), maior do que a encontrada no SG (52,2%), e menor quando comparada ao LN (84,8%). Considerando os grupos clínicos, o SO foi positivo em 81 % dos cães sintomáticos e em 37,9 % dos assintomáticos. A positividade encontrada no SC também foi maior no grupo sintomático em relação ao assintomático (82,5 % x 37,9 %), assim como no LN (93,7 % x 65,5 %), mas não no SG (62,1 % x 47,6 %) e na sorologia (77,8 % x 79,3 %). Salienta-se que o SO foi positivo em 35 % dos cães com sorologia negativa (n=20), o SC em 35%, o SG em 40 %, o LN em 70 %, e OS+CS em 60% deles. A concordância dos resultados do SO foi moderada em relação à conjuntiva (k= 0,3) e fraca em relação às demais amostras e a sorologia (0.2 < k < 0.3). A carga parasitária do SO, por sua vez, não se diferiu da conjuntival, ambas foram maiores do que a encontrada no SG, e o LN apresentou a maior carga, mostrando uma clara correlação da intensidade do parasitismo com os índices de positividade obtidos. O LN mostrou o maior parasitismo entre as amostras analisadas. A combinação dos resultados do SO e SC atingiram 84 % de positividade nos 92 cães estudados, 92,1 % no grupo sintomático e 65,5 % no assintomático. Em suma, o presente estudo mostrou a presença do DNA de L. (L.) infantum no swab oral de cães infectados através da PCR em tempo real, revelando seu potencial uso no diagnóstico da LVC em cães com suspeita clínica dada a sua alta positividade nos animais com sintomatologia, equivalente à encontrada na amostra invasiva, o aspirado de linfonodo. Em oposição, encontrou-se baixa positividade nos cães assintomáticos, mas seu uso combinado com outra amostra não invasiva, a conjuntiva, atingiu patamares satisfatórios. O fato do SO ter sido positivo em parte dos animais soronegativos aponta vantagem adicional do seu uso na investigação de infecção por L. (L.) infantum em inquéritos epidemiológicos ou mesmo na rotina clínica. Por fim, os nossos resultados mostraram que a combinação de testes e amostras é necessária para a identificação de cães infectados por L. (L.) infantum, e que a PCR com o swab oral, especialmente associado ao swab conjuntival, pode contribuir de forma significativa para o diagnóstico da infecção canina, seja ela sintomática ou assintomática / Dog (Canis familiaris) is the major reservoir of Leishmania (L.) infantum. Its high competence for transmitting the parasite to the vector contributes to the maintenance of the cycle and for increasing risk to humans in endemic areas. The wide spectrum of clinical manifestations of canine visceral leishmaniasis (CVL) makes the diagnosis quite complex, since the symptoms can overlap those caused by other infectious agents. Of note, the infection is mostly subclinical, making the diagnosis even more difficult. Therefore, an accurate diagnosis is necessary to confirm a clinical suspicion or the silent infection. The polymerase chain reaction (PCR) has greatly contributed for increasing the diagnostic sensitivity, and its use shows that L. (L.) infantum canine infection in endemic areas may be much higher than that pointed by serology. It is known that one limiting factor of using a diagnostic method in large scale refers to the collection of clinical samples which should be ideally simple, quick, and painless. Thus, it is understood that the association of PCR with non-invasive samples could represent an important contribution to the diagnosis of CVL. Therefore, the purpose of this study was to investigate the value of the oral swab (OS) in detecting L. (L.) infantum in dogs from areas of parasite transmission through the use of real-time PCR that is considered the most sensitive among the molecular techniques. To this end, we compared the OS positivity with that found in other non-invasive (conjunctival swab = CS), minimally invasive (blood = BL) and invasive (lymph node aspirate = LN) samples and serology, considering clinical groups, parasite load, agreement among results, and the combination of results from different samples and serology with those obtained with OS. Ninety-two dogs with proven infection were selected for this present study. The animals were divided into symptomatic (n = 63) and asymptomatic (n = 29) dogs, according to the physical examination and laboratory tests. Here, the positivity in OS (67.4%) was equivalent to the CS (68.5%), higher than that found in BL (52.2%), and lower when compared to LN (84.8%). Regarding clinical groups, OS was positive in 81% of the symptomatic dogs and in 37.9% of asymptomatic ones. The positivity in CS was also higher in the symptomatic compared to the asymptomatic group (82.5% x 37.9%) and in LN (93.7% x 65.5%), but not in BL (62.1% x 47.6%) and serology (77.8% x 79.3%). Noteworthy, the OS was positive in 35% of dogs with negative serology (n = 20), CS in 35%, BL in 40% and LN in 70%. Moderate agreement was found between OS results and CS results (k = 0.3) and weak in comparison to other samples and serology (0.2 < k < 0.3). The parasite load was equivalent between OS and CS, both were higher than that found in BL, and LN presented the highest burden, showing that parasitism intensity and the positivity rates are correlated. The combination of OS and CS results reached 84% positivity in 92 dogs studied, 92.1% for symptomatic dogs and 65.5% for asymptomatic ones. In summary, the present study showed the presence of L. (L.) infantum DNA in oral swab of infected dogs by real-time PCR, revealing its potential use for diagnosing CVL in animals with clinical suspicion due to its high positivity in dogs with symptoms, equivalent to that found in invasive sample, the lymph node aspirate. In contrast, low positivity was found in asymptomatic dogs, but the combined use with other non-invasive sample, the conjunctiva, reached satisfactory levels. OS positivity found in part of the seronegative animals points additional advantage of using OS in the investigation of L. (L.) infantum infection in epidemiological surveys or in clinical practice. Finally, our findings pointed that combination of tests and samples is required for identifying dogs infected with L. (L.) infantum, and that the PCR with oral swab, especially associated with the conjunctival swab, can contribute for diagnosing both asymptomatic and symptomatic dogs

A elevada e crescente prevalência do carcinoma basocelular (CBC) na população caucasiana e o seu marcante predomínio entre os cânceres cutâneos não-melanoma despertam interesse para a elucidação dos mecanismos envolvidos no seu desenvolvimento. Os vários subtipos da neoplasia possuem características de interesse para um modelo de estudo, a fim de identificar os fatores determinantes dos diferentes padrões de crescimento. Objetivo: Neste estudo buscamos analisar, por meio da expressão de citocinas, linfócitos, VEGF e HLA-G, os possíveis mecanismos imunomoduladores envolvidos nos diferentes padrões de crescimento, subtipos e localizações topográficas do CBC. Métodos: Em 26 amostras de fragmentos dos subtipos nodular e superficial de CBC primários, foram analisadas a expressão de CD3, CD4, CD25, FOXP3, HLA-G e VEGF, por meio imunoistoquímica (IHQ), e de IL-4, IL-6, IL-8, IL-10, IL-17, IL-23, FOXP-3 e IFN-gama, por meio da reação em cadeia da polimerase em tempo real quantitativa (qPCR). Resultados: Na amostra (n=26), houve discreto predomínio de homens (54%), com idade variando entre 35 a 89 anos e média de 72,96 anos; 84,62% dos CBC eram localizados em área fotoexposta, 53,85% não-cefálicos (14/26) e 46,15% cefálicos (12/26). CBC nodulares apresentaram um infiltrado inflamatório mais evidente e concentrado ao redor dos blocos neoplásicos; CBC superficiais apresentaram um infiltrado inflamatório difuso por toda a derme, e discretamente mais intenso nas áreas adjacentes aos blocos tumorais. A expressão de todos os marcadores foi mais evidente no sítio perineoplásico (PN) comparado ao interior, das células neoplásicas (Cneo). Distintamente de outros marcadores, notou-se acentuada frequência da expressão de CD25+ e HLA-G nas Cneo. Nas Cneo dos CBCn, evidenciou-se elevada frequência de células marcadas em intensidade moderada para HLA-G (p=0,04) e em intensidade leve para FOXP3 (p = 0,037), quando comparados aos CBCs. A expressão de CD4+ no infiltrado PN foi mais frequente nos tumores não-cefálicos (p=0,02) comparados aos cefálicos. A expressão de citocinas IL-6 IL-8, IL-17 foi maior nos dois subtipos de CBC, nodular e superficial, comparada à da pele normal. CBC cefálicos apresentaram maior expressão de IL-4 (p=0,02), enquanto aqueles de localização não-cefálica expressaram mais IL-8 (p=0,002). Conclusão: A composição e a localização do infiltrado inflamatório corroboram a resposta imunológica mediada por células T CD3+ e CD4+ no CBC. A participação de linfócitos CD25+, FOXP3+ e do HLA-G caracteriza uma ação imunomoduladora, e a presença das interleucinas IL-8 e do perfil Th17, IL-6 e IL-17, podem favorecer a neovascularização e a supressão de células efetoras no microambiente do CBC propiciando o seu desenvolvimento e escape tumoral. / Introduction: The high and increasing prevalence of basal cell carcinoma (BCC) in the Caucasian population, and its striking predominance between non-melanoma skin cancers arouse interest for the elucidation of the mechanisms involved in its development. Its various subtypes have characteristics of interest for a study model in order to identify the determinants of different patterns of growth. Objective: This study aims to analyze the possible immunomodulatory mechanisms involved in the different growth patterns, and topographic locations subtypes of BCC through the expression of cytokines, lymphocytes, VEGF and HLA-G. Methods: In 26 fragments samples of primary BCC, subtypes nodular and superficial, we analyzed the expression of CD3, CD4, CD25, FOXP3, HLA-G and VEGF by immunohistochemistry (IHC) technique, and of cytokines IL-4, IL-6, IL-8, IL-10, IL-17, IL-23, FOXP-3 and IFN- by quantitative real time polymerase chain reaction (qPCR). Results: The sample (n = 26) had a slight predominance of men (54%), aged between 35-89 years, mean age 72.96 years; 84.62% of the BCC were located in sun-exposed area, 53.85% (14/26) non-cephalic and 46.15% (12/26) cephalic. Nodular BCC showed a more evident and concentrated inflammatory infiltrate around the tumor blocks; while superficial BCC showed a diffuse inflammatory infiltrate throughout the dermis, and slightly more intense in tumor blocks adjacent areas. The expression of all markers was evident at the perineoplastic (PN) sites compared to neoplastic cells (Cneo). Differently from other markers, we noticed strong frequency expression of CD25+ and HLA-G within the Cneo. In Cneo of BCCn, it became apparent high frequency of moderate HLA-G marked cells (p = 0.04) and at low intensity for FOXP3 (p = 0.037) when compared to BCCs. The expression in CD4+ infiltrate was more frequent in PN non-cephalic tumors (p = 0.02) compared with cephalic. The expression of IL-6 IL-8, IL-17 was higher in both subtypes of BCC, nodular and superficial, compared to normal skin. Cephalic BCC showed higher expression of IL-4 (p=0,02) while those from non-cephalic location expressed more IL-8 (p=0,002). Conclusion: The composition and location of the inflammatory infiltrate corroborate the immune response mediated by CD3+ and CD4+ T cells on the BCC. The involvement of HLA-G, CD25+ and FOXP3 lymphocytes features an immunomodulary action, and the presence of interleukin IL-8 and Th17 profile (IL-6 and IL-17) may promote neovascularization and suppression of effector cells in the BCC microenvironment providing its development and tumor escape.

Introdução: Os sarcomas uterinos constituem uma forma rara de neoplasia maligna que compreende cerca de 3% de todos os canceres uterinos. Os fatores de risco são pouco conhecidos e as formas de tratamento escassas, sendo o papel da quimioterapia e radioterapia limitado. Nesse contexto, torna-se importante a compreensão dos mecanismos moleculares envolvidos no processo de carcinogênese, tanto para diagnóstico e prognóstico mais precisos, quanto para ampliar os avanços terapêuticos. Um dos mecanismos moleculares envolvidos no desenvolvimento de canceres é a regulação da expressão gênica por microRNAs (miRNAs), que são pequenas moléculas de RNAs não-codificantes que desempenham papéis importantes em várias vias biológicas. Alterações na expressão de miRNAs podem acarretar em diversas doenças incluindo o câncer. Poucos trabalhos foram realizados, até o momento, no sentido de esclarecer a regulação ou expressão de miRNAs nos sarcomas uterinos. Objetivo: Avaliar a expressão de miRNAs relacionados ao desenvolvimento de tumores em amostras de carcinossarcomas e sarcomas do útero. Métodos: Foram selecionadas 100 amostras incluindo: 56 leiomiossarcomas (LMS), 24 carcinossarcomas (CS), 18 sarcomas do estroma endometrial (SEE) e 2 adenossarcomas (AS). O RNA total de amostras incluídas em parafina foi obtido e utilizado para realização da síntese de cDNA. As reações de PCR em Tempo Real foram realizadas utilizando o Kit miScript SYBR Green PCR (Qiagen) para análise a partir de 84 sequências de miRNAs já descritos na literatura para outros tipos de cânceres. Foram analisados dados clínicos como idade, sintomas principais, uso de contraceptivo oral, estado menopausal, terapia de reposição hormonal, tabagismo, tratamento cirúrgico, tratamento adjuvante, metástase, grau histológico, recorrência, óbito e estadiamento. Os resultados foram tabulados nos softwares SPSS e GraphPad Prism 5.01. Resultados: Observamos miRNAs que apresentaram diferentes perfis de expressão nos tumores, em comparação com o tecido referência (miométrio). Dentre 42 miRNAs que apresentaram diferenças de expressão nos sarcomas e carcinossarcomas uterinos, 6 destacaram-se por apresentar diferenças significativas entre os tipos histológicos: miR-96-5p (p < 0,001; LMSxCS), miR-205-5p (p=0,016; CSxSEE), miR-181a-5p (p=0,010; CSxLMS), miR-135b-5p (p=0,018; CSxLMS), miR-183-5p (p=0,012; CSxLMS) e miR-193b-3p (p=0,008; CSxLMS). Diversas associações entre a hiper ou hipoexpressão dos miRNAs com as variáveis clínicas coletadas foram constatadas. A expressão de 12 miRNAs foram associadas com sobrevida global e 3 com sobrevida câncer específica. Maior expressão de miR-335-5p, miR-301a-3p e miR-210-3p foi encontrada em amostras de pacientes que realizaram tratamento adjuvante e desenvolveram metástase ou recidiva, para as quais observamos a expressão de miR-138-5p, miR-146b-5p e miR-218-5p associada com maior sobrevida livre de doença. Conclusão: Em conjunto, os resultados sugerem que a caracterização dos miRNAs possui papel promissor para fins diagnóstico, prognóstico e até terapêuticos nos sarcomas e carcinossarcomas uterinos / Introduction: The uterine sarcomas are a rare form of malignancy comprising about 3% of all uterine cancers. Risk factors are not well known and the treatment forms are scarce, being the role of chemotherapy and radiotherapy limited. In this context, it becomes important the comprehension of the molecular mechanisms involved in the carcinogenesis process, as for more accurate diagnosis and prognosis, as to broaden the therapeutic advances. One of the molecular mechanisms involved in cancer development is the regulation of gene expression by microRNAs (miRNAs), which are small molecules of non-coding RNAs that play important roles in some biological pathways. Alterations in miRNA expression could result in some diseases, including cancer. Few studies were performed until present time, to clarify the miRNAs regulation or expression in uterine sarcomas. Objective: To evaluate the expression of miRNAs related to development of tumors in carcinosarcoma and uterine sarcomas samples. Methods: 100 samples were evaluated including: 56 leiomyosarcomas (LMS), 24 carcinosarcomas (CS), 18 endometrial stromal sarcomas (ESS) and 2 adenosarcomas (AS). The total RNA from paraffin-embedded samples were obtained and used to cDNA synthesis. The real time PCR reactions, was performed using the miScript SYBR Green PCR Kit (Qiagen) for analysis of 84 sequences already described in literature in other types of cancer. Were analyzed clinical data such as age, main symptoms, oral contraceptive use, menopausal status, hormone replacement therapy, smoking, underlying pathology, surgical treatment, adjuvant treatment, metastasis, histological grade, recurrence, death and staging. The results were tabulated in the SPPS and Graphpad Prism 5.01. Results: We observed miRNAs that showed different expression profiles in tumors compared to the reference tissue (myometrium). Among 42 miRNAs that showed different expression in uterine sarcomas and carcinosarcomas, 6 stood out for showing significant differences among the histological types: miR-96-5p (p < 0,001; LMSxCS), miR-205-5p (p=0,016; CSxSEE), miR-181a-5p (p=0,010; CSxLMS), miR-135b-5p (p=0,018; CSxLMS), miR-183-5p (p=0,012; CSxLMS) e miR-193b-3p (p=0,008; CSxLMS). Many associations between overexpression or hypoexpression of miRNAs with the clinical variables collected were found. The expression of 12 miRNAs were associated with cancer-specific survival and 3 with disease-free survival. It were also found, increased expression of miR-335-5p, miR-301a-3p and miR-210-3p in samples of patients who underwent adjuvant treatment and developed metastasis or recurrence, and correlation analysis showed that the expression of miR-138-5p, miR-146b-5p and miR-218- 5p are associated with higher disease-free survival of treated patients. Conclusion: The results suggest that the characterization of miRNAs have a promising role for purposes of diagnosis, prognosis and therapeutic for the uterine sarcomas and carcinosarcomas

Leiomioma (LMU) e leiomiossarcoma (LMSU) são tumores mesenquimais que se desenvolvem no útero e apresentam comportamento clínico variável. Ambos são neoplasias do miométrio (MM), com mesmo padrão de diferenciação celular, porém com progressão clínica completamente diferente. Até o momento, existe grande controvérsia quanto aos fatores relacionados ao surgimento dessas neoplasias e uma possível malignização de um leiomioma pré-existente. Foi demonstrado que a ativação da via de sinalização do Sonic hedgehog (SHH) está relacionada ao desenvolvimento de diversos tipos de tumor, uma vez que a mesma desempenha importante papel na proliferação e diferenciação celular. O objetivo desse trabalho foi avaliar o padrão de expressão transcricional e protéica de moléculas envolvidas na via do SHH em LMU e LMSU. Foram avaliados a expressão de 106 genes, por PCR em tempo real, e de sete proteínas (SHH, PTCH 1, SMO, SUFU GLI 1-3 e HHIP 1), por imunoistoquímica, em 176 amostras (20 MM, 103 LMU - incluindo 16 leiomiomas não convencionais/LMA e 37 LMSU). Os resultados mostraram que a expressão gênica e protéica foram similares nas amostras de LMAU e LMSU. A expressão de AXIN 2, FZD 2, CCND 1, FZD 6, ESR 1 e IFT 52 foi associada com a sobrevida livre de doença; FZD3, FZD 8 e WISP1 com sobrevida cancer específica nas pacientes com LMSU. As proteínas SMO, SUFU, GLI 1 e GLI 3 não foram expressas nas amostras de MM. SHH e SUFU mostraram correlação com sobrevida livre de doença nas pacientes com LMSU. De modogeral, o perfil de expressão das proteínas (exceto HHIP 1 e GLI 2), foi crescente entre as amostras de MM, LMU, LMAU e LMSU. Esse dado corrobora a hipótese de malignização dos leiomiomas. Adicionalmente, algumas das proteínas avaliadas têm sido alvos terapêuticos em pacientes com câncer. Assim, no futuro, novos tratamentos podem ser propostos para as mulheres com esse tipo de neoplasias / Leiomyoma (LMU) and leiomyosarcoma (LMSU) are uterine mesenchymal tumors with variable clinical behavior. Both are myometrial (MM) neoplasms that show the same pattern of cell differentiation, but with completely different clinical progression. To date, there are controversies about these neoplasias devolopement-related factors and a possible malignant transformation of a pre-existing leiomyoma. It was demonstrated that activation of the Sonic Hedgehog (SHH) signaling pathway is related to the development of several tumors, due to its activity in the cell proliferation and differentiation. The aim of this study was to evaluate the transcriptional and protein expression profile of the SHH pathway molecules in LMU and LMSU. It was evaluated 106 genes, by quantitative real time PCR, and seven proteins (SHH, PTCH 1, SMO, SUFU, GLI 1-3 and HHIP 1), by immunohistochemistry, in 176 samples (20 MM, 103 LMU - including 16 unconventional leiomyoma /LMAU and 37 LMSU). The results show that the gene and protein expression were similar for LMAU and LMSU samples. The gene expression of AXIN 2, FZD 2, CCND 1, FZD 6, ESR 1 and IFT 52 was associated with disease free survival; and FZD3, FZD 8 and WISP1 with cancer specific survival in patient with LMSU. No SMO, SUFU, GLI 1 and GLI 3 protein expression was observed in the MM samples. SHH and SUFU proteins were correlated with disease-free survival in patients with LMS. LMU, LMAU and LMSU samples displayed increased expression of all SHH proteins (except HHIP 1 and GLI 2). These data corroborate with the leiomyoma malignant transformation hypothesis. Moreover, some proteins evaluated have been used as therapeutic target for cancer patients. In the near future, new treatment strategies might be proposed for women with these neoplasias

Introdução: Os sarcomas uterinos constituem uma forma rara de neoplasia maligna que compreende cerca de 3% de todos os canceres uterinos. Os fatores de risco são pouco conhecidos e as formas de tratamento escassas, sendo o papel da quimioterapia e radioterapia limitado. Nesse contexto, torna-se importante a compreensão dos mecanismos moleculares envolvidos no processo de carcinogênese, tanto para diagnóstico e prognóstico mais precisos, quanto para ampliar os avanços terapêuticos. Um dos mecanismos moleculares envolvidos no desenvolvimento de canceres é a regulação da expressão gênica por microRNAs (miRNAs), que são pequenas moléculas de RNAs não-codificantes que desempenham papéis importantes em várias vias biológicas. Alterações na expressão de miRNAs podem acarretar em diversas doenças incluindo o câncer. Poucos trabalhos foram realizados, até o momento, no sentido de esclarecer a regulação ou expressão de miRNAs nos sarcomas uterinos. Objetivo: Avaliar a expressão de miRNAs relacionados ao desenvolvimento de tumores em amostras de carcinossarcomas e sarcomas do útero. Métodos: Foram selecionadas 100 amostras incluindo: 56 leiomiossarcomas (LMS), 24 carcinossarcomas (CS), 18 sarcomas do estroma endometrial (SEE) e 2 adenossarcomas (AS). O RNA total de amostras incluídas em parafina foi obtido e utilizado para realização da síntese de cDNA. As reações de PCR em Tempo Real foram realizadas utilizando o Kit miScript SYBR Green PCR (Qiagen) para análise a partir de 84 sequências de miRNAs já descritos na literatura para outros tipos de cânceres. Foram analisados dados clínicos como idade, sintomas principais, uso de contraceptivo oral, estado menopausal, terapia de reposição hormonal, tabagismo, tratamento cirúrgico, tratamento adjuvante, metástase, grau histológico, recorrência, óbito e estadiamento. Os resultados foram tabulados nos softwares SPSS e GraphPad Prism 5.01. Resultados: Observamos miRNAs que apresentaram diferentes perfis de expressão nos tumores, em comparação com o tecido referência (miométrio). Dentre 42 miRNAs que apresentaram diferenças de expressão nos sarcomas e carcinossarcomas uterinos, 6 destacaram-se por apresentar diferenças significativas entre os tipos histológicos: miR-96-5p (p < 0,001; LMSxCS), miR-205-5p (p=0,016; CSxSEE), miR-181a-5p (p=0,010; CSxLMS), miR-135b-5p (p=0,018; CSxLMS), miR-183-5p (p=0,012; CSxLMS) e miR-193b-3p (p=0,008; CSxLMS). Diversas associações entre a hiper ou hipoexpressão dos miRNAs com as variáveis clínicas coletadas foram constatadas. A expressão de 12 miRNAs foram associadas com sobrevida global e 3 com sobrevida câncer específica. Maior expressão de miR-335-5p, miR-301a-3p e miR-210-3p foi encontrada em amostras de pacientes que realizaram tratamento adjuvante e desenvolveram metástase ou recidiva, para as quais observamos a expressão de miR-138-5p, miR-146b-5p e miR-218-5p associada com maior sobrevida livre de doença. Conclusão: Em conjunto, os resultados sugerem que a caracterização dos miRNAs possui papel promissor para fins diagnóstico, prognóstico e até terapêuticos nos sarcomas e carcinossarcomas uterinos / Introduction: The uterine sarcomas are a rare form of malignancy comprising about 3% of all uterine cancers. Risk factors are not well known and the treatment forms are scarce, being the role of chemotherapy and radiotherapy limited. In this context, it becomes important the comprehension of the molecular mechanisms involved in the carcinogenesis process, as for more accurate diagnosis and prognosis, as to broaden the therapeutic advances. One of the molecular mechanisms involved in cancer development is the regulation of gene expression by microRNAs (miRNAs), which are small molecules of non-coding RNAs that play important roles in some biological pathways. Alterations in miRNA expression could result in some diseases, including cancer. Few studies were performed until present time, to clarify the miRNAs regulation or expression in uterine sarcomas. Objective: To evaluate the expression of miRNAs related to development of tumors in carcinosarcoma and uterine sarcomas samples. Methods: 100 samples were evaluated including: 56 leiomyosarcomas (LMS), 24 carcinosarcomas (CS), 18 endometrial stromal sarcomas (ESS) and 2 adenosarcomas (AS). The total RNA from paraffin-embedded samples were obtained and used to cDNA synthesis. The real time PCR reactions, was performed using the miScript SYBR Green PCR Kit (Qiagen) for analysis of 84 sequences already described in literature in other types of cancer. Were analyzed clinical data such as age, main symptoms, oral contraceptive use, menopausal status, hormone replacement therapy, smoking, underlying pathology, surgical treatment, adjuvant treatment, metastasis, histological grade, recurrence, death and staging. The results were tabulated in the SPPS and Graphpad Prism 5.01. Results: We observed miRNAs that showed different expression profiles in tumors compared to the reference tissue (myometrium). Among 42 miRNAs that showed different expression in uterine sarcomas and carcinosarcomas, 6 stood out for showing significant differences among the histological types: miR-96-5p (p < 0,001; LMSxCS), miR-205-5p (p=0,016; CSxSEE), miR-181a-5p (p=0,010; CSxLMS), miR-135b-5p (p=0,018; CSxLMS), miR-183-5p (p=0,012; CSxLMS) e miR-193b-3p (p=0,008; CSxLMS). Many associations between overexpression or hypoexpression of miRNAs with the clinical variables collected were found. The expression of 12 miRNAs were associated with cancer-specific survival and 3 with disease-free survival. It were also found, increased expression of miR-335-5p, miR-301a-3p and miR-210-3p in samples of patients who underwent adjuvant treatment and developed metastasis or recurrence, and correlation analysis showed that the expression of miR-138-5p, miR-146b-5p and miR-218- 5p are associated with higher disease-free survival of treated patients. Conclusion: The results suggest that the characterization of miRNAs have a promising role for purposes of diagnosis, prognosis and therapeutic for the uterine sarcomas and carcinosarcomas

Leiomioma (LMU) e leiomiossarcoma (LMSU) são tumores mesenquimais que se desenvolvem no útero e apresentam comportamento clínico variável. Ambos são neoplasias do miométrio (MM), com mesmo padrão de diferenciação celular, porém com progressão clínica completamente diferente. Até o momento, existe grande controvérsia quanto aos fatores relacionados ao surgimento dessas neoplasias e uma possível malignização de um leiomioma pré-existente. Foi demonstrado que a ativação da via de sinalização do Sonic hedgehog (SHH) está relacionada ao desenvolvimento de diversos tipos de tumor, uma vez que a mesma desempenha importante papel na proliferação e diferenciação celular. O objetivo desse trabalho foi avaliar o padrão de expressão transcricional e protéica de moléculas envolvidas na via do SHH em LMU e LMSU. Foram avaliados a expressão de 106 genes, por PCR em tempo real, e de sete proteínas (SHH, PTCH 1, SMO, SUFU GLI 1-3 e HHIP 1), por imunoistoquímica, em 176 amostras (20 MM, 103 LMU - incluindo 16 leiomiomas não convencionais/LMA e 37 LMSU). Os resultados mostraram que a expressão gênica e protéica foram similares nas amostras de LMAU e LMSU. A expressão de AXIN 2, FZD 2, CCND 1, FZD 6, ESR 1 e IFT 52 foi associada com a sobrevida livre de doença; FZD3, FZD 8 e WISP1 com sobrevida cancer específica nas pacientes com LMSU. As proteínas SMO, SUFU, GLI 1 e GLI 3 não foram expressas nas amostras de MM. SHH e SUFU mostraram correlação com sobrevida livre de doença nas pacientes com LMSU. De modogeral, o perfil de expressão das proteínas (exceto HHIP 1 e GLI 2), foi crescente entre as amostras de MM, LMU, LMAU e LMSU. Esse dado corrobora a hipótese de malignização dos leiomiomas. Adicionalmente, algumas das proteínas avaliadas têm sido alvos terapêuticos em pacientes com câncer. Assim, no futuro, novos tratamentos podem ser propostos para as mulheres com esse tipo de neoplasias / Leiomyoma (LMU) and leiomyosarcoma (LMSU) are uterine mesenchymal tumors with variable clinical behavior. Both are myometrial (MM) neoplasms that show the same pattern of cell differentiation, but with completely different clinical progression. To date, there are controversies about these neoplasias devolopement-related factors and a possible malignant transformation of a pre-existing leiomyoma. It was demonstrated that activation of the Sonic Hedgehog (SHH) signaling pathway is related to the development of several tumors, due to its activity in the cell proliferation and differentiation. The aim of this study was to evaluate the transcriptional and protein expression profile of the SHH pathway molecules in LMU and LMSU. It was evaluated 106 genes, by quantitative real time PCR, and seven proteins (SHH, PTCH 1, SMO, SUFU, GLI 1-3 and HHIP 1), by immunohistochemistry, in 176 samples (20 MM, 103 LMU - including 16 unconventional leiomyoma /LMAU and 37 LMSU). The results show that the gene and protein expression were similar for LMAU and LMSU samples. The gene expression of AXIN 2, FZD 2, CCND 1, FZD 6, ESR 1 and IFT 52 was associated with disease free survival; and FZD3, FZD 8 and WISP1 with cancer specific survival in patient with LMSU. No SMO, SUFU, GLI 1 and GLI 3 protein expression was observed in the MM samples. SHH and SUFU proteins were correlated with disease-free survival in patients with LMS. LMU, LMAU and LMSU samples displayed increased expression of all SHH proteins (except HHIP 1 and GLI 2). These data corroborate with the leiomyoma malignant transformation hypothesis. Moreover, some proteins evaluated have been used as therapeutic target for cancer patients. In the near future, new treatment strategies might be proposed for women with these neoplasias

Orientador: Luiz Claudio Nogueira Mendes / Coorientador: Sergio Moraes Aoki / Banca: Flavia Lombardi Lopes / Banca:Gisele Zoccal Mingotti / Banca:Maria denise Lopes / Banca: Eduardo Harry Birgel Junior / Resumo: Novas metodologias para a sexagem de sêmen são buscadas devido à citometria de fluxo apresentar limitações e desvantagens e os aptâmeros surgem como potenciais candidatos para a identificação de espermatozoides conforme a presença do cromossomo X ou Y. Os objetivos foram avaliar o uso de três aptâmeros desenvolvidos para se ligarem especificamente ao espermatozoide Y na separação magnética por sexo de espermatozoides de touro, e desenvolver uma técnica de qPCR que permita realizar facilmente o diagnóstico da proporção sexual em amostras de sêmen. Protocolos de separação por magnetismo utilizando aptâmeros biotinilados foram utilizados em sêmen comercial, e duas frações de espermatozoides foram obtidas para cada aptâmero testado (livre e retida). A proporção relativa de espermatozoides Y foi analisada em reações de qPCR desenvolvidas para este objetivo. A curva padrão utilizada na qPCR foi eficiente para a quantificação da proporção sexual relativa em amostras de sêmen convencional e sexado. Diferença significativa da proporção relativa de Y foi encontrada na fração de espermatozoides livres do aptâmero C12 em relação ao controle (47,7% vs. 51,3%, respectivamente; P = 0,009); as demais separações não apresentaram diferença significativa. Os aptâmeros selecionados não produziram o efeito desejado de separação do sêmen conforme a presença do cromossomo X ou Y, nestas condições utilizadas, mas a diminuição da proporção relativa de Y em uma das frações não retidas indica ser possí... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Sex preselection of livestock offspring represents a big potential for genetic improvement. There are a search for new methods to sex-sort bull semen in order to avoid the limitations of flow cytometry/cell sorting technique. Aptamers emerge as potential candidates for sperm identification relative the presence of chromosome X or Y. In this work, the objectives were 1, to evaluate three aptamers developed to specifically binding to the Y-bearing sperm in magnetic separation by sex of bovine sperm and 2, to develop a SYBR Green Real-Time PCR method to determinate sex ratio in bovine semen in semen samples. Separation protocols by magnetism using biotinylated aptamers were used in commercial semen, and two fractions of sperm were obtained for each tested aptamer (free and trapped). The relative ratio of Y-bearing spermatozoa was analyzed in qPCR reactions developed for this purpose. The standard curve for qPCR was efficiently designed to quantify the sex relative ratio of sorted and unsorted semen samples. Significant difference in the relative proportion of Y-bearing sperm was found in the fraction of free sperm samples from aptamer C12 compared to the control samples (47.7% vs. 51.3%, respectively; P = 0.009); other separations showed no significant difference. Selected aptamers did not produce the wanted effect of sperm separation by the presence of chromosome X or Y, in these conditions used, but decreased relative proportion of Y-bearing sperm in one of the free fractions ... (Complete abstract click electronic access below) / Doutor