Orientador: Marcos Silveira Buckeridge / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-15T21:23:11Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Brandao_AndreaDias_D.pdf: 9019715 bytes, checksum: 89d92b9413ee5bda07f54d0245d9d040 (MD5) Previous issue date: 2010 / Resumo: A cana-de-açúcar pertence a família Poaceae e ao gênero Saccharum. Espécies pertencentes a essa família apresentam a via de fotossíntese C4, mais eficiente para a produção de biomassa quando comparadas com as plantas com metabolismo fotossintético C3 em condições de temperaturas elevadas. A cana-de-açúcar transformou-se em um importante potencial econômico e fonte de energia no mundo, devido a sua capacidade de estocar sacarose (cerca de 50% de seu peso seco) e produzir bioetanol. Nos últimos anos tornou-se alvo prioritário para diversos estudos através do melhoramento genético, biologia molecular, bioquímica e estudos fisiológicos. Os produtos provenientes da cana são amplamente utilizados pela população mundial e representam uma fonte alternativa para a geração de energia. O Brasil ocupa uma posição de destaque entre os países produtores de cana-de-açúcar (34% da produção mundial). Devido a sua origem interespecífica a cana possui um dos genomas mais complexos entre as espécies vegetais tornando-se um importante objeto de estudo para a obtenção de variedades produtivas e ou eficientes, melhor adaptadas às condições climáticas. A propagação clonal através do cultivo in vitro possibilita a obtenção mais rápida de indivíduos da espécie. A utilização de métodos de assepsia para a desinfestação e desinfecção sem causar danos aos tecidos que levam a morte da planta tornou-se um grande desafio para a obtenção de novas plântulas que permitam os estudos de biotecnologia. E o grande interesse em se estudar plantas de cana-de-açúcar se dá pelo acúmulo da sacarose, que ocorre na região do entrenó durante o desenvolvimento da planta. A genética clássica busca a melhora dessa característica, principalmente através do aumento da biomassa realizada pela fixação de carbono, no entanto, há um limitado aumento do conteúdo de sacarose. A giberelina é um fitormônio vegetal, largamente utilizada na agricultura e desempenha uma variedade de funções fisiológicas em plantas. O GA3 produzido industrialmente tem sido aplicado para estimular o crescimento da cana-de-açúcar, para auxiliar a germinação de cevada, na produção de frutas e verduras, entre outras. As giberelinas são extremamente ativas na indução do alongamento do caule. Estudos mostram que a aplicação de GAs provoca aumento no tamanho da célula e no número de células, indicando que as GAs atuam tanto no alongamento da célula como na divisão celular, o que potencializa um aumento na produtividade de sacarose. Já o paclobutrazol (PBZ) atua inibindo a biossíntese de giberelinas. Ele bloqueia a biossíntese de GA, pois interfere nos primeiros passos da rota de oxidação do caureno, impedindo a formação das GAs, e por isso funciona como um controle negativo dos mecanismos de ação das giberelinas. Tanto a presença do paclobutrazol quanto da GA3 induzem alterações da expressão de genes específicos e a ativação de vias de sinalização que agem cooperativamente na tentativa de aliviar o efeito do estresse na tentativa de estabelecer o retorno à homeostasia celular. Nosso maior objetivo nesse estudo é tentar identificar o mecanismo de ação das GAs, para permitir uma melhor compreensão das alterações tanto morfológicas e fisiológicas sofrida pelas plântulas. Para isso em nossos estudos foram selecionados genes que pudessem apresentar relação com metabolismo de carboidratos, com respostas hormonais, com metabolismo de ácidos nucleícos, com a fotossíntese, com o desenvolvimento, com divisão celular, com metabolismo de proteínas, além de diversos fatores de transcrição que possam estar envolvidos nesses processos, baseados em resultados do metabolismo de carboidratos encontrados nas analises bioquímicas das plântulas, assim como nos cortes anatômicos. O resultados mostraram interferência do GA3 no acúmulo de carboidratos, no alongamento celular, em genes relacionados com a via de transdução de sinal das AUX, biossíntese de AUX, GA, além de genes e fatores de transcrição relacionados com o ciclo celular, fotossíntese, fixação de carbono e diversos estresses, entre eles o osmótico. / Abstract: The sugarcane belongs to the grasses's family and the Saccharum genus. Species belonging to this family have the C4 photosynthesis patway, more efficient for biomass production when compared the C3 photosynthetic metabolism plants, in high temperature condicions. The sugarcane became an important economic potential and energy in the world due to its ability to store sucrose (about 50% of its dry weight) and production of bioethanol. In recent years it has become priority for several studies through breeding, molecular biology, biochemistry and physiological studies. Products from sugarcane is widely used by the world's population and represent an alternative source for energy generation. Brazil occupies an outstanding position among the countries producing sugarcane (34% of world production). Because of its interspecific origin, the sugarcane has one of the more complex genomes of plant species became an important object of study for plant breeding and productive or efficient, better adapted to climatic conditions. The clonal propagation through in vitro possible to obtain faster plants copies. The use of aseptic methods for disinfestation and disinfection without causing tissue damage leading to death of the plant has become a major challenge for the procurement of new seedlings to allow the biotechnology study. And the great interest in studying sugarcane plant is caused by the accumulation of sucrose, which occurs in the internode region during the plant development. Classical genetics search to improve this feature, mainly by increasing the biomass held by sequestration, however, there is a limited increase in sucrose content. The gibberellin is a plant phytohormone widely used in the agriculture and plays a variety of physiological functions in the plants. The sintetic GA3 has been applied to stimulate the sugarcane growth, to assist the germination of barley, the production of fruits and vegetables, among others. The gibberellins are extremely active in inducing the elongation of the stem. Studies show that the application of GAs causes an increase in cell size and cell number, indicating that GAs act both in cell elongation and cell division, which leverage an increase in sucrose yield. Since the PBZ acts by inhibiting the biosynthesis of gibberellins. It blocks the biosynthesis of GA, because it interferes in the first steps of the kaurene oxidation patway, preventing the GAs formation, and therefore acts as a negative control mechanisms of action of gibberellins. Both the presence of paclobutrazol and the GA3 induced changes in gene expression and activation of specific signaling pathways that act cooperatively in trying to alleviate the effect of stress in trying to establish a return to cellular homeostasis. Our objectivity in this study is to try to identify the mechanism of action of GAs to allow a understanding of both morphological and physiological changes experienced by seedlings. To do this in our studies we selected genes that could present relationship with carbohydrate metabolism, hormonal responses, with the metabolism of nucleic acids, through photosynthesis, with the development, with cell division, with protein metabolism, and several transcription factors that may be involved in these processes, based on results of the metabolism of carbohydrates found in the biochemical analysis of the seedlings, as well as in anatomical cuts. The results showed interference of GA3 in the accumulation of carbohydrates in cell elongation in genes related to the route of signal transduction of AUX, AUX biosynthesis, GA, in addition to genes and transcription factors related to cell cycle, photosynthesis, fixing carbon and many stresses, including the osmotic. / Doutorado / Biologia Vegetal / Doutor em Biologia Vegetal

Submitted by Geyciane Santos (geyciane_thamires@hotmail.com) on 2015-10-26T15:08:48Z No. of bitstreams: 1 Dissertação- Fernanda Borowsky da Rosa.pdf: 3044966 bytes, checksum: aae1ab17f7f5348815c8e9c92a04803d (MD5) / Approved for entry into archive by Divisão de Documentação/BC Biblioteca Central (ddbc@ufam.edu.br) on 2015-10-26T18:02:55Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Dissertação- Fernanda Borowsky da Rosa.pdf: 3044966 bytes, checksum: aae1ab17f7f5348815c8e9c92a04803d (MD5) / Approved for entry into archive by Divisão de Documentação/BC Biblioteca Central (ddbc@ufam.edu.br) on 2015-10-26T18:05:02Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Dissertação- Fernanda Borowsky da Rosa.pdf: 3044966 bytes, checksum: aae1ab17f7f5348815c8e9c92a04803d (MD5) / Approved for entry into archive by Divisão de Documentação/BC Biblioteca Central (ddbc@ufam.edu.br) on 2015-10-26T18:33:03Z (GMT) No. of bitstreams: 1 Dissertação- Fernanda Borowsky da Rosa.pdf: 3044966 bytes, checksum: aae1ab17f7f5348815c8e9c92a04803d (MD5) / Made available in DSpace on 2015-10-26T18:33:03Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dissertação- Fernanda Borowsky da Rosa.pdf: 3044966 bytes, checksum: aae1ab17f7f5348815c8e9c92a04803d (MD5) Previous issue date: 2011-03-03 / FAPEAM - Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do Amazonas / Leprosy is a chronic infectious disease caused by Mycobacterium leprae, which affects mainly the skin, peripheral nerves and mucous membranes. It is known that the Hansen bacillus has a predilection for Schwann cells that surround the axons of peripheral nerves, causing sensory loss as the location of the affected nerve. Among the most affected cranial nerves in subjects with leprosy are the trigeminal nerve, responsible for motor function of the masticatory muscles and the tactile, thermal and pain of the face, mucosa of the nasopharynx, hard and soft palate, as well as the 2 / 3 previous tongue, and facial nerve, which is responsible for the taste sensitivity of the anterior 2 / 3 of the tongue and movement of the facial muscles. In the present study, we investigated sensorimotor disorders in the oral cavity and oropharynx as well as the presence of Mycobacterium leprae in saliva from patients with leprosy attending in a Reference Center of Tropical Dermatology in Amazonas State from July to October 2010. We conducted a cross sectional study of case detection, with 45 subjects with leprosy and 45 subjects with other skin diseases as a control group. Subjects with leprosy were submitted to anamnesis, evaluation of the sensitivity of the oral cavity and oropharynx, ENT examination (clinical examination, nasal endoscopy and laryngoscopy), videofluoroscopy, and, molecular procedures – Real Time Polymerase Chain Reaction (qPCR) - and bacteriological to investigate the presence of DNA of M. leprae in saliva. The control group subjects were assessmented of oral sensitivity. The results were analyzed using descriptive and non-parametric statistics, noting that 15/45 (33.3%) of subjects with leprosy showed abnormalities in the oral sensitivity, and this data is statistically significant (p=0,002)when compared with the control group. In search of M leprae DNA in saliva, using the technique of Real-Time PCR, we detected 16 (35.5%) tested positive results of 45 subjects with leprosy. No direct relationship was observed between the presence of M. leprae in saliva and oral changes in sensitivity, but the positivity of the Real Time PCR in saliva (PCR in saliva) in six (31.6%) of 19 paucibacillary (PB) patients suggests the possibility of a new site of sample collection. The sum of the techniques for diagnosis (Slit-skin smear, PCR in saliva and PCR Slit-skin smear) increases the positive results to 55.55%. This is particulary important in difficult diagnosis cases, like paucibacillary patients. / A hanseníase é uma doença infecciosa crônica, causada pelo Mycobacterium leprae, que afeta principalmente a pele, nervos periféricos e membranas mucosas. Sabe-se que o bacilo de Hansen tem predileção pelas células de Schwann que envolvem os axônios dos nervos periféricos, causando perdas sensoriais conforme a localização do nervo afetado. Dentre os nervos cranianos mais afetados em sujeitos com hanseníase estão o nervo trigêmeo, responsável pela motricidade dos músculos mastigatórios e pela sensibilidade tátil, térmica e dolorosa da face, da mucosa da nasofaringe, palato mole e duro, bem como, dos 2/3 anteriores da língua, e o nervo facial, que é responsável pela sensibilidade gustativa dos 2/3 anteriores da língua e motricidade dos músculos da mímica facial. Sendo assim, investigou-se alterações sensório-motoras em cavidade oral e orofaringe e pesquisou-se a presença do Mycobacterium leprae na saliva em pacientes com hanseníase virgens de tratamento atendidos num Centro de Referência em Dermatologia Tropical do Estado do Amazonas no período de julho à outubro de 2010. Realizou-se um estudo transversal do tipo detecção de casos, com 45 sujeitos com hanseníase e 45 sujeitos com outras dermatoses incluídos no estudo como grupo controle. Os sujeitos com hanseníase foram submetidos à anamnese, avaliação da sensibilidade da cavidade oral e orofaringe, avaliação otorrinolaringológica (exame clínico, nasofibroscópico e laringoscópico), videofluoroscopia da deglutição, bem como, procedimentos moleculares – Reação em Cadeia da Polimerase em Tempo Real (qPCR) – e bacteriológicos para pesquisar a presença do DNA do M. leprae na saliva. Os sujeitos do grupo controle foram submetidos a avaliação da sensibilidade oral. Os resultados foram analisados por meio de estatística descritiva e indutiva, constatando-se que 15/45 (33,3%) dos sujeitos com hanseníase apresentaram alteração na sensibilidade oral. Sendo este dado estatisticamente significativo (p = 0,002) quando comparado com o grupo controle. Na pesquisa do DNA do M leprae na saliva, por meio da técnica de PCR Tempo-Real, foram detectados 16 (35,5%) exames positivos do total de 45 sujeitos com hanseníase. Não foi observada relação direta entre a presença do M. leprae na saliva e alteração da sensibilidade oral, porém a positividade da PCR Tempo Real na saliva (PCR da saliva) em seis (31,6%) dos 19 pacientes paucibacilares sugere a possibilidade de um novo sítio de coleta das amostras. Ao somarmos os resultados das técnicas para diagnóstico (baciloscopia do raspado intradermico, PCR do raspado intradérmico e PCR da saliva) verificamos o aumento da positividade dos resultados para 55,55%. Este aspecto é especialmente importante nos casos de diagnósticos mais difíceis, como por exemplo, nos pacientes paucibacilares.

Introdução: O Câncer de próstata (CaP) é o tumor mais comum e a segunda causa de óbito por câncer no homem. O diagnóstico é feito pelo toque retal, nível sérico do antígeno prostático específico (PSA) e biópsia. A avaliação prognóstica é definida pelo PSA, estádio e escore de Gleason, porém, nenhum destes fatores clássicos, mesmo quando avaliados em conjunto, tem excelente performance na determinação prognóstica desta neoplasia. O CD44 é uma glicoproteína transmembrana envolvida em múltiplos processos celulares entre eles a adesão, migração, transmissão de sinal e apoptose. Tem como seu principal ligante o ácido hialurônico sendo assim um importante elemento na interação entre a célula e a matriz e por isso tem sido estudada como potencial marcador em várias neoplasias. Além da forma padrão (CD44s), apresenta ainda dez isoformas resultantes de splicing. São poucos os estudos de CD44 no CaP, principalmente relacionados a expressão de suas isoformas. Objetivo: Analisar e correlacionar a expressão de CD44s e de suas isoformas CD44v2, CD44v3, CD44v4, CD44v5, CD44v6, CD44v7, CD44v8, CD44v9 e CD44v10 no câncer localizado de próstata com os fatores prognósticos clássicos. Material e métodos: Analisamos retrospectivamente os espécimes cirúrgicos de 94 pacientes submetidos a prostatectomia radical (PR) entre outubro de 1997 e abril 2002. A expressão da forma standard, assim como das suas oito variantes resultado de splicing alternativo foi analisada através da reação em cadeia da polimerase quantitativa em tempo real (qRT-PCR). O grupo controle foi constituído pelos espécimes cirúrgicos de 14 pacientes com hiperplasia prostática benigna (HPB) submetidos a cirurgia aberta. Correlacionamos o perfil de expressão da forma padrão e suas variantes com escore de Gleason, estadiamento patológico, nível de PSA pré-operatório e recidiva bioquímica definida por níveis de PSA acima de 0,2ng/ml em seguimento médio de 53,3 meses. Resultados: Encontramos subexpressão de CD44s e superexpressão de todas as isoformas resultado de splicing alternativo no CaP localizado quando comparado a HPB. Observamos que a média de expressão da maioria das variantes foi maior nos pacientes que não recidivaram, porém apenas a maior expressão de CD44v2 esteve significativamente associada a menor chance de recidiva bioquímica (p=0,044). Conclusão: No CaP, existe uma alteração na expressão de CD44, com perda de CD44s e aumento de expressão de todas as suas variantes. No entanto, a recorrência tumoral mostrou-se significativamente associada a perda da expressão de CD44v2 / Introduction: Prostate cancer (PC) is the most common tumor and the second leading cause of cancer death in men. The diagnosis is made by rectal examination, serum prostate-specific antigen (PSA) and biopsy. The prognosis is defined by the PSA, tumor stage and Gleason escore, however, none of these classical factors, even when combined, have excellent accuracy in determining tumor behavior. The CD44 is a transmembrane glycoprotein related to many cell processes including adhesion, migration, signaling transduction and apoptosis, being considered a potential marker in many tumors. Besides the standard form (CD44s) there are ten isoforms resulted from alternative splicing. There is scarce data in the literature regarding the role of CD44 and its isoforms in PC prognosis. Objective: To analyze the expression of the CD44s and its isoforms CD44v2, CD44v3, CD44v4, CD44v5, CD44v6, CD44v7, CD44v8, CD44v9 and CD44v10 in in surgical specimens of localized PC correlating the expression profile with the classical prognostic factors and biochemical recurrence. Methods: We retrospectively analyzed the surgical specimens of 94 patients that underwent radical prostatectomy between October 1997 and April 2002. The standard form as well as its nine variants were analyzed by quantitative, real time polymerase chain reaction (qRT-PCR). The control group consisted of 14 specimens of patients with benign prostatic hyperplasia (BPH) submitted to open surgery. We correlated the expression of the variants with the Gleason escore, pathological stage, pre-operatory PSA and the occurrence of biochemical recurrence defined as PSA higher than 0.2 ng/ml in a mean follow up of 53.3 months. Results: CD44s was underexpressed, and all isoforms were overexpressed in PC when compared with BPH. However, the mean expression of most variants was higher in patients without recurrence, while a higher expression of CD44v2 correlated with higher recurrence free survival rate (p=0.044). Conclusion: In PC, there is a change in CD44 expression with a loss of CD44s and an overexpression of all of the CD44 variants. We also found that biochemical recurrence was significantly associated with loss of CD44v2 expression.

O cão (Canis familiaris) é o principal reservatório de Leishmania (Leishmania) infantum. Sua alta competência em transmitir o parasito para o inseto vetor contribui para a manutenção do ciclo e aumento do risco para os humanos em áreas endêmicas. O amplo espectro de manifestações clínicas da leishmaniose visceral canina (LVC) torna seu diagnóstico bastante complexo, já que essas manifestações podem se sobrepor àquelas causadas por outros agentes infecciosos. Fator agravante é que a infecção, na maior parte das vezes, tem caráter subclínico, podendo passar despercebida. Diante disto, um diagnóstico confiável se faz necessário para confirmar uma suspeita clínica ou infecção inaparente. A reação em cadeia da polimerase (PCR) tem contribuído em muito para o aumento da sensibilidade do diagnóstico, e seu uso mostra que a prevalência da infecção canina por L. (L.) infantum em áreas endêmicas pode ser bem maior do que a apontada pela sorologia. É sabido que um dos fatores limitantes do emprego de uma técnica diagnóstica em larga escala refere-se à coleta do material clínico que, idealmente, deve ser simples, rápida e indolor. Assim, entende-se que a associação da PCR com amostras não invasivas, de fácil coleta, poderia representar uma contribuição importante para o diagnóstico da LVC. Dessa forma, a proposta do presente projeto foi investigar o valor do swab oral (SO) na detecção de L. (L.) infantum em cães oriundos de áreas onde ocorre transmissão do parasito, através do uso da PCR em tempo real, considerada a mais sensível dentre as técnicas moleculares. Para tanto, comparamos sua positividade com a encontrada em outra amostra não invasiva (swab conjuntival= SC), pouco invasiva (sangue periférico= SG) e invasiva (aspirado de linfonodo=LN) e com a sorologia, considerando grupos clínicos, carga parasitária, índice de concordância entre os resultados, e a combinação dos resultados das diferentes amostras e a sorologia com aqueles obtidos no SO. Noventa e dois cães com comprovada infecção participaram do estudo. Os animais foram classificados em sintomáticos (n=63) e assintomáticos (n=29), de acordo com o exame físico e provas laboratoriais. No presente estudo a positividade do SO (67,4%) foi equivalente a do SC (68,5 %), maior do que a encontrada no SG (52,2%), e menor quando comparada ao LN (84,8%). Considerando os grupos clínicos, o SO foi positivo em 81 % dos cães sintomáticos e em 37,9 % dos assintomáticos. A positividade encontrada no SC também foi maior no grupo sintomático em relação ao assintomático (82,5 % x 37,9 %), assim como no LN (93,7 % x 65,5 %), mas não no SG (62,1 % x 47,6 %) e na sorologia (77,8 % x 79,3 %). Salienta-se que o SO foi positivo em 35 % dos cães com sorologia negativa (n=20), o SC em 35%, o SG em 40 %, o LN em 70 %, e OS+CS em 60% deles. A concordância dos resultados do SO foi moderada em relação à conjuntiva (k= 0,3) e fraca em relação às demais amostras e a sorologia (0.2 < k < 0.3). A carga parasitária do SO, por sua vez, não se diferiu da conjuntival, ambas foram maiores do que a encontrada no SG, e o LN apresentou a maior carga, mostrando uma clara correlação da intensidade do parasitismo com os índices de positividade obtidos. O LN mostrou o maior parasitismo entre as amostras analisadas. A combinação dos resultados do SO e SC atingiram 84 % de positividade nos 92 cães estudados, 92,1 % no grupo sintomático e 65,5 % no assintomático. Em suma, o presente estudo mostrou a presença do DNA de L. (L.) infantum no swab oral de cães infectados através da PCR em tempo real, revelando seu potencial uso no diagnóstico da LVC em cães com suspeita clínica dada a sua alta positividade nos animais com sintomatologia, equivalente à encontrada na amostra invasiva, o aspirado de linfonodo. Em oposição, encontrou-se baixa positividade nos cães assintomáticos, mas seu uso combinado com outra amostra não invasiva, a conjuntiva, atingiu patamares satisfatórios. O fato do SO ter sido positivo em parte dos animais soronegativos aponta vantagem adicional do seu uso na investigação de infecção por L. (L.) infantum em inquéritos epidemiológicos ou mesmo na rotina clínica. Por fim, os nossos resultados mostraram que a combinação de testes e amostras é necessária para a identificação de cães infectados por L. (L.) infantum, e que a PCR com o swab oral, especialmente associado ao swab conjuntival, pode contribuir de forma significativa para o diagnóstico da infecção canina, seja ela sintomática ou assintomática / Dog (Canis familiaris) is the major reservoir of Leishmania (L.) infantum. Its high competence for transmitting the parasite to the vector contributes to the maintenance of the cycle and for increasing risk to humans in endemic areas. The wide spectrum of clinical manifestations of canine visceral leishmaniasis (CVL) makes the diagnosis quite complex, since the symptoms can overlap those caused by other infectious agents. Of note, the infection is mostly subclinical, making the diagnosis even more difficult. Therefore, an accurate diagnosis is necessary to confirm a clinical suspicion or the silent infection. The polymerase chain reaction (PCR) has greatly contributed for increasing the diagnostic sensitivity, and its use shows that L. (L.) infantum canine infection in endemic areas may be much higher than that pointed by serology. It is known that one limiting factor of using a diagnostic method in large scale refers to the collection of clinical samples which should be ideally simple, quick, and painless. Thus, it is understood that the association of PCR with non-invasive samples could represent an important contribution to the diagnosis of CVL. Therefore, the purpose of this study was to investigate the value of the oral swab (OS) in detecting L. (L.) infantum in dogs from areas of parasite transmission through the use of real-time PCR that is considered the most sensitive among the molecular techniques. To this end, we compared the OS positivity with that found in other non-invasive (conjunctival swab = CS), minimally invasive (blood = BL) and invasive (lymph node aspirate = LN) samples and serology, considering clinical groups, parasite load, agreement among results, and the combination of results from different samples and serology with those obtained with OS. Ninety-two dogs with proven infection were selected for this present study. The animals were divided into symptomatic (n = 63) and asymptomatic (n = 29) dogs, according to the physical examination and laboratory tests. Here, the positivity in OS (67.4%) was equivalent to the CS (68.5%), higher than that found in BL (52.2%), and lower when compared to LN (84.8%). Regarding clinical groups, OS was positive in 81% of the symptomatic dogs and in 37.9% of asymptomatic ones. The positivity in CS was also higher in the symptomatic compared to the asymptomatic group (82.5% x 37.9%) and in LN (93.7% x 65.5%), but not in BL (62.1% x 47.6%) and serology (77.8% x 79.3%). Noteworthy, the OS was positive in 35% of dogs with negative serology (n = 20), CS in 35%, BL in 40% and LN in 70%. Moderate agreement was found between OS results and CS results (k = 0.3) and weak in comparison to other samples and serology (0.2 < k < 0.3). The parasite load was equivalent between OS and CS, both were higher than that found in BL, and LN presented the highest burden, showing that parasitism intensity and the positivity rates are correlated. The combination of OS and CS results reached 84% positivity in 92 dogs studied, 92.1% for symptomatic dogs and 65.5% for asymptomatic ones. In summary, the present study showed the presence of L. (L.) infantum DNA in oral swab of infected dogs by real-time PCR, revealing its potential use for diagnosing CVL in animals with clinical suspicion due to its high positivity in dogs with symptoms, equivalent to that found in invasive sample, the lymph node aspirate. In contrast, low positivity was found in asymptomatic dogs, but the combined use with other non-invasive sample, the conjunctiva, reached satisfactory levels. OS positivity found in part of the seronegative animals points additional advantage of using OS in the investigation of L. (L.) infantum infection in epidemiological surveys or in clinical practice. Finally, our findings pointed that combination of tests and samples is required for identifying dogs infected with L. (L.) infantum, and that the PCR with oral swab, especially associated with the conjunctival swab, can contribute for diagnosing both asymptomatic and symptomatic dogs

A elevada e crescente prevalência do carcinoma basocelular (CBC) na população caucasiana e o seu marcante predomínio entre os cânceres cutâneos não-melanoma despertam interesse para a elucidação dos mecanismos envolvidos no seu desenvolvimento. Os vários subtipos da neoplasia possuem características de interesse para um modelo de estudo, a fim de identificar os fatores determinantes dos diferentes padrões de crescimento. Objetivo: Neste estudo buscamos analisar, por meio da expressão de citocinas, linfócitos, VEGF e HLA-G, os possíveis mecanismos imunomoduladores envolvidos nos diferentes padrões de crescimento, subtipos e localizações topográficas do CBC. Métodos: Em 26 amostras de fragmentos dos subtipos nodular e superficial de CBC primários, foram analisadas a expressão de CD3, CD4, CD25, FOXP3, HLA-G e VEGF, por meio imunoistoquímica (IHQ), e de IL-4, IL-6, IL-8, IL-10, IL-17, IL-23, FOXP-3 e IFN-gama, por meio da reação em cadeia da polimerase em tempo real quantitativa (qPCR). Resultados: Na amostra (n=26), houve discreto predomínio de homens (54%), com idade variando entre 35 a 89 anos e média de 72,96 anos; 84,62% dos CBC eram localizados em área fotoexposta, 53,85% não-cefálicos (14/26) e 46,15% cefálicos (12/26). CBC nodulares apresentaram um infiltrado inflamatório mais evidente e concentrado ao redor dos blocos neoplásicos; CBC superficiais apresentaram um infiltrado inflamatório difuso por toda a derme, e discretamente mais intenso nas áreas adjacentes aos blocos tumorais. A expressão de todos os marcadores foi mais evidente no sítio perineoplásico (PN) comparado ao interior, das células neoplásicas (Cneo). Distintamente de outros marcadores, notou-se acentuada frequência da expressão de CD25+ e HLA-G nas Cneo. Nas Cneo dos CBCn, evidenciou-se elevada frequência de células marcadas em intensidade moderada para HLA-G (p=0,04) e em intensidade leve para FOXP3 (p = 0,037), quando comparados aos CBCs. A expressão de CD4+ no infiltrado PN foi mais frequente nos tumores não-cefálicos (p=0,02) comparados aos cefálicos. A expressão de citocinas IL-6 IL-8, IL-17 foi maior nos dois subtipos de CBC, nodular e superficial, comparada à da pele normal. CBC cefálicos apresentaram maior expressão de IL-4 (p=0,02), enquanto aqueles de localização não-cefálica expressaram mais IL-8 (p=0,002). Conclusão: A composição e a localização do infiltrado inflamatório corroboram a resposta imunológica mediada por células T CD3+ e CD4+ no CBC. A participação de linfócitos CD25+, FOXP3+ e do HLA-G caracteriza uma ação imunomoduladora, e a presença das interleucinas IL-8 e do perfil Th17, IL-6 e IL-17, podem favorecer a neovascularização e a supressão de células efetoras no microambiente do CBC propiciando o seu desenvolvimento e escape tumoral. / Introduction: The high and increasing prevalence of basal cell carcinoma (BCC) in the Caucasian population, and its striking predominance between non-melanoma skin cancers arouse interest for the elucidation of the mechanisms involved in its development. Its various subtypes have characteristics of interest for a study model in order to identify the determinants of different patterns of growth. Objective: This study aims to analyze the possible immunomodulatory mechanisms involved in the different growth patterns, and topographic locations subtypes of BCC through the expression of cytokines, lymphocytes, VEGF and HLA-G. Methods: In 26 fragments samples of primary BCC, subtypes nodular and superficial, we analyzed the expression of CD3, CD4, CD25, FOXP3, HLA-G and VEGF by immunohistochemistry (IHC) technique, and of cytokines IL-4, IL-6, IL-8, IL-10, IL-17, IL-23, FOXP-3 and IFN- by quantitative real time polymerase chain reaction (qPCR). Results: The sample (n = 26) had a slight predominance of men (54%), aged between 35-89 years, mean age 72.96 years; 84.62% of the BCC were located in sun-exposed area, 53.85% (14/26) non-cephalic and 46.15% (12/26) cephalic. Nodular BCC showed a more evident and concentrated inflammatory infiltrate around the tumor blocks; while superficial BCC showed a diffuse inflammatory infiltrate throughout the dermis, and slightly more intense in tumor blocks adjacent areas. The expression of all markers was evident at the perineoplastic (PN) sites compared to neoplastic cells (Cneo). Differently from other markers, we noticed strong frequency expression of CD25+ and HLA-G within the Cneo. In Cneo of BCCn, it became apparent high frequency of moderate HLA-G marked cells (p = 0.04) and at low intensity for FOXP3 (p = 0.037) when compared to BCCs. The expression in CD4+ infiltrate was more frequent in PN non-cephalic tumors (p = 0.02) compared with cephalic. The expression of IL-6 IL-8, IL-17 was higher in both subtypes of BCC, nodular and superficial, compared to normal skin. Cephalic BCC showed higher expression of IL-4 (p=0,02) while those from non-cephalic location expressed more IL-8 (p=0,002). Conclusion: The composition and location of the inflammatory infiltrate corroborate the immune response mediated by CD3+ and CD4+ T cells on the BCC. The involvement of HLA-G, CD25+ and FOXP3 lymphocytes features an immunomodulary action, and the presence of interleukin IL-8 and Th17 profile (IL-6 and IL-17) may promote neovascularization and suppression of effector cells in the BCC microenvironment providing its development and tumor escape.

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Orientador: Sandra Cecília Botelho Costa / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-08-25T18:24:50Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Peres_RenataMariaBorges_D.pdf: 6331424 bytes, checksum: 507ca7bba502f408e486703c76d9ef20 (MD5) Previous issue date: 2014 / Resumo: Introdução: Considerando-se que o transplante de células-tronco hematopoiéticas (TCTH) está associado à significativa morbidade e mortalidade devido à toxicidade do regime de condicionamento, sepse, doença do enxerto-contra-hospedeiro (DECH), entre outras complicações, sua indicação requer uma avaliação cuidadosa do risco. As infecções estão associadas a elevados índices de óbitos no pós-transplante, e seu aparecimento pode estar associado a fatores como o regime de condicionamento, imunodepressão para a prevenção da DECH, a própria DECH e a terapia adicional para a doença de base após o transplante. Dentre as infecções virais, o citomegalovírus humano (HCMV) é o patógeno mais importante no pós-TCTH pela morbidade e mortalidade associadas a ele. Por este motivo os pacientes submetidos ao TCTH são monitorados por testes laboratoriais sensíveis e específicos para o diagnóstico precoce da infecção ativa causada pelo HCMV, permitindo assim, a administração imediata da terapia antiviral. A antigenemia tem sido indicada como "padrão ouro" para guiar o tratamento precoce desta infecção. Embora a PCR em tempo real seja outra técnica muito utilizada para este fim, esta pode ser demasiadamente sensível para uso clínico, podendo haver diagnósticos positivos em pacientes que não apresentam risco de desenvolvimento da doença causada pelo HCMV. Objetivos: Determinar um valor de cutoff para diferenciar infecção latente de infecção ativa, além do risco do desenvolvimento da doença causada pelo HCMV. Métodos: Neste trabalho, 49 pacientes submetidos ao TCTH do tipo alogênico foram monitorados desde o dia do transplante até o dia +150 pelas técnicas de antigenemia e pela PCR em tempo real. Resultados: Após a construção da curva ROC o cutoff encontrado para indicar a reativação do HCMV foi 116 cópias. Baseado nesta determinação, os resultados positivos da PCR em tempo real (?116 cópias) foram comparados com resultados positivos da antigenemia (? 3 células pp65 positivas), observando associação estatisticamente significante entre eles. Sendo assim, a PCR em tempo real com 116 cópias como cutoff foi adotada como o único critério para definir a infecção ativa causada pelo HCMV nos pacientes incluídos no estudo. Vinte (40,8%) dos 49 pacientes tiveram infecção ativa causada pelo HCMV durante o monitoramento, ocorrendo com maior frequência entre os dias +41 e +50 pós-TCTH. Dezoito (90%) desses 20 pacientes foram tratados com ganciclovir e 16 deles atingiram a negativação da PCR em tempo real numa mediana de 6 dias após o início do tratamento. Quatro (8,2%) pacientes tiveram doença causada pelo HCMV comprovada por biópsia do trato gastrointestinal, 1 deles sem diagnóstico da viremia. Dois (50%) dos 4 pacientes que tiveram doença causada pelo HCMV não responderam bem ao tratamento antiviral, evoluindo para o óbito por esta causa numa mediana de 6,5 dias após o início do tratamento com ganciclovir. Outros 15 pacientes morreram por infecções fúngicas e bacterianas, DECH, recidiva da doença de base ou doença veno-oclusiva hepática. Conclusões: Pacientes submetidos ao TCTH não aparentado apresentam maior risco de infecção ativa causada pelo HCMV, o aumento repentino da carga viral parece ter relação com o aparecimento da doença causada pelo HCMV, a gravidade desta doença pode estar associada com o tempo de resposta ao tratamento antiviral e a manifestação de doença causada pelo HCMV e provável doença causada pelo HCMV aumentam o risco de óbito no pós-TCTH / Abstract: Considering that allogeneic hematopoietic stem cell transplantation (HSCT) is associated with significant morbidity and mortality due to toxicity of the conditioning regimen, sepsis onset, graft versus host disease (GVHD) manifestation, among other complications, its indication requires careful risk assessment. Infections are associated with high rates of deaths after transplantation, and their appearance can be associated with factors such as conditioning regimen, immunosuppression to prevent GVHD, GVHD itself and additional therapy for the underlying disease after transplantation. Among the viral infections, human cytomegalovirus (HCMV) is the most significant pathogen after HSCT, considering morbidity and mortality associated with it. For this reason, patients submitted to HSCT are monitored by sensitive and specific laboratory tests for early diagnosis of HCMV reactivation, thus allowing immediate administration of antiviral therapy. The antigenemia method has been indicated as the gold standard for guiding the early treatment of this infection. Although real-time PCR is another technique widely used for this purpose, this may be too sensitive for clinical use, there may be positive diagnoses in patients without risk of developing HCMV disease. Objectives: Determining a cutoff value to distinguish latent infection from active infection and the risk of developing HCMV disease. Methods: In this study, 49 patients undergoing allogeneic HSCT were monitored from the day of transplantation until day +150 by antigenemia and real-time PCR. Results: After constructing the ROC curve, the cutoff found for HCMV reactivation was 116 copies. Based on this determination, the positive results of real-time PCR (? 116 copies) were compared with results of positive antigenemia (pp65 positive cells ? 3), observing statistically significant association between them. Thus, the real-time PCR with 116 copies as cutoff was adopted as the sole criterion to define the active infection in the patients included in the study. Twenty (40.8%) of the 49 patients had HCMV reactivation during monitoring, occurring most frequently between days +41 and +50 after HSCT. Eighteen (90%) of these 20 patients were treated with ganciclovir and 16 have reached their negative real-time PCR in a median of six days after the beginning of treatment. Four (8.2%) patients had positive gastrointestinal tract biopsy for HCMV disease, one of them with no diagnosis of viremia. Two (50%) of four patients who had HCMV disease have not responded well to antiviral therapy, progressing to death by HCMV disease at a median of 6.5 days after starting treatment with ganciclovir. Another 15 patients died from fungal bacterial infection, GVHD, underlying disease relapse or veno-occlusive hepatic disease. Conclusions: Patients undergoing unrelated HSCT had higher risk of HCMV reactivation; the sudden increase in viral load seems to be related to the onset of HCMV disease; the severity of HCMV disease may be associated with the response time to antiviral therapy; and HCMV disease manifestation and probable HCMV disease increase the risk of death after HSCT / Doutorado / Clinica Medica / Doutora em Clínica Médica

Orientadores: Ana Maria Lima de Azeredo Espin, Tatiana Teixeira Torres / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-23T02:29:01Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Cardoso_GiseleAntoniazzi_M.pdf: 5837869 bytes, checksum: 23826467e3b82c7f5176f5bfdcecb022 (MD5) Previous issue date: 2012 / Resumo: Os estudos da base molecular do comportamento são difíceis de serem realizados uma vez que um comportamento pode ser moldado por diversos fatores (incluindo fatores genéticos). Vários trabalhos ligaram genes a comportamentos específicos. Com bases nesses estudos, nós usamos espécies da família Calliphoridae como modelo para o estudo da evolução do hábito de parasitismo. Espécies muito próximas de califorídeos exibem comportamentos alimentares diferentes como o hábito necrófago ou parasita. Ainda não se sabe como o hábito de parasitismo surgiu em Calliphoridae, no entanto, existem diversas estratégias para tentarmos entender a evolução do hábito de parasitismo. Uma delas envolve a análise da expressão de genes candidatos relacionando as diferenças de expressão observadas com os diferentes hábitos alimentares. Assim, nós utilizamos a técnica de PCR em tempo real, que mede a expressão do gene de interesse em relação a um gene de referência. O uso do gene de referência tem como objetivo retirar uma parte da variação experimental. Portanto, esse gene deve não deve variar sua expressão nas diferentes espécies que foram estudadas. Então, primeiramente selecionamos e validamos genes de referência para obtermos uma quantificação mais precisa dos níveis de expressão dos genes candidatos. Após essa etapa, selecionamos genes candidatos e os separamos em quatro categorias: a) genes diretamente relacionados ao comportamento alimentar, b) genes relacionados ao metabolismo de substâncias tóxicas, c) genes relacionados a respostas imunológicas e; d) genes diretamente ligados ao hábito de parasitismo. A expressão de oito genes candidatos foi analisada em espécies dos gêneros Chrysomya e Cochliomyia. Além disso, foi possível inferir como a expressão desses genes evolui dentro da família Calliphoridae. Nós observamos uma grande conservação nos níveis de expressão gênica em larvas e em adultos evidenciamos diferenças de expressão correlacionadas com a divergência entre as espécies. O gene que se destacou em nossas análises por sua possível relação com o hábito alimentar deve ser estudado detalhadamente para dar continuidade ao projeto / Abstract: Studies involving the molecular basis of behavior are difficult to perform because behavior is shaped by several factors (including genetic factors). Several studies have linked genes to specific behaviors. Based in these studies, we used species of the family Calliphoridae to study the evolution of parasitism. Closely related species of this family exhibit different feeding behaviors (obligate parasites and saprophagous species). It is unclear how parasitism arose in Calliphoridae, however, it is possible to observe in their evolutionary history that this habit appears in three separate occasions. One approach to initiate this study is to examine the expression of candidate genes. For this purpose, we used real time PCR, but gene expression is measured relative to a reference gene. The use of a reference gene is to remove a part of the experimental variation. Therefore, this gene is expected not to vary its expression in the different species studied. Thus, we first selected and validated reference genes to obtain a more accurate quantification of gene expression levels. After this step, we selected candidate genes and separated them into four categories: a) genes directly related to feeding behavior, b) genes related to metabolism of toxic substances, c) genes related to immune responses and d) genes directly linked to parasitism. We analyzed the expression of eight candidate genes in species of Chrysomya and Cochliomyia genera. Moreover, it was possible to infer how the expression of these genes is evolving within family Calliphoridae. We observed a wide conservation in gene expression levels in larvae and in adults there was evidence of neutral evolution (genes differentially expressed among species). The gene Mvl may be involved in the different feeding habits and paved the way to continue the study of the evolution of parasitism / Mestrado / Genetica Animal e Evolução / Mestre em Genética e Biologia Molecular

Orientador: Cláudia Vianna Maurer-Morelli / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-08-23T06:03:12Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Reis-Pinto_FernandaChristina_M.pdf: 1859636 bytes, checksum: b8c3841af89fe165c03148ebcc2437ce (MD5) Previous issue date: 2013 / Resumo: O uso de modelos animais tem trazido grandes benefícios para o conhecimento dos processos biológicos normais, bem como para uma maior compreensão das doenças humanas, inclusive as epilepsias. Embora os modelos de roedores sejam os mais usados para explorar os mecanismos que permeiam a epileptogênese, recentemente, um novo modelo animal foi proposto para o estudo das epilepsias, o Daniorerio. Popularmente conhecido como zebrafish, este pequeno peixe possui muitas vantagens para a experimentação científica, principalmente no que se refere à manipulação genética.O Fator Neurotrófico Derivado do Cérebro (BDNF, do inglês, BrainDerivedNeurotrophicFactor) é a neurotrofina de maior abundância no sistema nervoso central e que está relacionada à plasticidade neuronal. Sabe-se que os níveis de transcritos e protéicos desta neurotrofina estão alterados nas epilepsias, tanto em humanos quanto em modelos animais; porém, o seu papel nesta condição ainda é controverso. Os principais objetivos deste estudo foram (i) investigar o perfil temporal de transcritos dos genes bdnfe seus receptores ntrk2a e ntrk2b após crise epiléptica aguda e (ii) após crises epilépticas repetitivas por meio da técnica da PCR quantitativa (qPCR) usando-se o sistema TaqManTM (AppliedBiosystems, Foster City). As crises epilépticas foram induzidas quimicamente por Pentilenotetrazol (PTZ) em animais adultos e seus encéfalos coletados nos tempos: (i) 0,05h, 12h, 24h, 48h, 72h pós-crise aguda e (ii) uma semana após indução de crise diária por cinco dias consecutivos. Os resultados mostraram que as crises epilépticas modificaram o perfil de expressão das neurotrofinas e apontou para um aumento dos níveis de RNAm do gene bdnf no tempo 0,05h (p= 0,01) que não é descrito em outros modelos. É importante salientar que esses resultados mostram que, no encéfalo do zebrafish, as neurotrofinas estão relacionadas com uma atividade neuronal anormal como em outros modelos animais e em humanos. Este é o primeiro estudo a investigar os níveis de transcritos do gene bdnf e seus receptores no encéfalo do zebrafish, contribuindo para a caracterização deste animal como modelo para estudos das epilepsias / Abstract: Animal models have been contributing to a better understanding of human diseases, including epilepsies. Although rodent models are common organisms used to investigate the mechanisms underlying epileptogenesis, recently, Daniorerio has gained attention as a promising model for epilepsy studies. Popular named as zebrafish, this little fish has many advantages for scientific investigation, especially those related to genetic manipulations. BDNF (Brain Derived Neurotrophic Factor) is the main neurotropic factor in the central nervous system and it is related to neuronal plasticity. It has been reported that both BDNF transcript and protein levels are increased after seizures in patients and experimental models; however, the temporal transcript profile of the BDNF in the zebrafish brain is unknown. The main aim of this study was to investigate the transcripts profile of bdnf, and ntrk2antrk2b genes by quantitative PCR (qPCR) using TaqManTM system (Applied Biosystems, Foster City), (i) after a single seizure and (ii) repetitive seizures. Seizures were chemically induced by Pentylenetetrazole (PTZ) in adult animals and their brains collected at (i) 0,05h, 12h, 24h, 48h, and 72h after acute seizure and (ii) one week after single seizure/day by five consecutive days. Our results showed that in the zebrafish brain, changes in neurotrophins transcript levels were related to an abnormal neuronal activity as seems in other experimental models and patients and presented an increase of bdnf mRNA levels at 0,05h (p=0.01) described for the first time. This is the first study exploring transcript profile of neurotrophins in zebrafish brain and contributes to characterize it as a model for epilepsy studies / Mestrado / Ciencias Biomedicas / Mestra em Ciências Médicas

Orientador: Marcos Antonio Machado / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-23T15:02:08Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Oliveira_TiagoSilva_M.pdf: 9792911 bytes, checksum: ad5dca1b90e42dd95db47317b65cb9be (MD5) Previous issue date: 2013 / Resumo: O resumo poderá ser visualizado no texto completo da tese digital / Abstract: The abstract is available with the full electronic document / Mestrado / Genetica Vegetal e Melhoramento / Mestre em Genética e Biologia Molecular