O sistema de expressão em Escherichia coli foi o primeiro a ser utilizado para produzir produtos farmacêuticos recombinantes e tem muitas vantagens quando comparado com sistemas eucarióticos, como o fácil cultivo, baixo custo e alto potencial de produção. O fator estimulador de colônias de granulócito (G-CSF) atua principalmente promovendo a maturação dos neutrófilos e estimulando sua atividade fagocítica e quimiotática, além de estar envolvido com o processo de segmentação nuclear dessas células. O fator estimulador de colônias de granulócitos humano recombinante (rhG-CSF) tem sido produzido por engenharia genética em Escherichia coli, e é usado no tratamento de diversas patologias, sobretudo em neutropenias provocadas pela quimioterapia usada no tratamento de tumores, pela radioterapia e pelo uso de drogas que suprimem a produção de células mieloides. Desse modo, o presente estudo teve como objetivo a expressão da proteína rhGCSF em bactérias Escherichia coli. A clonagem do gene rhG-CSF no vetor de expressão pET-28a(+) foi realizada nos sítios de restrição das enzimas EcoRI e XhoI, e a expressão da proteína recombinante em cepas de bactéria Escherichia coli BL21DE3 foi obtida com sucesso. A proteína rhG-CSF, fundida à cauda de seis histidinas, foi purificada com êxito e identificada pelas técnicas de Western Blotting e por espectrometria de massas. São necessários estudos para avaliar a integridade estrutural e atividade biológica da proteína produzida, que se confirmada, possibilita que esta seja produzida em escala piloto. / The expression system in Escherichia coli was the first to be used to produce recombinant pharmaceuticals and has many advantages compared to eukaryotic systems, such as easy cultivation and high production potential at low costs. The granulocyte colony (G-CSF) stimulating factor acts primarily by promoting the maturation of neutrophils and stimulating their phagocytic and chemotactic activity. G-CSF is also involved with the process of neutrophils nuclear segmentation. The recombinant human granulocyte colonies stimulating factor (rhG-CSF) has been produced by genetic engineering in Escherichia coli, and it is used to treat of several conditions, especially neutropenia caused by chemotherapy used in the treatment of tumors, by radiotherapy and by the use of drugs that suppress the production of myeloid cells. The present study aimed the expression of rhG-CSF protein in Escherichia coli bacteria. The cloning of rhG-CSF gene in the expression vector pET- 28a (+) was carried out on the restriction sites of the EcoRI and XhoI enzymes. Expression of the recombinant protein in Escherichia coli BL21DE3 was successfully achieved. The rhG-CSF protein, fused with a six histidine tag, was obtained and successfully purified and identified by the Western Blotting and by mass spectrometry techniques. Studies are needed to assess the structural integrity and biological activity of the protein produced, which, if confirmed, enables the production on a pilot scale.

Mobilização inadequada de células progenitoras hematopoéticas (CPH) tem sido observada em 10 - 30% dos pacientes submetidos a transplante de medula óssea (TMO) autogênico para tratamento de doenças onco-hematológicas. Os fatores relacionados com má resposta à mobilização ainda não estão totalmente estabelecidos. Apresentamos uma análise retrospectiva de pacientes submetidos à TMO autogênico com o objetivo de identificar variáveis associadas com resposta ruim ao regime de mobilização utilizado. Casuística e Métodos: Fizeram parte desta análise 307 pacientes com diferentes diagnósticos, tratados com TMO autogênico em uma única Instituição, no período de Abril de 2001 a Abril de 2007. Todos os pacientes incluídos no estudo foram submetidos a um único regime de mobilização baseado na administração de ciclofosfamida (dose total de 60-120 mg/kg de peso IV) e fator estimulador de colônias de granulócitos (G-CSF) (dose diária de 6 - 17 ug/(kg de peso)/dia SC). O sucesso na resposta ao regime de mobilização foi definido quando um número maior ou igual a 2,0x10 (6) células CD34 + /(kg de peso) foi coletado do sangue periférico com até três procedimentos de leucaférese. Resultados: Dos pacientes analisados, 260 apresentaram sucesso na mobilização (84,7%). Nestes pacientes, um número mediano de 3,67 (2,0 - 46,0) células CD34+ /(kg de peso) foi coletado por paciente com um número mediano de 1 (1-3) procedimento de leucaférese. O insucesso na mobilização foi observado em 47 pacientes (15,3%): 24 (7,8%) que foram submetidos à coleta de CPH de sangue periférico, porém não coletaram número maior ou igual 2,0x10 (6) células CD34+/(kg de peso) com pelo menos três procedimentos de leucaférese; e, 23 (7,5%) foram submetidos à coleta de CPH por punção da medula óssea, por não terem atingido número mínimo de 10 células CD34+/mm3 no sangue periférico para realização de leucaférese. De acordo com análise univariada, os fatores associados com o insucesso foram: diagnóstico (P < 0,0001), tempo de doença (P < 0,0001), número prévio de ciclos de quimioterapia (P = 0,0001), exposição prévia a agentes alquilantes (P = 0.0003) e a mitoxantrone (P = 0,0006), contagem de plaquetas pré-mobilização <150.000/mm3 (P = 0,0006) e intervalo entre o início da mobilização e o pico de células CD 34+ no sangue periférico (P < 0,0001). Idade, sexo, atividade da doença e envolvimento medular ao início da mobilização, tratamento prévio com radioterapia e exposição a análogos da platina não mostraram correlação significativa na resposta à mobilização. Após análise multivariada, as variáveis que permaneceram associadas com insucesso na mobilização foram: diagnóstico (P = 0,0232), número prévio de ciclos da quimioterapia (P = 0,0167), tratamento prévio com mitoxantrone (P = 0,0285) e contagem de plaquetas pré-mobilização < 150.000/mm3 (P = 0,0423). Conclusão: A carga cumulativa de quimioterapia administrada, exposição prévia à mitoxantrone, contagem de plaquetas pré-mobilização e diagnóstico foram os fatores independentes relacionados com a falha na resposta à mobilização. Os achados obtidos podem auxiliar no reconhecimento de pacientes de risco para resposta ruim à mobilização e permitir um planejamento alternativo ou mais agressivo no regime de mobilização para este grupo de pacientes. / Inadequate stem cells mobilization is seen in 10-30% of patients undergoing autotransplantation for hematologic malignancies. Factors affecting peripheral blood progenitor cell (PBSC) mobilization have not been clearly established. We retrospectively reviewed the data of patients treated by autologous bone marrow transplantation (BMT) with the aim to identify factors associated with poor PBSC mobilization. Design and Methods: We evaluated 307 patients with different diagnoses, submitted to autologous BMT between April 2001 and April 2007. PBSC were collected following mobilization with cyclophosphamide (60-120 mg/kg of weight IV) and granulocyte-colony stimulating factor (G-CSF) (dose of 6-17 ug/kg of weight/day SC). Success in mobilization was defined when > ou = a 2,0x10(6) CD34+ cells/(kg weight) could be collected from the peripheral blood with a maximum of three leukapheresis procedures. Clinical and laboratory parameters at the time of mobilization were analyzed for correlations with the number of CD34+ cells collected. Results: Two hundred and sixty patients (84.7%) presented success in mobilization. In this group, a median of 3.67 (2.0-46.0) CD34+ cells/(kg weight) was collected per patient in a median of 1(1-3) leukapheresis procedure. Poor response to mobilization was observed in 47 patients (15.3%): 24 (7.8%) were submitted to PBSC collection but didn\'t collected at least 2.0 x 106 CD34+ cells/(kg weight) with three leukapheresis procedures and 23 (7.5%) didn\'t reach an absolute number count of 10 CD34+ cells/mm3 in the peripheral blood to start collection by leukapheresis. In univariate analysis poorer PBSC mobilization was associated with diagnosis (Pp < 0.0001), time interval from the diagnosis to mobilization (P < 0.0001), number of cycles of previous chemotherapy (P = 0.0001), previous treatment with alkylating agents (P = 0.0003) and mitoxantrone (P = 0.0006), platelet count <150.000/mm3 before mobilization (P = 0.0006) and interval between mobilization and peak of CD34+ cells in peripheral blood (P < 0.0001). No significant correlation was found with age, gender, disease status, marrow involvement at mobilization, prior radiation therapy and exposition to platin analogues. In the stepwise regression model, diagnosis (P = 0.0232), number of cycles of previous chemotherapy (P = 0.0167), previous treatment with mitoxantrone (P = 0.0285) and platelet count <150.000/mm3 before mobilization (P = 0.0423) were found to be independent negative predictive factors for CD34+ cells mobilization. Conclusion: Cumulative load of chemotherapy, exposition to Mitoxantrone, platelet count just prior to mobilization and diagnosis were independent factors related to poor progenitor cells mobilization. These results could help in the previously recognition of patients at risk for poor or no response to mobilization and allow to plan an alternative or more aggressive regimen for this group of patients.

A proteína A de superfície de pneumococo (PspA) é indispensável para a virulência da bactéria e foi escolhida para a elaboração de uma nova vacina conjugada contra S. pneumoniae. Para tanto foi desenvolvido um processo industrial de produção e purificação do fragmento recombinante da PspA clado 3 em E. coli. Cultivos descontínuos alimentados foram estabelecidos com glicose ou glicerol em reator de 5L, obtendo-se 62g/L de células secas e 3g/L de PspA3. As células foram lisadas por homogeneizador contínuo de alta pressão com eficiência de 96,7%. A centrifugação foi definida como etapa de clarificação. A sequência cromatográfica troca aniônica seguida de afinidade por Ni+2 rendeu os melhores resultados de pureza (81%) e recuperação (70%). A cromatografia de troca catiônica foi selecionada como terceira etapa do processo, definindo assim um processo de produção e purificação escalonável que possibilitou a obtenção de PspA3 com alto grau de pureza (90%). / The pneumococcal surface protein A (PspA) is indispensable for virulence of S. pneumoniae and it was the first choice as carrier for a new conjugated vaccine against S.pneumoniae. Hence, the purpose of this work was to develop an industrial production and purification process of a recombinant fragment PspA clade 3 (rfPspA3) in E. coli. Fed-batch cultivations in 5 L bioreactors with defined medium were carried out using glucose or glycerol as carbon sources. It was obtained 62 g/L of dry cell weight and 3 g/L of rfPspA3. Cells were disrupted with 96.7% of efficiency by high pressure continuous homogenizer. Centrifugation was defined for the clarification step. The sequence with Q- followed by IMAC-Sepharose yielded the best purity and recovery of rfPspA3 (81 and 70%, respectively). Cation exchange was chosen for the last chromatography. In conclusion, an industrial production and purification process was developed and rfPspA3 was obtained with high purity (90%).

Os vírus são eficazes na transferência de genes em células devido aos seus mecanismos especializados. No entanto, vírus como veículos de entrega de genes podem acarretar em problemas, particularmente quando proposto para reprogramar células somáticas em células-tronco pluripotentes induzidas (iPS) visando utilização terapêutica. No presente estudo, procurou-se desenvolver um sistema alternativo para entregar diretamente proteínas nucleares (Oct4, Sox2, KLF4, e c-Myc) fusionadas com o domínio de transdução de proteína TAT, para promover a reprogramação de fibroblastos embrionários de camundongos (MEF) ou células mesenquimais derivadas de tecido adiposo humano (hASC) em células iPS. Primeiramente o PTD TAT ou TAT- foi fundido a proteína verde fluorescente (GFP) como modelo para prova de princípio e padronização detalhada. Inesperadamente, TAT-GFP produzido e secretado pelas células NIH-3T3 produtora não foi capaz de ser detectado no meio de cultura por verificação quantitativa fluorimétrica, nem foi capaz de ser detectada em células-alvo, por citometria de fluxo, depois de co-cultura em transwells. Essa observação pode ser explicada por: (1) ineficiência desse tipo de célula em secretar proteínas e (2) falta de resistência à clivagem por endoproteases furinas. Para contornar esses fatores limitantes usou-se citometria de fluxo para avaliar as melhores condições para a transfecção por seis diferentes tipos de células (CHO, NIH-3T3, HT1080, HEK-293A, HEK-293t e COS-7) com TAT (modificada para ser resistente à furinas) fundido a GFP. Células 293t-TAT-GFP exibiram a maior eficiência de transfecção e também de secreção. O mesmo pôde ser observado para as seis linhagens celulares expressando fatores de transcrição nucleares TAT, determinados por ELISA. Em seguida, diferentes estratégias de entrega foram testadas. A primeira foi baseada na co-cultura de uma mistura de células produtoras com MEF ou hASC. No entanto, não foi possível observar a reprogramação devido à morte celular. A segunda foi baseada na concentração de meio condicionado de cultura de células por centrifugação usando colunas Amicon, trocando o meio a cada 24h, em quatro ciclos. No entanto, apesar da presença de algumas colônias após 20-30 dias, nenhuma colônia verdadeira iPS foi obtida. Na sequência, as células foram tratadas com cada proteína de forma independente, e as demais foram substituídas pelo retrovírus correspondente, trocando meio a cada 72h, em quatro ciclos. Essa estratégia, apesar de permitir verificar a função de cada proteína, também não resultou em reprogramação. Este achado pode ser explicado pela diferenciação celular induzida por BCS, que também é concentrado no processo. Assim, passou-se a adaptação de \"células produtoras\" em condições de cultura livre de soro, para enriquecer a produção dos fatores nucleares individuais, necessários para a reprogramação. A otimização sistematizada deste processo está sendo realizada em parceria com o IPT e deve resultar em quantidades de proteína de fusão suficientes para o teste final da hipótese proposta. Em conjunto, são apresentados os dados da geração de linhagens celulares expressando estavelmente os vários fatores de transcrição e estratégias para melhorar a eficiência necessária para a produção iPS. Esta nova estratégia garante uma produção eficiente de TAT fundida a fatores nucleares de reprogramação e sua eficácia para promover a reprogramação de células somáticas de maneira livre de vírus merece ser investigado futuramente / Viruses are effective at transferring genes into cells by its specialized mechanisms. However, viruses as gene delivery vehicles entail problems, particularly when proposed to reprogram somatic cells into induced pluripotent stem cells (iPS) for therapeutic uses. In the present study, we aimed to develop an alternative system for directly delivering nuclear proteins (Oct4, Sox2, Klf4, and c-Myc) fused with TAT protein transduction domain to promote reprogramming of mouse embryonic fibroblasts (MEF) or human adipose tissue derived mesenchymal cells (hASC) into iPS cells. First TAT- or TAT- PTD was fused to green fluorescent protein (GFP) as a proof of principle model and for detailed standardization. Unexpectedly, TAT-GFP produced and secreted by NIH-3T3 producer cells was not detected in the culture medium by quantitative fluorimetric verification, nor detected on target cells, by flow cytometry, after being co-cultured using transwells. This observation maybe explained by: (1) inefficiency of this cell type to be transfected and to secrete proteins and (2) lack of resistance to furin endoproteases cleavage on Golgi of TAT sequence. To circumvent these limiting factors we used flow cytometer to assess the best conditions for transfection in six different cell types (CHO, NIH-3T3, HT1080, HEK-293A, HEK-293t and COS-7) with TAT- (a modified PTD to be resistant to furin endoproteases) fused to GFP. 293t-TAT-GFP cells displayed the highest transfection efficiency and secretion levels. The same could be observed for the six cell lineages expressing TAT- nuclear transcription factors, determined by ELISA.Next, different delivery strategies were tested for TAT- nuclear transcription factor system. Co-culturing a mix of producer cells with MEF or hASC resulted in not reprogramming and this was associated with cell death. The second was based on the use of microconcentrated conditioned cell culture medium, changed every 24h, in four cycles. However, despite the presence of some emerging colonies after 20-30 days, no true iPS colonies were obtained. Then, cells were treated with each protein independently, and the others were replaced by the corresponding retrovirus, changing cell medium every 72h, in four cycles. We verified the reprogramming potential of each protein, but no true colonies were obtained.One possibility for this finding is that BCS is also concentrated by centrifugation and may induce cell differentiation. To circumvent these problems, we have started the adaptation of producer cells in a serum-free culture condition to enrich the production of the individual factors required for reprogramming. This optimization process is taking place in collaboration with the IPT and shall result in large amounts of the fusion protein to finally test the proposed hypothesis. Altogether, we presented the generation of several cell lines stably expressing the transcription factors and strategies to improve the efficiency required for iPS production. This novel strategy guarantees efficient production of TAT-fused reprogramming nuclear factors and its efficacy to promote somatic cells reprogramming in a virus-free manner deserves to be further investigated

Carrapatos são parasitas hematófagos transmissores de doenças para humanos e animais, e responsáveis por prejuízos econômicos de bilhões de dólares para os sistemas pecuários mundiais. A emergência de carrapatos multirresistentes a acaricidas torna urgente o desenvolvimento de vacinas efetivas contra este parasita. Neste trabalho, nós utilizamos dados de sialotranscriptomas de carrapatos R. microplus para selecionar antígenos secretados pelo parasita para serem testados como uma vacina multicomponente. Os antígenos produzidos de forma recombinante em E. coli foram utilizados como imunógenos em animais suscetíveis à carrapatos para testes de proteção vacinal contra infestações por R. microplus em bovinos e por R. sanguineus em cães. No primeiro ensaio, bovinos imunizados com oito antígenos recombinantes adjuvantados com um polímero sintético apresentaram indução de IgG sérica específica para cinco antígenos, e redução de 22% na infestação por carrapatos R. microplus. No segundo ensaio, a imunização de bovinos com nove antígenos adjuvantados com sais de alumínio gerou IgG específica para todos os antígenos inoculados, e proteção vacinal crescente de 70% e 75% em duas infestações sucessivas com carrapatos R. microplus, sem revacinação, indicando boost natural pela infestação. No terceiro ensaio, a imunização de cães com nove antígenos recombinantes associados à hidróxido de alumínio induziu a soroconversão de IgG dos animais para todos os antígenos, e proteção vacinal de 36% contra a infestação por carrapatos R. sanguineus. Todas as formulações afetaram principalmente o número de fêmeas ingurgitadas após a infestação. O efeito protetor de antígenos derivados de carrapatos R. microplus sobre carrapatos R. sanguineus (proteção cruzada) indica ser possível o desenvolvimento de uma vacina multicomponente efetiva contra os dois parasitas. / Ticks are hematophagous parasites which transmit diseases to humans and animals, and are responsible for billions of dollars of damage to the world\'s livestock systems. The emergence of ticks resistant to multiple acaricides makes urgent the development of effective vaccines against this parasite. In this work, we used data from the R. microplus tick sialotranscriptome to select antigens secreted by the parasite to be tested as a multicomponent vaccine. Recombinant antigens expressed in E. coli were used as antigens in tick\'s susceptible hosts to evaluate it efficacy in protect animals against R. microplus and R. sanguineus infestations. In the first assay, bovines immunized with eight recombinant antigens adjuvanted with a synthetic polymer presented the induction of serum IgG reactive for five antigens, and reduction of R. microplus infestation in 22%. In the second trial, immunization of cattle with nine antigens adjuvanted with aluminum salts generated serum IgG against all antigens, and vaccine protection against R. microplus parasitism was calculated in 70% and 75% for each infestation. In the third trial, the immunization of dogs with recombinant antigens adjuvanted with aluminum hydroxide induced IgG seroconversion against all antigens, and a 36% of protection against infestation by R. sanguineus ticks in immunized animals. All formulations reduced mainly the number of engorged females recovered from infestation. The cross reactive protection induced by R. microplus derived antigens R. sanguineus tick infestation indicate that it is possible to develop a unique multicomponent vaccine against the two parasites.

O sistema de expressão gênica derivado do Semliki Forest Vírus (SFV) vem sendo muito utilizado nos últimos tempos para expressão em grandes quantidades de inúmeras proteínas, quando comparado com outros sistemas. O objetivo desse estudo foi otimizar a capacidade desse vetor viral de expressar proteínas em diferentes linhagens celulares de mamíferos, utilizando como alvo, a glicoproteína do vírus rábico (RVGP). Foram avaliadas formas de obtenção do vetor SFV recombinante, através de diferentes métodos de transfecção, como eletroporação e lipofecção, utilizando um lipossomo comercial chamado Transmessenger (Qiagen, Valencia, CA., U.S.A.). Foi estabelecido, um método rápido e preciso de quantificação das partículas virais, através da técnica de qPCR, para padronizar a relação entre a quantidade de vírus recombinante a ser utilizada em um processo de infecção, visando aumentar os níveis de produção da proteína heteróloga. Diferentes proporções entre vírus e células foram utilizadas em cinco linhagens distintas: BHK-21, Huh-7, VERO, L929 e HEK-293T; sendo avaliados dois tempos de coleta da RVGP após a infecção (24 e 48 h). A proteína gerada foi avaliada através de diferentes métodos como Western Blot, Dot blot e imunofluorescência indireta (IFI), sendo a quantificação da proteína realizada através de ensaio imunoenzimático (ELISA). Esse trabalho contribui para o desenvolvimento de abordagens que utilizam o SFV como vetor de expressão, indicando as melhores metodologias e linhagens celulares, que podem ser utilizadas para aplicação na produção das mais variadas proteínas. / The expression system based on Semliki Forest virus (SFV) is a system which has been widely used in recent times for expression of many proteins in large quantities as compared with other systems. The aim of this study was to optimize the capacity of this vector to express viral proteins in different mammalian cell lines, using as target, the rabies virus glycoprotein (RVGP). We assessed two different methods of transfection to obtain recombinant SFV vector, such as electroporation and liposome commercial Transmessenger (Qiagen, Valencia, CA., U.S.A.). It was established also a fast and accurate quantification of viral particles by qPCR technique, to improve the relation between the amount of recombinant virus to be used in a process of infection, to increase production levels of the heterologous protein. Different proportions between viruses and cells were used in five distinct lineages: BHK-21, Huh-7, Vero, L929 and HEK-293T; being evaluated two sampling times after infection of RVGP (24 e 48 h). The protein was assessed by various methods such as Western blot, Dot blot and indirect immunofluorescence (IIF), and the protein quantification performed by enzyme immunoassay (ELISA). This work contributes to the development of approaches to using the SFV expression vector indicating the best methods and cell lines that can be used for application in the production of various proteins.

O grupo de organoclorados, Bifenilas Policloradas (PCBs) é de difícil degradação e persistente no meio ambiente, tendo sido associado a diversos problemas nos organismos devido ao potencial toxicológico. Biodegradação constitui uma ferramenta eficaz e barata para remoção destes contaminantes do ambiente. O isolado RHA1 (fcb) de Rhodococcus sp. foi geneticamente construído com a introdução do operon de degradação hidrolítica de 4-clorobenzoato (fcb) para evitar a formação de produtos tóxicos durante a degradação de ácidos clorobenzóicos. Com o intuito de se obter informações sobre o processo adaptativo do recombinante Rhodococcus sp. isolado RHA1 (fcb) em substratos contendo PCBs, foram feitos dois ensaios avaliando-se a sobrevivência e o crescimento deste isolado. Rhodococcus sp. isolado RHA1 (fcb) foi inoculado (104 células.g-1) em substrato turfoso previamente irradiado a 50 KGy, contendo ou não 200 mg.Kg-1 de bifenilo. Em outro ensaio, além do recombinante, as bactérias Escherichia coli e Arthrobacter sp. foram inoculados em sedimento coletado na região do Estuário de Santos, contendo PHAs e PCBs, também irradiado (50 KGy). O crescimento das bactérias em ambos os substratos foi monitorado através de contagem de Unidades Formadoras de Colônias (UFCs). Algumas colônias eram selecionadas aleatoriamente para extração de DNA, detecção do operon fcb através de amplificação por PCR e sequenciamento do gene 16S rRNA. Aumento no número de UFCs nos tratamentos inoculados com o recombinante foi observado até 150 dias no ensaio com substrato turfoso e 70 dias na amostra ambiental. Entretanto, houve queda no número de UFCs após os 10 dias nos tratamentos inoculados com E. coli e Arthrobacter sp. Os genes fcbA e fcbB do operon fcb foram detectados nas colônias isoladas dos tratamentos inoculados com o isolado RHA1 (fcb) em ambos os substratos. A análise das seqüências pertencentes às colônias isoladas do tratamento inoculado com o isolado RHA1 (fcb) feita através de BLAST nos sites do NCBI e Ribossomal Database Project, apresentou 99% de identidade com a seqüência do gene ribossomal 16S de Rhodococcus sp. isolado ZC–3 (AM076672.1). Somente as seqüências referentes ao tratamento inoculado com E. coli foram analisadas, as quais apresentaram 99% de identidade com a seqüência do gene ribossomal 16S de E. coli isolado K-12 MG 1655 (U00096.2). Estes resultados sugerem que Rhodococcus sp. isolado RHA1 (fcb) cresce na turfa irradiada (até 150 dias) na presença e ausência de PCB e nesta amostra de sedimento irradiada (até 70 dias), com aparente estabilidade do operon fcb durante este período e nestas condições. A possível presença dos genes fcbB e fcbA em bactérias nativas crescidas em meio K1 com ácido 4- clorobenzóico isoladas do sedimento antes da irradiação, sugere a presença de bactérias do local com potencial biodegradador deste composto. / The group of organochlorates Biphenyl Polychlorates (PCBs) is of difficult degradation and persistent in the environment, being associated to several problems in the organisms due to its toxicological potential. The isolate RHA1 (fcb) from Rhodococcus sp. was genetically built with the introduction of the operon of hydrolytic degradation 4-chlorobenzoate (fcb) to avoid the formation of toxic products during the degradation of chlorobenzoic acids. In order to obtain information about the adaptative process of the recombinant Rhodococcus sp. isolate RHA1 (fcb) in substrates containing PCBs, two essays were made evaluating the survival and growth of this isolate. Rhodococcus sp. isolate RHA1 (fcb) was inoculated (104 cells.g-1) in peat substrate previously irradiated with 50 kGy, with and without 200 mg.kg-1 of biphenyl. In another essay, besides of the recombinant, the bacteria Escherichia coli and Arthrobacter sp. were inoculated in soil, also irradiated (50 kGy), from the Estuário de Santos region containing PHAs and PCBs. The growth of the bacteria in both substrates was monitorated counting the Colony Forming Units (CFUs). Some colonies were selected randomly for DNA extraction, fcb operon detection through PCR, and sequencing of the 16S rRNA gene. Rising in the number of CFUs in the recombinant inoculated treatments was observed until 150 days in the essay with peat substrate, and until 70 days in the environmental sample. Nonetheless, there was a reduction in the number of CFUs after 10 days in the treatment inoculated with E. coli and Arthrobacter sp. The genes fcbA and fcbB from the operon fcb were detected in the isolated colonies of the treatments inoculated with the isolate RHA1 (fcb) in both substrates. The analysis of the sequences belonging to the colonies isolated from the treatment inoculated with the isolate RHA1 (fcb) through BLAST in the NCBI and Ribosomal Database Project sites showed 99% identity with the sequence of the gene 16S ribosomal from Rhodococcus sp. isolate ZC-3 (AM076672.1). Only the sequences referring to the treatment inoculated with E. coli were analyzed, which showed 99% identity with the sequence of the 16S ribosomal gene from E. coli isolate K-12 MG 1655 (U00096.2). These results suggest that Rhodococcus sp. isolate RHA1 (fcb) grows in the peat irradiated (until 150 days), in the presence and absence of PCB and in this irradiated sediment sample (until 70 days), with apparent stability of the fcb operon during this period and in these conditions. The possible presence of the fcbA and fcbB genes in native bacteria grown in K1 medium with 4-chlorobenzoate acid isolated from sediment before irradiation suggests the presence of native bacteria with biodegradation potential of this compound.

Carrapatos são parasitas hematófagos transmissores de doenças para humanos e animais, e responsáveis por prejuízos econômicos de bilhões de dólares para os sistemas pecuários mundiais. A emergência de carrapatos multirresistentes a acaricidas torna urgente o desenvolvimento de vacinas efetivas contra este parasita. Neste trabalho, nós utilizamos dados de sialotranscriptomas de carrapatos R. microplus para selecionar antígenos secretados pelo parasita para serem testados como uma vacina multicomponente. Os antígenos produzidos de forma recombinante em E. coli foram utilizados como imunógenos em animais suscetíveis à carrapatos para testes de proteção vacinal contra infestações por R. microplus em bovinos e por R. sanguineus em cães. No primeiro ensaio, bovinos imunizados com oito antígenos recombinantes adjuvantados com um polímero sintético apresentaram indução de IgG sérica específica para cinco antígenos, e redução de 22% na infestação por carrapatos R. microplus. No segundo ensaio, a imunização de bovinos com nove antígenos adjuvantados com sais de alumínio gerou IgG específica para todos os antígenos inoculados, e proteção vacinal crescente de 70% e 75% em duas infestações sucessivas com carrapatos R. microplus, sem revacinação, indicando boost natural pela infestação. No terceiro ensaio, a imunização de cães com nove antígenos recombinantes associados à hidróxido de alumínio induziu a soroconversão de IgG dos animais para todos os antígenos, e proteção vacinal de 36% contra a infestação por carrapatos R. sanguineus. Todas as formulações afetaram principalmente o número de fêmeas ingurgitadas após a infestação. O efeito protetor de antígenos derivados de carrapatos R. microplus sobre carrapatos R. sanguineus (proteção cruzada) indica ser possível o desenvolvimento de uma vacina multicomponente efetiva contra os dois parasitas. / Ticks are hematophagous parasites which transmit diseases to humans and animals, and are responsible for billions of dollars of damage to the world\'s livestock systems. The emergence of ticks resistant to multiple acaricides makes urgent the development of effective vaccines against this parasite. In this work, we used data from the R. microplus tick sialotranscriptome to select antigens secreted by the parasite to be tested as a multicomponent vaccine. Recombinant antigens expressed in E. coli were used as antigens in tick\'s susceptible hosts to evaluate it efficacy in protect animals against R. microplus and R. sanguineus infestations. In the first assay, bovines immunized with eight recombinant antigens adjuvanted with a synthetic polymer presented the induction of serum IgG reactive for five antigens, and reduction of R. microplus infestation in 22%. In the second trial, immunization of cattle with nine antigens adjuvanted with aluminum salts generated serum IgG against all antigens, and vaccine protection against R. microplus parasitism was calculated in 70% and 75% for each infestation. In the third trial, the immunization of dogs with recombinant antigens adjuvanted with aluminum hydroxide induced IgG seroconversion against all antigens, and a 36% of protection against infestation by R. sanguineus ticks in immunized animals. All formulations reduced mainly the number of engorged females recovered from infestation. The cross reactive protection induced by R. microplus derived antigens R. sanguineus tick infestation indicate that it is possible to develop a unique multicomponent vaccine against the two parasites.

O aumento na procura por produtos naturais pelo mercado farmacêutico, cosmético e alimentício demanda pesquisas no desenvolvimento desses produtos. Esses são direcionados à obtenção de substâncias de origem vegetal ou animal, assim como, para produtos biotecnológicos. Investigações quanto à atividade antibacteriana de proteínas e peptídeos são realizadas. Dentre essas substancias, podemos citar as lisozimas, proteínas que hidrolisam as ligações &#946; 1-4 glicosídicas entre o ácido N-acetilmurâmico e N-acetilglicosamina, presentes no peptidoglicano da parede celular bacteriana. Além disso, apresentam atividade de quitinase, ou seja, quebram a ligação glicosídica da quitina presente na parede fúngica. As lisozimas apresentam alta especificidade pela parede microbiana indicando aparente ausência de efeitos tóxicos aos humanos. Assim, tornando-a candidata a agente antimicrobiano em formulações cosméticas e farmacêuticas. A lisozima de ovo de galinha tem atividade antimicrobiana, entretanto não havia estudos relacionados com os micro-organismos contaminantes normalmente encontrados em produtos farmacêuticos e cosméticos. Além disso, a lisozima recombinante de Musca domestica (MdL1) não possui ainda sua atividade antimicrobiana definida. Os objetivos do trabalho foram:1) Obtenção da lisozima recombinante de Musca domestica (MdL1); 2) Avaliação a atividade antimicrobiana da MdL1 e de lisozima de ovo de galinha, Hen Egg White Lysozyme (HEWL), frente à Staphylococcus aureus (ATCC 6538), Micrococcus luteus (ATCC 4698), Pseudomonas aeruginosa (ATCC 9027), Escherichia coli (ATCC 8739), Candida albicans (ATCC 10231) e Aspergillus niger (ATCC 16404); 3) Avaliação da toxicidade da lisozima em cultura de células de fibroblastos (ATCC CCL-92). A MdL1 foi obtida por meio de expressão gênica em Pichia pastoris GS115 (Invitrogen), concentrada utilizando polietilenoglicol 6000 e dialisada contra água deionizada através da membrana com porosidade seletiva de 12kDa. A homogeneidade foi analisada por eletroforese em gel de poliacrilamida em condições desnaturantes; e a atividade catalítica foi avaliada utilizando células liofilizadas de Micrococcus luteus como substrato. A atividade antimicrobiana foi determinada por método específico para cada enzima. A toxicidade in vitro das amostras foi avaliada pela viabilidade celular de fibroblastos ATCC CCL-92. A MdL1 obtida apresentou características de homogeneidade adequadas e atividade de 108,35 U/mg. A HEWL mostrou-se ativa contra S. aureus, M. luteus e C. albicans. A MdL1 apresentou-se ativa contra M. luteus, apenas. Devido a ausência de atividade antimicrobiana a MdL1 não foi submetida a avaliação citotóxica. Em relação à HEWL não demonstrou citotoxicidade na avaliação prévia realizada. / The increase in the search for natural products by pharmaceutical, cosmetic and food markets requires researches in these products development. These are directed to obtaining substances of vegetal or animal origin, as well as biotechnological products. The research in relation to antibacterial activity of proteins and peptides is carried out. Among these substances, it is possible to mention the lysozyme, protein that catalyze the break of 1,4-beta-D glucosidic bond between N-acetylmuramic acid and N-acetilglicosamine which are present in peptidoglicane of the bacterial cell wall. Besides, there is kitinase activity, that is, they break the glicosidic bond of chitin which is present in fungal wall. The lysozymes show high specificity by microbial wall indicating apparent absence of toxicological effects to human beings. Therefore, it becomes the candidate to antimicrobial ingredient in cosmetic and pharmaceutical dosage forms. The hen egg white lysozyme has antimicrobial activity, however there were no studies related to spoiled microorganism usually found in pharmaceutical and cosmetic products. In addition, there were not studies about microbial activity of recombinant Musca domestica lysozyme 1 (MdL1). The aim of this research was: 1) To obtain MdL1; 2) Evaluation of MdL1 and hen egg white lysozyme (HEWL) antimicrobial activity against Staphylococcus aureus (ATCC 6538), Micrococcus luteus (ATCC 4698), Pseudomonas aeruginosa (ATCC 9027), Escherichia coli (ATCC 8739), Candida albicans (ATCC 10231) e Aspergillus niger (ATCC 16404); 3) Evaluation of lysozyme toxicity in fibroblast cells culture (ATCC CCL-92). The MdL1 was expressed as recombinant protein in Pichia pastoris GS115 (Invitrogen), concentrated using polyethylene glycol 6000 and dialyzed against deionized water through the selective porosity of 12kDa membrane. The homogeneity was analyzed by electrophoresis in sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) and the catalytic activity was evaluated using lyophilized cells of Micrococcus luteus as substract. The antimicrobial activity was evaluated using specific methods for each enzyme. The sample toxicity was evaluated by cell viability using ATCC CCL-92 fibroblasts. The MdL1 obtained presented suitable homogeneity characteristics and activity of 108.35 U/mg. The HEWL has showed activity against S. aureus, M. luteus e C. albicans. MdL1 only showed activity against M. luteus. Due to the absence of antimicrobial activity of MdL1 in the evaluated concentration it was not submitted to the cytotoxicity test. Regarding HEWL, it has not showed citotoxicity in the previous test.

Os primeiros vasos sanguíneos do embrião de vertebrados, formados de novo a partir de células originadas da mesoderme, originam os vasos linfáticos em um processo denominado vasculogênese. Já no adulto, novos vasos são formados principalmente através da angiogênese (ou linfoangiogênese) a partir da vasculatura pré-existente. Em indivíduos saudáveis, a arquitetura vascular é relativamente estática, sendo que o excesso ou a insuficiência de vasos são comumente relacionados à angiogênese patológica, vinculada a diversas doenças, como câncer, degeneração macular relacionada à idade, isquemia de membros e muitas outras. Dessa forma, o controle local da densidade de vasos sanguíneos torna-se interessante para o tratamento de condições patológicas visando melhoria de prognóstico e cura. Dentre os diversos fatores de crescimento conhecidos, o fator de crescimento endotelial vascular, VEGF, destaca-se como o principal regulador do processo de angiogênese através de isoformas pró-angiogênicas (VEGFxxx) e antiangiogênicas (VEGFxxxb) do gene VEGF-A. Consequentemente, as proteínas codificadas por esse gene constituem um alvo com alto potencial terapêutico. No presente estudo, propusemos a produção das isoformas proteicas recombinantes rhVEGF165, rhVEGF165b e rhVEGF121, oriundas do gene VEGF-A humano, visando à geração de biofármacos que podem ser utilizados para terapia molecular e engenharia tecidual. As sequências codificadoras das isoformas rhVEGF165 e rhVEGF121 foram amplificadas a partir do cDNA total sintetizado de amostras de RNA total de pulmão humano, enquanto que a da isoforma rhVEGF165b foi gerada através da mutação sítio-dirigida da sequência de rhVEGF165. As sequências foram clonadas no vetor de clonagem pGEM®-T Easy, sendo em seguida subclonadas no vetor pLV-eGFP, um vetor plasmidial de transferência lentiviral, que permite a expressão de transgenes em células de mamíferos e, também, da proteína repórter eGFP. Células humanas HEK293 em cultura aderente foram independentemente cotransfectadas com cada uma das construções geradas (pLV-rhVEGF165, pLV-rhVEGF165b e pLV-rhVEGFl21) juntamente com o vetor pTK-Hyg na proporção de 40:1 (m/m), viabilizando a seleção dos transfectantes com o antibiótico higromicina B, além da detecção de eGFP. Os clones celulares superprodutores das proteínas de interesse foram avaliados quanto à cinética de expressão em meio carente de soro e adaptados para a cultura em suspensão estática na presença de meio na ausência de componentes derivados de animais, demostrando a capacidade de expressão das isoformas rhVEGFs nestas condições de cultivo. Para o nosso conhecimento, este é o primeiro trabalho a descrever a expressão de isoformas de VEGF-A em células HEK293 mantidas em suspensão. As isoformas rhVEGF165 e rhVEGF165b foram purificadas por cromatografia de afinidade a heparina, a partir do meio condicionado pelos clones superprodutores gerados. Ensaios in vitro, utilizando o AngioPhaseTM Kit, e in vivo, através do ensaio da membrana corioalantoide em embriões de galinha (CAM Assay), ambos próprios para avaliação da atividade pró- e antiangiogênica de diferentes compostos, demonstraram que a isoforma rhVEGF165 possui atividade biológica, enquanto a isoforma rhVEGF165b não apresentou a atividade esperada (inibição da angiogênese). Estas isoformas foram testadas em modelo murino de engenharia tecidual do intestino curto, com indícios de que poderiam contribuir para o uso terapêutico neste contexto. A purificação da isoforma rhVEGF121, bem como as análises estruturais das proteínas produzidas, estão em processo de otimização. / The first blood vessels of the vertebrate embryo are formed de novo from mesoderm-derived cells and give rise to lymph vessels in a process termed vasculogenesis. In the adult, new blood vessels are formed mainly through angiogenesis (or lymphangiogenesis) from the pre-existing vasculature. In healthy individuals, the vascular architecture is fairly static, and both the excess and the insufficiency of vessels comprise a pathological angiogenic state, to which is credited the onset and/or progression of several diseases such as cancer, age-related macular degeneration, limb ischemia, and many others. Therefore, locally controlling the blood vessel density becomes interesting for the treatment of pathological conditions aiming at prognosis improvement and cure. Among the various known growth factors, the vascular endothelial growth factor, VEGF, stands out as the major regulator of the angiogenic process. This process is mediated through the action of pro- (VEGFxxx) and antiangiogenic (VEGFxxxb) isoforms, which are derived from the VEGF-A gene. Consequently, the proteins encoded by this gene are potential therapeutic targets. In this work, we set out to produce the recombinant protein isoforms rhVEGF165, rhVEGF165b, and rhVEGF121, which originate from the human VEGF-A gene, with the aim of generating biopharmaceuticals to be used for molecular therapy and tissue engineering. The rhVEGF165 and rhVEGF121 coding sequences were amplified from total cDNA sythesized from human lung total RNA. Conversely, the rhVEGF165b coding sequence was generated by site-directed mutagenesis of the rhVEGF165 sequence. The sequences were cloned into the pGEM®-T Easy cloning vector. These cDNAs were then subcloned into pLV-eGFP, a plasmid lentiviral transfer vector that allows for expression of transgenes and the eGFP reporter protein in mammalian cells. Human HEK293 cells cultivated under adherent conditions were independently co-transfected with each of the obtained constructs (pLV-rhVEGF165, pLV-rhVEGF165b, and pLV-rhVEGF121) and the pTK-Hyg vector at a proportion of 40:1 (m/m), enabling for the selection of transfectants with hygromycin B, apart from the detection of eGFP. The cell clones overexpressing the proteins of interest were evaluated for expression kinetics in serum-deprived conditioned media and adapted to static suspension culture in medium free of animal-derived components, demonstrating that expression of the protein isoforms was possible in these culture conditions. To the best of our knowledge, this is the first work that describes the expression of VEGF-A isoforms in HEK293 cells in suspension culture. The rhVEGF165 and rhVEGF165b isoforms were purified by affinity chromatography from media previously conditioned by the overexpressing cell clones. The biological activity of rhVEGF165 was demonstrated in vitro, by the AngioPhaseTM Kit assay, and in vivo with the CAM (chorioallantoic membrane) assay, both of which are suitable for evaluating the pro- and antiangiogenic activity of different compounds. The rhVEGF165b did not show the expected antiangiogenic activity. These isoforms were tested in a model of murine tissue-engineered small intestine, indicating a possible contribution to therapeutic use in this context. The purification of rhVEGF121, as well as the structural analysis of all three proteins, are in the process of being optimized.