A leptospirose é a zoonose mais disseminada no mundo e uma das principais causas de perda econômica no agronegócio. O estudo de novos antígenos de superfície de Leptospira interrogans, é intrigante e pode fornecer conhecimento na interação inicial patógeno-hospedeiro. Os genes LIC13059 e LIC10879, escolhidos por bioinformática, com predição de localização na superfície celular, foram clonados e as proteínas recombinantes expressas em E. coli, para avaliar a interação com componentes do hospedeiro. Após purificação, as proteínas encontravam-se estruturadas e foram reconhecidas por soro de indivíduos infectados. As proteínas recombinantes interagem com plasminogênio, fibrinogênio e laminina. rLIC13059, nomeada Lsa25.6, quando ligada ao fibrinogênio é capaz de inibir a formação de coágulo de fibrina e rLIC10879, nomeada Lsa16, interage com e-caderina, sugerido envolvimento na cascata de coagulação e ligação com o hospedeiro, respectivamente. O plasminogênio ligado às proteínas é convertido em plasmina, o que poderia ajudar a penetração bacteriana no hospedeiro. / Leptospirosis is the most widespread zoonosis and also a major cause of economic loss in animal production worldwide. The study of new surface antigens of Leptospira interrogans is intriguing and may shed light into the initial pathogen-host interactions. We set out to study two novel coding sequences LIC13059 and LIC10879 predicted to be located at the cell surface. The genes were cloned and the recombinant proteins were expressed in E. coli. The purified recombinant proteins presented secondary structures, and interacted with plasminogen, fibrinogen and laminin human components. rLIC13059, named Lsa25.6, when bound to fibrinogen was capable of inhibiting the formation of fibrin clot, while rLIC10879, named Lsa16, interacted with e-cadherin, a mammalian cell receptor, suggesting participation in coagulation pathway and host-cell binding, respectively. The plasminogen captured by both recombinant proteins could be converted into plasmin, a mechanism that could help bacterial penetration in the host.

Thèse (M.Sc.)--Université Laval, 2007. / Résumé en français ou en anglais. Bibliogr.: f. [101]-105. Publié aussi en version électronique dans la Collection Mémoires et thèses électroniques.

Made available in DSpace on 2016-08-17T18:39:28Z (GMT). No. of bitstreams: 1 DissMKA.pdf: 1355556 bytes, checksum: 015ec3f0d664f509359ce4430140c3c1 (MD5) Previous issue date: 2007-03-14 / Financiadora de Estudos e Projetos / The development of the biotechnology has permitted to achieve, among other biotechnological products, many recombinant proteins which are largely used as vaccines, hormones, enzymes and other ways of human therapeutic activity. This is possible because the multidisciplinary: through the technology of the recombinant DNA the region that encode gene of interest is cloned in a system of adequate expression for super-expression of the correspondent protein and, through the technology of bioprocess is possible to increase the obtaining scale of the recombinant product assuring its reproducibility, integrity and functionality. Involving these two areas of knowledge, this works intends to express an heterolog protein, the Canacistatina, deriving from sugar cane, through an eucariotic expression system Sf9/baculovirus. This implies in the construction of a recombining baculovirus, containing the cDNA which codifies to the Canacistatina, and also the characterization of the cultivation of Sf9 cells, and of the process of infection by baculovirus, in kinetics and physiologic therms. In order to obtain these purposes it was done experiments of cultivation of Sf9 cells in Schott bottles of 100 mL, with work volume of 20 mL, in 27° C. In these experiments it was analyzed the optimum conditions of velocity agitation, inoculum s density, culture environment, and also the role of substrates. In relation to these parameters, it was observed that a better cell growth can be conduced in a 100 rpm of agitation, in an inoculum s density of 1x106 cell/ml, using a combination of 1:1 between the mediums SF900 II and TNM-FH (Medium 50%), without the necessity of addition of Bovine Fetal Sorum. This last aspect represents a great advantage in relation to the bioprocesses, in a way that it uses Sf9 cells already known. It was construed the recombining baculovírus containing the Canacistatina s gene through the modified genome of the baculovirus Autographa californica Multiple Nuclear Polihedrosis Virus and the infection experiments of Sf9 cells was made under three MOI values (1, 5 e 10 pfu/cell) in the two culture mediums. The betters results indicates to infection of Sf9 cells in 50% Medium using MOI= 5 pfu/cell, conditions that the Canacistatina s productivity reached 28 µg/106cel. / O desenvolvimento da biotecnologia tem permitido a obtenção, entre tantos produtos biotecnológicos, de muitas proteínas recombinantes utilizadas amplamente como vacinas, hormônios, enzimas e outras formas de atividade terapêutica humana. Isto é possível através da multidisciplinaridade, onde por tecnologia do DNA recombinante clona-se a região codificadora do gene de interesse em um sistema de expressão adequado para super-expressão da proteína correspondente e, pela tecnologia de bioprocessos torna-se possível o aumento de escala de obtenção do produto recombinante, garantindo sua reprodutibilidade, integridade e funcionalidade. Envolvendo estas duas áreas do conhecimento, o presente trabalho tem como objetivo a expressão de uma proteína heteróloga, a Canacistatina, natural da cana-de-açúcar, através do sistema de expressão eucariótico células Sf9/baculovírus. Isto abrange a construção de um baculovírus recombinante, contendo o cDNA que codifica para a Canacistatina, e a caracterização do cultivo de células Sf9 e do processo de infecção por baculovírus, em termos cinéticos e fisiológicos. Para estes fins, foram realizados experimentos de cultivo de células Sf9 em frascos Schott de 100 mL, com volume de trabalho de 20 mL, a 27ºC, nos quais foram analisadas as condições ótimas de velocidade agitação, densidade de inóculo, meio de cultura e também o papel dos substratos, obtendo-se que um crescimento celular otimizado pode ser conduzido a 100 rpm de agitação, com densidade de inóculo de 1x106 cel/ml e utilizando uma combinação 1:1 entre os meios SF900 II e TNM-FH (Meio 50%), sem a necessidade de adição de Soro Fetal Bovino. Este último aspecto representa uma grande vantagem em relação aos bioprocessos utilizando células Sf9 já conhecidos. Foi construído o baculovírus recombinante contendo o gene da Canacistatina a partir do genoma modificado de Autographa californica Multiple Nuclear Polihedrosis Virus e os experimentos de infecção de células Sf9 foram realizados sob três valores de MOI (1, 5 e 10 pfu/cel) nos dois meios de cultura. Os melhores resultados obtidos apontam para a infecção de células Sf9 em Meio 50% com MOI de 5,0 pfu/cel, condições nas quais a produtividade de Canacistatina alcançou 28 µg/106cel.

Made available in DSpace on 2016-08-10T10:55:17Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Marielle de Oliveira Castro.pdf: 948812 bytes, checksum: 71c8c7096fa4cd9fbc718b2983fb0b7d (MD5) Previous issue date: 2007-03-23 / Hepatitis C is considered one of the largest problems of public health in the world, inclusively in Brazil, whereas a preventive vaccine none is available; the number of asymptomatic infections is elevated and for control of the disease, there exist only imported kits. Considering, principally, the increase of preoccupation with the detection of precocious hepatitis C and that the diagnostic methods of this infection are of the highest clinical importance, the presence study proposes the expression and the purification of one codified protein through a synthetic gene (MEHCV Multiepitope HCV). To achieve this objective, the new recombinant protein multiepitope was designed on the basis of epitopes linear, immunodominant and phylogenetically conserved from the virus of hepatitis C (HCV), including the immune dominating sequences of the genotypes that are more prevalent in Brazil (1a e 3a) and a His-tag in C-terminal to facilitate the purification of the recombinant protein express in bacteria. These epitopes (core, NS3, NS4A, NS4B e NS5) are considered among the most important for the diagnosis of the illness utilized for many HCV detection tests. The MEHCV gene (~720pb) possesses restrictive of sites (NdeI e XhoI) in yours extremities that permits the clonage in phase in the expression of vector bacterial pET-21a. To the synthesize of this gene was made the optimization to the codon usage of E. coli. The protein of interest (~29kDa) was detected by SDS-PAGE and Western blot. The purification of the protein express was realized by centrifugal in resin Ni-NTA by affinitive chromatography. Inasmuch as the purification was not total, a new purification was made of this protein by means of chromatography of affinity in column with resin Ni-NTA. However, did not having this purification owe a presence of cellular proteins. In such case, in the trial of obtain a total purification of this protein multiepitope, would be interesting the utilization of the one new protocol, with the extraction of the inclusion body, wherein all the dissolvable proteins cellular would be remove of the solution. / A hepatite C é considerada um dos maiores problemas de saúde pública no mundo inteiro, inclusive no Brasil, pois uma vacina preventiva não está disponível, o número de infectados com a forma assintomática é elevado e para o controle da doença, há somente kits importados. Considerando, principalmente, o aumento da preocupação com a detecção precoce da hepatite C e que os métodos de diagnóstico desta infecção são de grande relevância clínica, o presente trabalho propõe a expressão e purificação de uma proteína codificada por um gene sintético (MEHCV Multiepítopo HCV). Para atingir este objetivo, uma proteína multiepítopo recombinante foi desenhada a partir de epítopos lineares, imunodominantes e filogeneticamente conservados do vírus da hepatite C (HCV), com a inclusão de seqüências imunodominantes dos genótipos mais prevalentes no Brasil (1a e 3a) e uma His-tag no C-terminal para facilitar a purificação da proteína recombinante expressa em bactéria. Estes epítopos (core, NS3, NS4A, NS4B e NS5) são considerados entre os mais importantes para o diagnóstico da doença e utilizados em muitos testes para detecção do HCV. O gene MEHCV (~720pb) possui sítios de restrição (NdeI e XhoI) nas suas extremidades que permitem a clonagem em fase no vetor de expressão bacteriano pET-21a. Para a síntese deste gene, foi feita a otimização para o códon usage de E. coli. A proteína de interesse (~29kDa) foi detectada por SDS-PAGE e Western blot. A purificação da proteína expressa foi realizada por cromatografia de afinidade em resina Ni-NTA. Como a purificação não foi total, foi feita uma nova purificação desta proteína por cromatografia de afinidade em coluna com resina Ni-NTA. No entanto, não houve esta purificação devido à presença de proteínas celulares. Sendo assim, na tentativa de alcançar a purificação total desta proteína multiepítopo, seria interessante a utilização de um novo protocolo, com a extração dos corpos de inclusão, onde todas as proteínas celulares solúveis seriam retiradas da solução.

El uso de enzimas adaptadas/activas a bajas temperaturas tiene un alto potencial biotecnológico, debido principalmente a que permiten la reducción de costos energéticos en los procesos biotecnológicos. Las proteasas son enzimas proteolíticas de gran utilidad en la industria biotecnológica. Sus aplicaciones industriales involucran principalmente a la industria alimenticia, de detergentes y de cuero. En este trabajo se aisló bacterias de origen marino antártico que producen enzimas proteolíticas extracelulares con alta actividad a bajas temperaturas. El DNA genómico de las mejores cepas se utilizó para realizar búsquedas de genes que codificaran para proteasas tipo subtilisinas, utilizando partidores híbridos consenso-degenerados de oligonucleótidos (CODEHOP). Esto permitió clonar y secuenciar fragmentos de DNA que codificaban para regiones internas de tres proteasas tipo subtilisinas diferentes. A partir de estos fragmentos se determinó la secuencia de los extremos 3’ y 5’ de los genes, mediante una técnica de “genome walking” desarrollada para este trabajo. Se encontraron tres marcos de lectura abiertos (ORF) de 2.253 pb (P4), 2.124 pb (P6) y 1608 pb (P7), que codificaban para proteasas tipo subtilisina. Estos genes se expresaron con el sistema pET22b(+)/E. coli BL21(D3E), mediante inducción con IPTG. Las proteasas se produjeron fusionadas a una cola de histidina en el extremo C-terminal, permitiendo su purificación por cromatografía de afinidad a níquel. La proteasa P6 presentó mayor actividad catalítica que la subtilisina comercial Carlsberg a bajas temperaturas (5-25°C). Por otro lado, el sobrenandante del cultivo de la cepa antártica p13/1-4, correspondiente a la mejor productora de proteasa, se utilizó para purificar la enzima proteolítica mediante cromatografía. La proteasa se llamó T8, y se clonó un fragmento del gen de esta proteasa, mediante una estrategia que incluía un análisis de espectrometría de masa y diseño de partidores degenerados. La secuencia completa del gen se obtuvo mediante la técnica mejorada de “genome walking”, desarrollada en este trabajo. Actualmente, esta proteína tipo-subtilisina se encuentra en etapa de expresión recombinante. Adicionalmente a este trabajo, se aisló el gen de una xilanasa adaptada a bajas temperaturas utilizando partidores CODEHOP y la técnica de genome walking. Este gen se expresó en el sistema pET22b(+)/E. coli BL21(DE3), produciendo la xilanasa L activa en el sobrenandante. Esta xilanasa recombinante se utilizó para desarrollar métodos de evolución dirigida tales como PCR propenso a error (error-prone PCR) y recombinación al azar (DNA shuffling). Esto permitió la obtención de una nueva variante de xilanasa con una constante catalítica (kcat) tres veces mayor que la xilanasa L original. Durante este trabajo de tesis se desarrolló diferentes estrategias que permitieron la clonación, producción recombinante y evolución dirigida de diferentes enzimas hidrolíticas adaptadas a bajas temperaturas.

Submitted by Hiolanda Rêgo (hiolandarego@gmail.com) on 2016-07-08T18:14:53Z No. of bitstreams: 1 Dissertação_ICS_ Cristiane Garboggini Melo de Pinheiro.pdf: 598809 bytes, checksum: da4fcddb92f744134bf824e490839654 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-07-08T18:14:53Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dissertação_ICS_ Cristiane Garboggini Melo de Pinheiro.pdf: 598809 bytes, checksum: da4fcddb92f744134bf824e490839654 (MD5) / CAPES / Em um estudo prévio, cinco antígenos recombinantes de Leishmania chagasi foram selecionados, através de soro de cão, para avaliação como candidatos a componente de uma vacina contra leishmaniose visceral canina. Um desses antígenos, denominado Lc9, foi posteriormente utilizado isoladamente ou em combinação com diversos adjuvantes para imunizar camundongos. Após a injeção de Lc9 isoladamente ou em associação com saponina ocorreu indução de resposta imune do tipo Th2 ou mista (Th1/Th2), respectivamente. Interleucina-12 é uma citocina que pode promover o desenvolvimento de resposta imune do tipo Th1 a antígenos co-administrados. No presente trabalho, visando uma modificação adicional da resposta imune a Lc9, de Th1/Th2 para Th1, camundongos foram injetados com um plasmídeo codificando IL-12 murina (pcDNA3.1-scmu-IL-12) durante a sensibilização realizada com Lc9 e saponina. Grupos de camundongos BALB/c foram submetidos a três séries de injeções, com 21 dias entre cada duas séries consecutivas, por via subcutânea, com salina (G1), saponina em salina (G2), Lc9-saponina (G3). Durante a primeira série de injeções, os animais receberam 50 Mg pcDNA3.1 vazio (G4) ou 50 Mg (G5), 10 Mg (G6), 2 Mg (G7) e 0,4 Mg (G8) de pcDNA3.1-scmuIL-12, por via intramuscular seguida de eletroporação. A resposta imune humoral foi avaliada pela mensuração dos níveis de anticorpos em amostras de soro. A resposta celular foi avaliada por ensaio de linfoproliferação e produção de citocinas (IFN-γ, IL-4 e IL-5) por esplenócitos, estimulados in vitro com antígenos de Leishmania. Todos os grupos de animais que receberam Lc9 produziram anticorpos IgG, IgG1 e IgG2a reativos ao antígeno recombinante Lc9. Nenhum dos grupos apresentou resposta linfoproliferativa significante. Contudo, os grupos (G3 a G7) produziram e todos os grupos que receberam Lc9 (G3 a G8) produziram IL-5. Além disso, apenas os grupos G4 e G8 apresentaram níveis elevados de produção de IL-4. Esses resultados sugerem que camundongos imunizados com Lc9 e saponina desenvolvem uma resposta mista Th1/Th2, e que, nenhuma das doses de plasmídeo codificando IL-12 é capaz de modificar a resposta imune para tipo Th1.

Submitted by Hiolanda Rêgo (hiolandarego@gmail.com) on 2016-07-28T15:38:47Z No. of bitstreams: 1 Dissertação_ICS_ Cristiane Garboggini Melo de Pinheiro.pdf: 604063 bytes, checksum: 33f2042850962bea522205a8088c5d7f (MD5) / Made available in DSpace on 2016-07-28T15:38:47Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dissertação_ICS_ Cristiane Garboggini Melo de Pinheiro.pdf: 604063 bytes, checksum: 33f2042850962bea522205a8088c5d7f (MD5) / CAPES / Em um estudo prévio, cinco antígenos recombinantes de Leishmania chagasi foram selecionados, através de soro de cão, para avaliação como candidatos a componente de uma vacina contra leishmaniose visceral canina. Um desses antígenos, denominado Lc9, foi posteriormente utilizado isoladamente ou em combinação com diversos adjuvantes para imunizar camundongos. Após a injeção de Lc9 isoladamente ou em associação com saponina ocorreu indução de resposta imune do tipo Th2 ou mista (Th1/Th2), respectivamente. Interleucina-12 é uma citocina que pode promover o desenvolvimento de resposta imune do tipo Th1 a antígenos co-administrados. No presente trabalho, visando uma modificação adicional da resposta imune a Lc9, de Th1/Th2 para Th1, camundongos foram injetados com um plasmídeo codificando IL-12 murina (pcDNA3.1-scmu-IL-12) durante a sensibilização realizada com Lc9 e saponina. Grupos de camundongos BALB/c foram submetidos a três séries de injeções, com 21 dias entre cada duas séries consecutivas, por via subcutânea, com salina (G1), saponina em salina (G2), Lc9-saponina (G3). Durante a primeira série de injeções, os animais receberam 50 Mg pcDNA3.1 vazio (G4) ou 50 Mg (G5), 10 Mg (G6), 2 Mg (G7) e 0,4 Mg (G8) de pcDNA3.1-scmuIL-12, por via intramuscular seguida de eletroporação. A resposta imune humoral foi avaliada pela mensuração dos níveis de anticorpos em amostras de soro. A resposta celular foi avaliada por ensaio de linfoproliferação e produção de citocinas (IFN- , IL-4 e IL-5) por esplenócitos, estimulados in vitro com antígenos de Leishmania. Todos os grupos de animais que receberam Lc9 produziram anticorpos IgG, IgG1 e IgG2a reativos ao antígeno recombinante Lc9. Nenhum dos grupos apresentou resposta linfoproliferativa significante. Contudo, os grupos (G3 a G7) produziram e todos os grupos que receberam Lc9 (G3 a G8) produziram IL-5. Além disso, apenas os grupos G4 e G8 apresentaram níveis elevados de produção de IL-4. Esses resultados sugerem que camundongos imunizados com Lc9 e saponina desenvolvem uma resposta mista Th1/Th2, e que, nenhuma das doses de plasmídeo codificando IL-12 é capaz de modificar a resposta imune para tipo Th1.

Submitted by Hiolanda Rêgo (hiolandarego@gmail.com) on 2016-08-02T13:40:35Z No. of bitstreams: 1 Dissertação_ICS_ Cristiane Garboggini Melo de Pinheiro.pdf: 604067 bytes, checksum: 51a4b0b58210591c4a63d6fe7c4dc919 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-08-02T13:40:35Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Dissertação_ICS_ Cristiane Garboggini Melo de Pinheiro.pdf: 604067 bytes, checksum: 51a4b0b58210591c4a63d6fe7c4dc919 (MD5) / CAPES / Em um estudo prévio, cinco antígenos recombinantes de Leishmania chagasi foram selecionados, através de soro de cão, para avaliação como candidatos a componente de uma vacina contra leishmaniose visceral canina. Um desses antígenos, denominado Lc9, foi posteriormente utilizado isoladamente ou em combinação com diversos adjuvantes para imunizar camundongos. Após a injeção de Lc9 isoladamente ou em associação com saponina ocorreu indução de resposta imune do tipo Th2 ou mista (Th1/Th2), respectivamente. Interleucina-12 é uma citocina que pode promover o desenvolvimento de resposta imune do tipo Th1 a antígenos co-administrados. No presente trabalho, visando uma modificação adicional da resposta imune a Lc9, de Th1/Th2 para Th1, camundongos foram injetados com um plasmídeo codificando IL-12 murina (pcDNA3.1-scmu-IL-12) durante a sensibilização realizada com Lc9 e saponina. Grupos de camundongos BALB/c foram submetidos a três séries de injeções, com 21 dias entre cada duas séries consecutivas, por via subcutânea, com salina (G1), saponina em salina (G2), Lc9-saponina (G3). Durante a primeira série de injeções, os animais receberam 50 Mg pcDNA3.1 vazio (G4) ou 50 Mg (G5), 10 Mg (G6), 2 Mg (G7) e 0,4 Mg (G8) de pcDNA3.1-scmuIL-12, por via intramuscular seguida de eletroporação. A resposta imune humoral foi avaliada pela mensuração dos níveis de anticorpos em amostras de soro. A resposta celular foi avaliada por ensaio de linfoproliferação e produção de citocinas (IFN- , IL-4 e IL-5) por esplenócitos, estimulados in vitro com antígenos de Leishmania. Todos os grupos de animais que receberam Lc9 produziram anticorpos IgG, IgG1 e IgG2a reativos ao antígeno recombinante Lc9. Nenhum dos grupos apresentou resposta linfoproliferativa significante. Contudo, os grupos (G3 a G7) produziram e todos os grupos que receberam Lc9 (G3 a G8) produziram IL-5. Além disso, apenas os grupos G4 e G8 apresentaram níveis elevados de produção de IL-4. Esses resultados sugerem que camundongos imunizados com Lc9 e saponina desenvolvem uma resposta mista Th1/Th2, e que, nenhuma das doses de plasmídeo codificando IL-12 é capaz de modificar a resposta imune para tipo Th1.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Celular, 2008. / Submitted by Jaqueline Oliveira (jaqueoliveiram@gmail.com) on 2008-12-11T19:02:46Z No. of bitstreams: 1 DISSERTACAO_2008_JulianaAmorimAraujo.pdf: 3037793 bytes, checksum: a7399845548557e765e50c02f6d3d986 (MD5) / Approved for entry into archive by Georgia Fernandes(georgia@bce.unb.br) on 2009-02-20T15:27:14Z (GMT) No. of bitstreams: 1 DISSERTACAO_2008_JulianaAmorimAraujo.pdf: 3037793 bytes, checksum: a7399845548557e765e50c02f6d3d986 (MD5) / Made available in DSpace on 2009-02-20T15:27:14Z (GMT). No. of bitstreams: 1 DISSERTACAO_2008_JulianaAmorimAraujo.pdf: 3037793 bytes, checksum: a7399845548557e765e50c02f6d3d986 (MD5) / A coagulação enzimática do leite para fabricação de queijo envolve a quebra de uma ligação peptídica da caseína por uma protease aspártica. Tradicionalmente, esta clivagem é feita em escala industrial pela ação da quimosina bovina que combina uma forte atividade de coagulação do leite com uma baixa atividade proteolítica. No presente estudo, é relatada a expressão, purificação e caracterização de quimosina recombinante bovina na levedura metilotrófica Pichia pastoris. Para alcançar altos níveis de produção, o cDNA do fragmento codante da pró-quimosina B bovina foi desenhado e sintetizado in vitro otimizando o codon usage para a expressão em P. pastoris. O gene sintético (CHYMb) foi clonado em vetores de expressão contendo os promotores PGK1 (expressão constitutiva) e AOX1 (expressão induzida) seguindo-se integração no genoma da levedura. Os clones transformantes com maior produção enzimática de cada sistema (P1 e A3, respectivamente) foram analisados em culturas simultâneas para comparação da produção enzimática. Maiores níveis de atividade de quimosina foram observados no clone sob o comando do promotor PGK1, que apresentou alta produção durante toda a cultura. Uma otimização na produção enzimática foi desenvolvida através de planejamentos fatoriais. A influência da densidade celular inicial, metanol e concentração da fonte de nitrogênio foram avaliados para aumentar a produção do clone A3. A interação dos fatores densidade celular inicial e concentração de metanol foi determinada como sendo o parâmetro mais importante, dobrando a produção. A influência de diferentes concentrações da fonte de nitrogênio e carbono, previamente selecionados (farelo de soja e açúcar invertido), foi também analisada para aumentar a produção enzimática no clone P1. Foi demonstrado por análise estatística que maiores concentrações de cada fator aumentam a produção. O perfil de atividade enzimática foi avaliada em fermentador com as condições determinadas nas otimizações. A atividade encontrada nos dois casos (A3 e P1) foi superior àquelas encontradas na fermentação em frascos. A quimosina recombinante foi posteriormente purificada apenas por uma etapa de cromatografia de exclusão molecular. Foi demonstrada a presença de enzima já processada no sobrenadante da cultura e uma fração de proteínas glicosiladas. A especificidade pela caseína foi demonstrada ser semelhante à quimosina comercial recombinante produzida por Aspergillus niger (Chr. Hansen). A alta produção de quimosina recombinante com alta especificidade em P. pastoris faz esse sistema de expressão atrativo para produção industrial desta enzima. _______________________________________________________________________________ ABSTRACT / Enzymatic milk coagulation for cheese manufacturing involves the cleavage of the scissile bond in casein by an aspartic protease. Bovine chymosin B is commonly used at the industrial level for milk coagulation because it combines a strong clotting activity with a low general proteolytic activity. In the present study, we report the expression, purification and characterization of recombinant chymosin B expressed in the methylotrophic yeast Pichia pastoris. To achieve high levels of production, the cDNA fragment coding for prochymosin was designed and synthesized based on codon usage optimization for expression in P. pastoris. The synthetic gene (CHYMb) was cloned into expression vectors based on the PGK1 promoter (constitutive expression) and AOX1 promoter (inducible expression). The resulted constructs were integrated in the yeast genome. Transformant clones producing high levels of enzyme activity from each system (P1 and A3, respectively) were analyzed in a simultaneous culture for comparison of enzymatic production. High levels of chymosin activity were observed in the clone controlled by the PGK1 promoter which showed high production levels throughout the culture. Optimization for enzymatic production was developed through factorial design. The influence of the initial cellular density, methanol and nitrogen source concentration were accessed for enzymatic production from clone A3. The interaction of the initial cellular density and methanol concentration was responsible for doubling enzyme production. The influence of different concentrations of nitrogen and carbon sources (soy extract and inverted sugar, respectively) was also observed to increase enzymatic production in clone P1. Statistic analysis demonstrated that higher concentrations of each factor increased enzyme production. The profile of enzymatic activity was evaluated in fermentors under the conditions determined during optimizations. In this case, the activities observed in clones A3 and P1 were superior to those found when theses clones were grown in shake flasks. The recombinant chymosin was purified by a single molecular exclusion chromatographic step. Purified enzyme derived from supernatant fraction was shown to be present in its processed form and a fraction of glycosylated protein was also detected. The specificity for casein was shown to be similar to that from commercial recombinant chymosin produced by Aspergillus niger (Chr. Hansen). The high production and high specificity of recombinant chymosin derived from P. pastoris renders this expression system as an attractive alternative for large scale industrial production of this enzyme.

Submitted by Pós Imunologia (ppgimicsufba@gmail.com) on 2017-02-14T15:24:05Z No. of bitstreams: 1 DISSERTAÇÃO - Samara Alves Sá Teles.pdf: 1106383 bytes, checksum: 1bb15f702feb2f073001225aaae2d132 (MD5) / Approved for entry into archive by Delba Rosa (delba@ufba.br) on 2017-06-29T13:56:29Z (GMT) No. of bitstreams: 1 DISSERTAÇÃO - Samara Alves Sá Teles.pdf: 1106383 bytes, checksum: 1bb15f702feb2f073001225aaae2d132 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-06-29T13:56:29Z (GMT). No. of bitstreams: 1 DISSERTAÇÃO - Samara Alves Sá Teles.pdf: 1106383 bytes, checksum: 1bb15f702feb2f073001225aaae2d132 (MD5) / CAPES / Com o aumento da prevalência de doenças inflamatórias, em especial as alérgicas, a busca por estratégias terapêuticas visando à melhoria de vida dos indivíduos doentes tornou-se um vasto campo de pesquisa. Neste âmbito, o uso de helmintos e derivados que possuem potencial imunomodulatório tem se mostrado eficiente na inibição da inflamação em modelos experimentais dessas doenças. Objetivo: Produzir e analisar, in silico, o antígeno recombinante do Trichuris trichiura homólogo ao fator inibidor de migração de macrófagos (rTt-MIF) e avaliar seu efeito em cultura de células monomorfonucleares de sangue periférico (CMSP) de indivíduos atópicos e não atópicos. Métodos: A análise in silico da proteína foi realizada utilizando diversas ferramentas de bioinformática. A sequência codificadora do antígeno recombinante foi sintetizada e clonada em um plasmídeo de expressão, a partir do qual foi realizada a expressão heteróloga da proteína em sistema procarioto, com posterior purificação por cromatografia de afinidade e determinação do conteúdo proteico e de endotoxina. Após teste cutâneo e dosagem de IgE por ImunoCAP, foram selecionados 12 indivíduos não atópicos e 14 indivíduos atópicos cujo sangue periférico foi coletado para realizar o cultivo de células monomorfonucleares. As células foram cultivadas sob três condições: estímulo do rTt-MIF, meio de cultivo sem estímulo e estimuladas por Pokeweed ou LPS. Após o cultivo, os sobrenadantes foram coletados para realização da dosagem das citocinas IL-10, IFN-γ, IL-5 e IL-17A. Resultados: A molécula caracterizada como estável e solúvel foi produzida, obtida na quantidade de 2,4 mg/mL com 1,9 EU/mL. O rTt-MIF induziu o aumento da produção de IL-10 pelas células dos indivíduos atópicos (P=0,0001) e dos não atópicos (P=0,0005). Em relação às citocinas IFN-γ, IL-5 e IL-17, o rTt-MIF não induziu a produção destas pelas células dos indivíduos atópicos e não atópicos. Conclusão: A ação do rTt-MIF sobre o cultivo de células momonucleares do sangue periférico, de aumentar a produção de IL-10 e não induzir a produção de IFN-γ, IL-5 e IL-17A, mostra o potencial imunomodulador dessa molécula, com possível efeito de reduzir a elevação de eosinófilos, neutrófilos e citocinas inflamatórias. / With the increasing prevalence of inflammatory diseases, in particular allergies, the search for therapeutic strategies aiming to improve life quality of sick individuals has become a vast field of research. In this context, the use of helminths and their derivatives that demonstrate potential immunomodulatory effect has been effective in inhibiting inflammation in experimental models of inflammatory diseases. Objective: To produce and analyze in silico the recombinant antigen from Trichuris trichiura homologous to the macrophage migration inhibitory factor (rTt-MIF) and evaluate its effect on peripheral blood mononuclear cells culture (PBMC) of atopic and non-atopic individuals. Methods: Bioinformatics tools made the analysis in silico. The Tt-MIF codifying sequence was synthesized and cloned into a plasmid, allowing the heterologous expression of the protein in a prokaryotic system, with subsequent purification by affinity chromatography and protein and endotoxin quantifications. After prick test and IgE dosage by ImmunoCAP test, 12 non-atopic individuals and 14 atopic individuals were selected, whose peripheral blood were collected to obtain the mononuclear cells (PBMC) for in vitro culture. Cells were stimulated with the rTt-MIF, as negative control cells were cultivated without stimuli and, as positive control, cells were cultivated with Pokeweed or LPS. After the culture, the supernatants were assayed to quantify IL-10, IFN-γ, IL-5 and IL-17A. Results: The protein characterized as soluble and stable was produced and obtained in the amount of 2,4 mg/mL with 1,9 EU/mL. The rTt-MIF induced a stimulatory effect on IL-10 production by cells from atopic individuals (P=0.0001) and by cells from non-atopic individuals (P=0,0005). The rTt-MIF did not induce the production of IFN-γ, IL-5 and IL-17A by cells from atopic and non-atopic individuals. Conclusion: The effects of rTt-MIF increasing IL-10 production and not inducing the production of IFN-γ, IL-5 and IL-17A on human PBMC cultures are indicative of its immunomodulatory potential, with possible effect of decreasing eosinophilic and neutrophilic presence and inducing immune regulation.