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Mémoire numérisé par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Streptococcus thermophilus est la bactérie lactique la plus utilisée après Lactococcus lactis dans l'industrie laitière pour la fabrication de yaourts et de fromages à pâte cuite (Emmental, gruyère), filée (Mozarella) ou pressée (Cheddar). Il s'agit du seul streptocoque à avoir le statut de bactérie GRAS (Generally Recognized As Safe). Dans un premier temps le potentiel probiotique de 30 souches de S. thermophilus de différentes origines a été testé par l'étude de leurs capacités à résister aux différentes conditions de stress rencontrées pendant leur passage dans le tractus gastro-intestinal (bas pH, sels biliaires et stress oxydant), de leur capacité à adhérer aux cellules épithéliales intestinales et de leurs propriétés immunomodulatrices. La majorité des souches réduit la production d'interleukine IL-8 (pro-inflammatoire) alors qu'elles induisent la production d'interleukine IL-10 (anti-inflammatoire) et l'IL-12 (pro-inflammatoire). Sur la base du rapport IL-10/IL-12, qui permet d'apprécier le potentiel anti-inflammatoire d'une souche, nous avons observé que certaines d'entre-elles pourraient avoir un fort potentiel anti-inflammatoire. L'Analyse en Composantes Principales (ACP) nous a permis de séparer les souches en 6 catégories différentes présentant des propriétés distinctes. A l'intérieur de chaque classe, une variabilité entre les souches a été observée et des caractéristiques intéressantes identifiées. Cependant, aucune des classes ne peut être considérée comme contenant le probiotique « parfait ». Suite à cette étude et sur la base de sa résistance aux stress gastriques et de ses capacités d'adhésion, et sachant que la séquence de son génome est disponible, la souche LMD-9 a été sélectionnée pour la deuxième partie de ce travail, à savoir la construction d'un outil basé sur la technologie R-IVET pour étudier l'état physiologique de S. thermophilus dans le tractus digestif. L'outil R-IVET mis au point se compose de deux éléments: un vecteur plasmidique portant le gène cre codant une recombinase spécifique dépourvu de son promoteur et une cassette chromosomique composée d'un gène de résistance à la spectinomycine flanqué par des sites loxP, reconnus par la recombinase Cre. La fonctionnalité de l'outil R-IVET a ensuite été testée par le clonage de trois promoteurs différents de S. thermophilus (PprtS, Pshsp and Plac) en amont de cre. Le système a été valide in vitro avec les trois promoteurs et in vivo avec le promoteur Plac / Streptococcus thermophilus is a lactic acid bacterium used after Lactococcus lactis in the dairy industry for the production of yogurt and cheeses like Emmental, Gruyere, Mozarella and Cheddar. It is the only streptococcus to have the GRAS (Generally Recognized As Safe) status. In this work, the probiotic potential of 30 S. thermophilus strains from different origins was tested by studying their ability to resist different stress conditions encountered during their passage through the GIT (low pH, bile salts and oxidative stress), their ability to adhere to intestinal epithelial cells and their immunomodulatory properties. Majority of the strains reduced the production of interleukin IL-8 (pro-inflammatory) and induced the production of interleukin IL-10 (anti-inflammatory) and IL-12 (pro-inflammatory). On the basis of the ratio IL-10/IL-12 which allows to evaluate the anti-inflammatory potential of a probiotic, several strains appeared to have a high the anti-inflammatory potential. Principal Component Analysis (PCA) allowed us to classify strains in 6 different categories with different properties. Within each class, variability and interesting features were observed, but none of the classes could be considered as containing the perfect probiotic. Following this study and on the basis of its resistance to gastric stress and its adhesion capacity and knowing that its genome sequence is available, the strain LMD-9 was selected for the second part of this work, namely the construction of a tool based on R-IVET to study the physiological state of S. thermophilus in the digestive tract. This tool is composed of two elements: a plasmid vector (pULNcreB), carrying the gene cre encoding a site-specific recombinase without its promoter and a chromosomal cassette composed of a gene of resistance to spectinomycin flanked by loxP sites which are recognized by the recombinase Cre. The functionality of the tool R-IVET was then tested by cloning three different promoters of S. thermophilus (PprtS, Pshsp and Plac) upstream of cre. System was valid in vitro with all the three promoters and in vivo by using the lactose operon promoter Plac

Based on their highly bioactive properties in membrane phospholipids, there is growing recognition that dietary n-3 polyunsaturated fatty acids (PUFA) may be of significant benefit in the prevention and treatment of many lifestyle related pathologies, however direct evidence is lacking. The fat-1 transgenic mouse, a genetic model of n-3 PUFA enrichment, is a useful tool in nutritional research which has provided enhanced insight into the health effects of lifelong n-3 PUFA exposure. However, the influence of timing of n-3 PUFA exposure on health related outcomes remains unclear. This thesis describes the functional characterization of the novel Cre recombinase dependent inducible fat-1 (iFat-1) transgene. In the presence of Cre, the iFat-1 transgene was found to reduce phospholipid n-6/n-3 PUFA ratios both in vitro (100%) and in vivo (upwards of 70%), suggesting that the iFat-1 transgene has potential application to address temporal effects of n-3 PUFA in health and disease. / Canadian Institutes of Health Research - Frederick Banting and Charles Best Canada Graduate Scholarship, Sun Life Financial

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XerC et XerD, deux recombinases impliquées dans la recombinaison site spécifique, résolvent les multimères d’ADN en monomères. Cette réaction se produit au niveau du site dif du chromosome, et nécessite le domaine C-terminale de la protéine de division cellulaire FtsK. Caulobacter crescentus est une bactérie aquatique de type Gram-négative qui se retrouve dans plusieurs environnements. Elle présente un cycle cellulaire asymétrique avec deux types de cellules distinctes. Cette propriété peut être utilisée pour synchroniser la croissance d’une population bactérienne pour permettre l’étude de l’expression de gènes à travers le temps et les liens entre le cycle cellulaire et le développement de la bactérie. La liaison à l’ADN et la capacité de former des complexes covalents (phosphotyrosyl) avec le site dif de C. crescentus (ccdif) ont été testé pour les recombinases de C. crescentus (ccXerC et ccXerD). Les deux recombinases ont eu une meilleure liaison au demi-site gauche de ccdif et sont incapable d’effectuer une liaison coopérative, contrairement à ce qui se produit au niveau du site dif de E. coli. La formation de complexes covalents a été testé en utilisant des «substrats suicides avec bris» marqués à la fluorescence ainsi que des protéines de fusion (marquées ou non à la fluorescence). Des complexes ADN-protéines résistants à la chaleur et au SDS ont été observé lors de la réaction de ccXerC et ccXerD de type sauvage avec ccdif, mais pas lors de la réaction de mutants avec le même ADN. Des complexes covalents phosphotyrosine sont formés de façon plus efficace sur les substrats suicides avec un bris au niveau du brin supérieur que ceux ayant un bris au niveau du brin inférieur. Dans les deux cas, c’est ccXerC qui est resté lié de façon covalente à l’ADN de ccdif. / In most bacteria, the chromosomal dimer resolution process is mediated by two tyrosine recombinases, XerC and XerD, which bind cooperatively and perform the recombination reaction at the dif site near the terminus of replication. This reaction also requires the C-terminal domain of the cell division protein FtsK. Caulobacter crescentus is an aquatic Gram-negative bacterium found in various environments. This bacterium has an asymmetric cell cycle which can be used to synchronize cell growth in order to study the temporal expression of a gene and the interconnection between the cell cycle and development. The binding activity and the formation of phosphotyrosyl complex of the C. crescentus recombinases, ccXerC and ccXerD, were tested on the C. crescentus dif (ccdif) site. Both ccXerC and ccXerD bound preferentially to the left half-site of ccdif and showed reduced cooperative binding, unlike what was found with the E. coli dif site. Covalent complex formation activity was tested by using fluorescently labelled linear “nicked suicide substrates” and labelled proteins. Heat and SDS-resistant protein-DNA complexes were formed when both wild-type ccXerC and ccXerD reacted with ccdif but not in the presence of active-site tyrosine mutant proteins. Phosphotyrosine complexes formed on the top-nicked suicide substrate were found to be more efficient than on the bottom-nicked suicide substrates and surprisingly ccXerC remained bound to both top and bottom-nicked ccdif suicide substrates.

XerC et XerD, deux recombinases impliquées dans la recombinaison site spécifique, résolvent les multimères d’ADN en monomères. Cette réaction se produit au niveau du site dif du chromosome, et nécessite le domaine C-terminale de la protéine de division cellulaire FtsK. Caulobacter crescentus est une bactérie aquatique de type Gram-négative qui se retrouve dans plusieurs environnements. Elle présente un cycle cellulaire asymétrique avec deux types de cellules distinctes. Cette propriété peut être utilisée pour synchroniser la croissance d’une population bactérienne pour permettre l’étude de l’expression de gènes à travers le temps et les liens entre le cycle cellulaire et le développement de la bactérie. La liaison à l’ADN et la capacité de former des complexes covalents (phosphotyrosyl) avec le site dif de C. crescentus (ccdif) ont été testé pour les recombinases de C. crescentus (ccXerC et ccXerD). Les deux recombinases ont eu une meilleure liaison au demi-site gauche de ccdif et sont incapable d’effectuer une liaison coopérative, contrairement à ce qui se produit au niveau du site dif de E. coli. La formation de complexes covalents a été testé en utilisant des «substrats suicides avec bris» marqués à la fluorescence ainsi que des protéines de fusion (marquées ou non à la fluorescence). Des complexes ADN-protéines résistants à la chaleur et au SDS ont été observé lors de la réaction de ccXerC et ccXerD de type sauvage avec ccdif, mais pas lors de la réaction de mutants avec le même ADN. Des complexes covalents phosphotyrosine sont formés de façon plus efficace sur les substrats suicides avec un bris au niveau du brin supérieur que ceux ayant un bris au niveau du brin inférieur. Dans les deux cas, c’est ccXerC qui est resté lié de façon covalente à l’ADN de ccdif. / In most bacteria, the chromosomal dimer resolution process is mediated by two tyrosine recombinases, XerC and XerD, which bind cooperatively and perform the recombination reaction at the dif site near the terminus of replication. This reaction also requires the C-terminal domain of the cell division protein FtsK. Caulobacter crescentus is an aquatic Gram-negative bacterium found in various environments. This bacterium has an asymmetric cell cycle which can be used to synchronize cell growth in order to study the temporal expression of a gene and the interconnection between the cell cycle and development. The binding activity and the formation of phosphotyrosyl complex of the C. crescentus recombinases, ccXerC and ccXerD, were tested on the C. crescentus dif (ccdif) site. Both ccXerC and ccXerD bound preferentially to the left half-site of ccdif and showed reduced cooperative binding, unlike what was found with the E. coli dif site. Covalent complex formation activity was tested by using fluorescently labelled linear “nicked suicide substrates” and labelled proteins. Heat and SDS-resistant protein-DNA complexes were formed when both wild-type ccXerC and ccXerD reacted with ccdif but not in the presence of active-site tyrosine mutant proteins. Phosphotyrosine complexes formed on the top-nicked suicide substrate were found to be more efficient than on the bottom-nicked suicide substrates and surprisingly ccXerC remained bound to both top and bottom-nicked ccdif suicide substrates.

Les néoplasies myéloprolifératives (NMP) sont des maladies hématologiques acquises de la cellule souche hématopoïétique. Une mutation activatrice de la protéine de signalisation JAK2, JAK2V617F, a été identifiée chez la moitié des patients atteints de NMP Philadelphie négatives. Il a été rapporté que les patients avec des NMP avaient une augmentation du risque thrombotique et de la densité microvasculaire dans la rate et la moelle osseuse, sans explication physiopathologique claire. Des travaux récents ont mis en évidence la présence de la mutation JAK2V617F non seulement dans les cellules sanguines mais également dans les cellules endothéliales (CE) de ces patients. Nous faisons l’hypothèse que la présence de JAK2V617F dans les CE pourrait modifier leurs propriétés expliquant l’augmentation de l’angiogenèse dans les NMP. Pour répondre à cette hypothèse, nous avons voulu étudier le phénotype angiogénique des cellules endothéliales portant la mutation JAK2V617F. In vitro, nous disposons des particules lentivirales permettant d’obtenir des CE JAK2V617F par transduction lentivirale. In vivo, nous disposons des souris transgéniques exprimant la mutation JAK2V617F de manière conditionnelle (JAK2V617F/WT) grâce à la stratégie Cre-lox. Pour répondre à notre hypothèse, il été nécessaire de travailler avec des modèles murins exprimant la mutation JAK2V617F spécifiquement dans les CE sans atteinte concomitante de la lignée hématopoïétique. Dans un premier temps, nous avons voulu caractériser deux modèles endothéliaux inductibles couramment utilisés, Cdh5(PAC)-CreERT2 et Pdgfb-iCreERT2, en termes d’efficacité et de spécificité de recombinaison dans les cellules endothéliales vis-à-vis du compartiment hématopoïétique. Nous avons démontré que les souris adultes Cdh5(PAC)-CreERT2 pouvaient être utilisées comme modèles endothéliaux spécifiques, avec toutefois la mise en garde que la recombinaison est très variable entre les souris. Nous avons constaté que les souris PDGFB-iCreERT2 sont appropriées pour cibler les cellules endothéliales dans une large gamme d’organes à l'exception du foie, et devraient être utilisées dans les quatre premières semaines qui suivent l'induction, pour cibler un gène d’intérêt au niveau des cellules endothéliales, sans qu’il ait une atteinte concomitante dans la lignée hématopoïétique. Nous avons ensuite étudié les propriétés angiogéniques des cellules endothéliales JAK2V617F, in vitro en utilisant des HUVEC transduites avec un lentivirus permettant l’expression de JAK2V617F, et in vivo avec les souris Pdgfb-iCreERT2;JAK2V617F/WT. Nous avons démontré que les HUVEC JAK2V617F avaient un profil proangiogénique lié à une capacité proliférative élevée, résultant de l’activation de la voie JAK2/STAT3/PI3K. L’avantage hyperprolifératif que confère la mutation JAK2V617F aux cellules endothéliales a été confirmé in vivo avec le modèle de la vascularisation post-natale de la rétine, avec toutefois une diminution de la densité du réseau vasculaire due à une augmentation de la régression vasculaire au niveau de la rétine des souris Pdgfb-iCreERT2;JAK2V617F/WT. / Myeloproliferative neoplasms (MPNs) are acquired hematopoietic stem cell disorders. An activating mutation in the JAK2 signaling protein, JAK2V617F, was identified in half of the patients with Philadelphia chromosome-negative MPNs. It has been reported that patients with MPN had an increased risk of thrombosis but also an increased microvessel density in the spleen and bone marrow with no clear pathophysiological explanation. Several recent studies have demonstrated the presence of JAK2V617F mutation not only in blood cells but also in endothelial cells (EC) in MPN patients. We hypothesized that the presence of JAK2V617F in EC could change their properties leading to an increased angiogenesis process in MPNs. To address this question, our aim was to study the angiogenic phenotype of endothelial cells carrying the JAK2V617F mutation. For the in vitro experiments, we used lentiviral transduction of human JAK2V617F in EC. For the in vivo approach, we used transgenic mice (JAK2V617F/WT) that conditionally express JAK2V617F through Cre-lox strategy. To investigate our hypothesis, it was necessary to work with mice that express JAK2V617F specifically in EC without concomitant expression in hematopoietic cells. We first characterized two commonly-used inducible endothelial models, Cdh5(PAC)-CreERT2 and Pdgfb-iCreERT2, in terms of efficiency and specificity of recombination in endothelial cells. We showed that adult Cdh5(PAC)-CreERT2 mice can be used as specific endothelial model with however the wariness that recombination is highly variable among mice. We found that Pdgfb-iCreERT2 mice are appropriate to target endothelial cells in a wide range of organs except liver, and should be used within the four weeks after induction of Cre-mediated recombination to target a gene of interest in endothelial cells, without having a concomitant expression in hematopoietic lineage. We then studied the angiogenic properties of JAK2V617F endothelial cells, in vitro using JAK2V617F transduced HUVECs, and in vivo using Pdgfb-iCreERT2;JAK2V617F/WT mice. We observed that JAK2V617F HUVECs had a proangiogenic profile that was related to a highly proliferative potency, and that this phenotype results from a constitutive activation of JAK2/STAT3/PI3K pathway. The hyperproliferative advantage conferred by JAK2V617F to endothelial cells was confirmed in vivo using the postnatal vascularization model of the retina, with however a decrease in the density of the vascular network due to an increased vascular regression in Pdgfb-iCreERT2;JAK2V617F/WT mice’s retinas.

Transmissible spongiform encephalopathies (TSEs), such as scrapie and variant Creutzfeldt-Jakob disease are infectious, fatal, neurodegenerative diseases. Following peripheral infection TSE agents usually accumulate in lymhoid tissues before spreading to the central nervous system. In mice, follicular dendritic cells (FDCs) expressing the host prion protein (PrPC) are essential for scrapie agent accumulation in lymphoid tissues. The accumulation of the scrapie agent on FDCs is critical for the efficient spread of infection to the brain. However, it is unknown whether FDCs themselves actively replicate the scrapie agent, or simply accumulate it following production by other cells types such as neurones, lymphocytes or other stromal cell populations. To definitively address this issue a transgenic mouse model was created in which PrPC is switched on or off exclusively on FDCs. Expression of cre-recombinase (Cre) under the action of cell-specific gene promoters can be used to induce or delete the expression of a target gene in specific cell populations. In this model, Cre expression is driven by the complement receptor type 2 gene (Cr2/CD21) which is expressed by FDCs and mature B lymphocytes. Characterisation of the CD21-cre mouse line was achieved by crossing with a ROSA26 reporter strain. The CD21-cre mouse line was subsequently crossed with floxed-PrP mouse lines to produce compound transgenic mouse lines in which PrPC expression was switched on or off, only in FDCs. Cre expression by B lymphocytes was eliminated by γ-irradiation and grafting recipient mice with Cre-deficient bone marrow. Immunohistochemical analysis confirmed the expression PrPC had been switched on or off exclusively on FDCs. Subsequently, the mice were challenged with scrapie by intra-peritoneal injection to determine the precise role of FDCs in the accumulation of scrapie in lymphoid tissues. Switching off PrPC expression exclusively on FDCs prevented the accumulation of TSE agent specific disease-associated PrPSc in the spleen after i.p inoculation. Conversely, in mice in which PrPC was expressed only on FDC, successful replication of the agent occurred on the FDC network in the spleen. Taken together, these data show PrPC-expressing FDCs alone are sufficient to support the accumulation of the scrapie agent within lymphoid tissues. Furthermore, these data suggest FDC replicate the TSE agent and do not simply accumulate it following synthesis by other cell types.

Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.