Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Instituto de Ciências Biológicas, Departamento de Biologia Celular, Programa de Pós-Graduação em Biologia Molecular, 2014. / Submitted by Albânia Cézar de Melo (albania@bce.unb.br) on 2014-07-25T15:51:49Z No. of bitstreams: 1 2014_MaritzaOcampoBetancur.pdf: 2785011 bytes, checksum: 1e7f6e8c3bda3abce6c1882650617a39 (MD5) / Approved for entry into archive by Guimaraes Jacqueline(jacqueline.guimaraes@bce.unb.br) on 2014-07-29T14:39:53Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2014_MaritzaOcampoBetancur.pdf: 2785011 bytes, checksum: 1e7f6e8c3bda3abce6c1882650617a39 (MD5) / Made available in DSpace on 2014-07-29T14:39:53Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2014_MaritzaOcampoBetancur.pdf: 2785011 bytes, checksum: 1e7f6e8c3bda3abce6c1882650617a39 (MD5) / A levedura Pichia pastoris tem sido amplamente utilizada na produção de proteínas recombinantes devido a características como fácil manipulação, rápido crescimento e capacidade de fazer modificações pós-traducionais mais similares às dos mamíferos. Apesar do vasto uso desta levedura como sistema de expressão, há poucas marcas de seleção disponíveis para sua manipulação genética. As marcas existentes podem ser auxotróficas (genes de vias biossintéticas como HIS4, ARG4, URA3, ADE1, dentre outros) ou dominantes (geralmente genes que conferem resistência a drogas). O limitado número de marcas seletivas atualmente disponíveis restringe a construção de cepas de P. pastoris contendo mais de uma modificação genética. Nesse contexto, o objetivo deste estudo foi interromper, pela primeira vez, o gene LEU2 no genoma de P. pastoris com o fim de gerar uma linhagem auxotrófica para o aminoácido leucina que pudesse ser utilizada como hospedeira para vetores contendo este gene como marca de seleção. A ruptura gênica foi obtida pela transformação da levedura com um cassete de expressão contendo os genes kanR (resistência a kanamicina/G418) ou Sh ble (resistência a zeocina) flanqueados por regiões 5´ e 3´ do gene LEU2 para promover a recombinação homóloga neste locus. Para construir esse cassete de deleção o gene clonado LEU2 teve um fragmento de aproximadamente 400 pb excisado após digestão com enzimas de restrição sendo substituído pelo cassete de expressão flanqueado por sequências loxP. Após transformação e seleção de mutantes auxotróficos, a marca dominante foi removida. Para tanto, a levedura foi transformada com um vetor contendo o gene que codifica para a proteína CreA, uma recombinase sítio-específica que catalisa a reação de recombinação entre duas sequências loxP. Finalmente, para testar esta nova linhagem, foi construído um vetor contendo eGFP como gene repórter e o gene LEU2 como marca de seleção. A transformação da linhagem auxotrófica leu2 com esse vetor confirmou a recuperação da prototrofia e a capacidade da levedura para produzir a proteína heteróloga intracelularmente. ______________________________________________________________________________ ABSTRACT / The yeast Pichia pastoris has been widely used for the production of recombinant proteins due to several characteristics such as easy genetic manipulation, fast growth and the ability to carry out post-translational modifications similarly to mammals. Despite the wide use of Pichia pastoris as expression system there are few selectable markers available for its genetic manipulation. The existing markers can be auxotrophic (genes of biosynthetic pathways, for example HIS4, ARG4, URA3, ADE1, among others) or dominant (mainly genes that confer drug resistance). The limited number of available selectable markers restricts the construction of strains with more than one recombinant modification. The aim of this study was to interrupt, for the first time, the LEU2 gene in the P. pastoris genome to generate an auxotrophic strain for the amino acid leucine which could be used as host strain for vectors carrying the LEU2 gene as selectable marker. The disruption was achieved transforming the yeast with an expression cassette that contained the kanR (kanamycin/G418 resistance) or Sh ble genes (zeocin resistance) flanked by regions from the LEU2 gene to promote homologous recombination at that locus in the P. pastoris genome. To construct that deletion cassette the cloned LEU2 gene had an excised fragment of approximately 400 bp after digestion with restriction enzymes. That fragment was substituted by the expression cassette flanked by loxP sequences. After transformation and selection of auxotrophic mutants the dominant marker was removed. To accomplish this, the yeast was transformed with a vector carrying the gene that codes for the CreA protein, a site-specific recombinase that catalyzes the recombination reaction between two loxP sequences. Finally, to test the new strain, it was constructed a vector containing eGFP as a reporter gene and the LEU2 gene as a selectable marker. Transformation of P. pastoris leu2 with that vector confirmed the recovery of the prototrophy and the ability of the yeast to produce the intracellular heterologous protein. ______________________________________________________________________________ RESUMEN / La levadura Pichia pastoris ha sido ampliamente utilizada para la producción de proteínas recombinantes debido a características como fácil manipulación, rápido crecimiento y la capacidad de realizar modificaciones postraduccionales similares a las de los eucariotas. A pesar del gran uso de esta levadura como sistema de expresión hay pocas marcas de selección disponibles para su manipulación genética. Las marcas existentes pueden ser auxotróficas (genes de vías biosintéticas como HIS4, ARG4, URA3, ADE1, entre otros) o dominantes (principalmente genes que confieren resistencia a drogas). El limitado número de marcas de selección disponibles actualmente restringe la construcción de cepas de P. pastoris con más de una modificación recombinante. En este contexto, el objetivo de este estudio fue interrumpir, por primera vez, el gen LEU2 en el genoma de P. pastoris con el fin de generar una cepa auxotrófica para el aminoácido leucina que pudiera ser utilizada como hospedera para vectores que tengan el gen LEU2 como marca de selección. La ruptura se logró al transformar la levadura con un casete de expresión que contenía el gen kanR (resistencia a kanamicina/G418) o el gen Sh ble (resistencia a zeocina) flanqueado por regiones del gen LEU2 para promover recombinación homóloga en ese locus del genoma de P. pastoris. Para esto se clonó el gen LEU2 y se digirió con enzimas de restricción para retirar un fragmento de aproximadamente 400 pb el cual se reemplazó por el casete de expresión flanqueado por secuencias loxP. Después de la transformación y selección de mutantes auxotróficos se removió la marca dominante. Para esto se transformó la levadura con un vector que contenía el gen que codifica para la proteína CreA, una recombinasa sitio-específica que cataliza la reacción de recombinación entre dos secuencias loxP. Finalmente para evaluar la nueva cepa se construyó un vector que contenía el gen eGFP como reportero y el gen LEU2 como marca de selección. La transformación de P. pastoris leu2 con este vector confirmó la recuperación de la prototrofía y la capacidad de la levadura para producir la proteína heteróloga intracelularmente.

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Les BMPs (Boue Morphogenetic Proteins) sont des morphogènes membres de la superfamille du TGF-[bêta] qui interagissent avec des récepteurs de surface cellulaire à activité sérine/thréonine kinase. L'interaction des BMPs avec ces récepteurs entraîne l'activation d'une cascade de signalisation cellulaire impliquant les facteurs de types R-Smads (Smad1, 5 et 8). La voie de signalisation des BMPs joue des rôles cruciaux dans des processus biologiques tels que l'embryogenèse et l'organogenèse des tissus ainsi que des processus cellulaires tels que la prolifération, la migration et la différenciation cellulaire. De plus, ces derniers semblent aussi impliqués dans les processus de mort cellulaire et dans la tumorigenèse. Malgré un intérêt grandissant pour la signalisation des BMPs, il existe très peu d'études sur les rôles spécifiques joués individuellement par les différents Smads dans la morphogenèse de l'intestin in vivo . Ceci est principalement dû au fait que la délétion classique des différents effecteurs de la voie des BMPs entraîne la mort in utero à cause de multiples défauts dans l'embryogenèse. Le système Cre/loxP, sous le contrôle d'un promoteur tissu spécifique, a été utilisé dans notre laboratoire, dans le but de générer une lignée murine possédant une délétion conditionnelle de l'effecteur Smad5 strictement au niveau de l'épithélium intestinal. Une analyse comparative à l'aide d'un modèle de délétion conditionnelle du récepteur BmpR1a au niveau de l'épithélium intestinal a été effectuée afin de décortiquer spécifiquement le rôle de l'effecteur Smad5 dans le développement de cet organe. Afin de valider les résultats obtenus in vivo nous avons généré un modèle cellulaire nous permettant de mimer l'effet de la délétion de l'effecteur Smad5 à l'aide de la technologie du shRNA.Les résultats obtenus dans les deux modèles suggèrent que Smad5 serait un facteur clé impliqué dans la régulation de la migration cellulaire des entérocytes. En effet, l'invalidation de la voie des BMPs et plus particulièrement de l'effecteur Smad5 dans les souris entraîne une augmentation de la vitesse de migration des cellules le long de l'axe crypte villosité. Ces résultats sont corroborés dans un modèle cellulaire dans lequel l'expression de Smad5 a été inhibée par interférence d'ARN. Dans ce modèle, la migration se fait de façon beaucoup plus compacte en comparaison aux cellules contrôles. L'augmentation de la vitesse de migration cellulaire pourrait être due à un phénomène de relocalisation des protéines de jonctions adhérentes ainsi qu'à une modulation de l'actine filamenteuse. Ce phénomène pourrait faire intervenir les petites protéines G Rho/Rac ainsi que les kinases Src. En plus de l'actine filamenteuse, différentes protéines impliquées dans la formation des complexes de jonctions adhérentes semblent relocalisées dans nos deux modèles (E-cadhérine/[bêta]-caténine). En conclusion, les différents résultats recueillis au cours de mes travaux de maîtrise dans le laboratoire du Dr. Nathalie Perreault nous suggèrent que l'effecteur Smad5 de la voie des BMPs serait un facteur impliqué dans la stabilité des complexes de jonctions adhérentes, régulant ainsi la migration des cellules le long de l'axe crypte villosité.

PTEN est une protéine dotée d'une activité phosphatase qui déphosphoryle les phosphatidylinositols issus de l'activation de la phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K). Des mutations germinales du gène PTEN ont été mises en évidence dans le syndrome de Cowden, une maladie caractérisée par le développement de polypes le long du tube digestif et associée à un risque accru de cancer. De plus, la perte d'un allèle de Pten chez la souris conduit à la formation d'hyperplasie et de dysplasie du tractus gastro-intestinal ainsi qu'à des tumeurs notamment au niveau du côlon. Ces observations suggèrent que PTEN joue un rôle important dans le tube digestif. Cependant, ses mécanismes d'action dans les cellules épithéliales intestinales sont peu connus. Nos travaux nous ont permis de mieux caractériser les rôles de PTEN dans ces cellules. Pour ce faire, nous avons d'abord analysé l'effet d'un shRNA inhibant spécifiquement l'expression de PTEN dans les cellules Caco-2/15, une lignée cancéreuse colorectale qui a la particularité de se différencier suite à l'atteinte de la confluence en adoptant un phénotype semblable aux cellules absorbantes de l'intestin grêle. La perte d'expression de PTEN stimule la prolifération de ces cellules. Cette augmentation de la prolifération semble résulter d'une diminution de l'expression de p21 et de p27 ainsi que d'une hausse des cyclines D2 et E. De plus, le shRNA contre PTEN inhibe la différenciation fonctionnelle et morphologique des Caco-2/15. Cela découle partiellement de l'inhibition de l'expression des facteurs de transcription CDX2, HNF-1? et HNF-4?. Les jonctions serrées sont également altérées dans ces cellules. En effet, une réduction importante de l'expression des claudines et une augmentation de la perméabilité transépithéliale a été observée. Une augmentation de la synthèse protéique a aussi été remarquée. De plus, nos résultats laissent également croire que PTEN pourraient jouer un rôle dans la carcinogenèse colorectale. Nous avons effectivement constaté une augmentation du potentiel tumorigénique des Caco-2/l5 exprimant le shRNA contre PTEN suite à l'injection des cellules dans des souris nues. De plus, ces cellules ont des capacités de migration et d'invasion accrues. Nous avons également constaté que les niveaux de PTEN sont plus faibles dans plusieurs lignées cancéreuses colorectales comparativement aux cellules épithéliales intestinales normales. Nous avons aussi analysé le phénotype d'une lignée de souris possédant une délétion du gène Pten exclusivement au niveau de l'épithélium intestinal, générée à l'aide du système Cre/loxP. Macroscopiquement, une organomégalie de l'intestin grêle et du côlon a été observé chez les souris déficientes pour Pten. Histologiquement, nous avons constaté une désorganisation de l'architecture épithéliale intestinale caractérisée par un allongement des villosités et par la présence d'embranchements villositaires. De plus, un épaississement important des couches musculaires a été remarqué. Il y a également une augmentation du nombre de cellules prolifératives au niveau des cryptes intestinales corrélant avec une augmentation des niveaux de ?-caténine et des cyclines D. Finalement, une augmentation du contenu protéique par cellule a également été observée ainsi qu'une activation de la voie mTOR. En conclusion, nos résultats montrent que la phosphatase PTEN est impliquée dans l'établissement de l'architecture générale de l'intestin et qu'elle contrôle la synthèse protéique, la migration, le cycle cellulaire ainsi que la différenciation des cellules épithéliales intestinales. De plus, nos résultats indiquent que la perte d'expression de PTEN pourrait influencer la progression des cancers colorectaux. [Symboles non conformes]

Clavicipitaceous fungal endophytes provide several ecological benefits to their hosts. Besides improving host’s growth characteristics, Neotyphodium coenophialum, the endophyte of tall fescue (Lolium arundinaceum), produces ergot alkaloids that have been proposed to be involved in fescue toxicosis. One approach to address the toxicosis problem is to genetically manipulate and modify N. coenophialum by knocking out a pair of homologous genes, (dmaW1 and dmaW2), encoding dimethylallyltryptophan synthase, the enzyme for the first and determinant step in ergot-alkaloid biosynthesis. In this study, disruption of dmaW2 was attempted using several disruption methods. Out of 1522 transformants screened, three putative knockouts were identified. Southern blot analysis of digested genomic DNA indicated that homologous gene replacement at dmaW2 locus took place while dmaW1 was still present. Chromosome separation followed by Southern-blot hybridization showed that the dmaW genes in N. coenophialum are located on different chromosomes. The aim of this study was to obtain a nontoxic endophyte free of marker genes that could be used to inoculate popular tall fescue cultivars. Therefore the Cre/loxP system developed in this study allows reusing the marker gene for sequential transformations. Protoplasts from Neotyphodium coenophialum, Neotyphodium uncinatum, or Epichloë festucae isolates, containing a floxed hygromycin phosphotransferase (hph) gene (loxP::hph::loxP), were transfected with a Crerecombinase expression plasmid and then cultured without selection. The marker was excised in 0.5-2% of the colonies, leaving a single loxP sequence. This strategy will help to reduce the concerns related to field release or commercialization of economically important grasses associated with manipulated fungal strains. It is expected that the technology will likely be adapted and applied in other fungal species. Manipulation of the ergot alkaloid (EA) gene cluster from C. purpurea and C. fusiformis by introducing and expressing its genes in different fungal-grass symbionts was also investigated. Heterologous expression of the ergot alkaloid cluster could result either in the synthesis of compounds similar to the ones produced by the host or in synthesis of novel compounds with new modes of action. Even though the results indicated that several EA genes were expressed in the new symbiota, none of the ergot alkaloids intermediates were detected.

Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Based on their highly bioactive properties in membrane phospholipids, there is growing recognition that dietary n-3 polyunsaturated fatty acids (PUFA) may be of significant benefit in the prevention and treatment of many lifestyle related pathologies, however direct evidence is lacking. The fat-1 transgenic mouse, a genetic model of n-3 PUFA enrichment, is a useful tool in nutritional research which has provided enhanced insight into the health effects of lifelong n-3 PUFA exposure. However, the influence of timing of n-3 PUFA exposure on health related outcomes remains unclear. This thesis describes the functional characterization of the novel Cre recombinase dependent inducible fat-1 (iFat-1) transgene. In the presence of Cre, the iFat-1 transgene was found to reduce phospholipid n-6/n-3 PUFA ratios both in vitro (100%) and in vivo (upwards of 70%), suggesting that the iFat-1 transgene has potential application to address temporal effects of n-3 PUFA in health and disease. / Canadian Institutes of Health Research - Frederick Banting and Charles Best Canada Graduate Scholarship, Sun Life Financial

1 Abstract Diabetes mellitus is characterized by the dysfunction and reduction of insulin-producing cells, resulting in hyperglycemia, which in long term harms the organism. For future therapy, it is crucial to understand the function of various factors participating in the differentiation and maturation of endocrine pancreatic cells. The aim of this study was to unravel the functional role of ISL1 during the development of the pancreas. ISL1 is expressed in all endocrine cells of the islets of Langerhansbut its function remains unclear, especially during early pancreatogenesis. As the global deletion of this gene is embryonically lethal, we used the tissue specific deletion of Isl1 in Neurod1 possitive cells using the Cre-loxP system. In this work we studied the effect of this deletion on the structure of islets of Langerhans, the formation of endocrine cell types and relative expression of genes during early pancreatic development. A defective achitecture of islets together with postnatal absence of α-cells was found in the Isl1 deletion mutant. Also, the expression of genes important for the specification of α-cell lineage and their subsequent function was decreased. The secondary outcome was the optimalization of a protocol for effective sorting of endocrine cells using fluorescent flow cytometry, which...

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The method of directed evolution represents a new approach to generate proteins with new or altered properties. The principle of directed evolution is random mutagenesis of the coding sequence for a protein of our interest followed by selection of generated mutants for the desired property. The aim of this pilot study was to investigate the possibility of utilization of directed evolution for alteration of mouse polyomavirus original tropism and virus retargeting to a model prostate cancer cell line. To generate randomly mutated gene encoding the major capsid protein of mouse polyomavirus, which is responsible for the interaction of the virus with cellular receptor for viral cell entry, error-prone PCR and DNA shuffling methods were used. Production of viruses composed of mutant major capsid protein was ensured by Cre/loxP site-specific recombination. The thesis also dealt with the design and characterization of the system for viral mutant selection. It was found that the prostate cancer cell lines markedly vary in their ability to bind and internalize particles derived from mouse polyomavirus. This knowledge can be used for the preparation of virus-like particles for prostate cancer diagnostics in the future. The study demonstrated that the method of directed evolution can be used for production...