Made available in DSpace on 2015-05-14T13:00:09Z (GMT). No. of bitstreams: 1 arquivototal.pdf: 6176997 bytes, checksum: 84882ba9517a6db053cc7c655b0e9d39 (MD5) Previous issue date: 2014-08-25 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES / Propolis is an heterogeneous mixture of substances, produced by melliferous bees from plants in close proximity with the bee´s hives. It is usually classified according to its botanical origin and chemical composition that vary according to geographical origin. Studies have shown that red propolis have physicochemical and biological properties that are diverse from other propolis types. There is a scarcety of studies with Brazilian red propolis, and no study with the red propolis from Igarassu (PE, Brazil), and thus its botanical origin, chemical characterization, and pharmacological activities have not been determined. The aim of this study was to perform a bioassay-guided fractionation of two propolis samples, collected from Igarassu, in order to determine the substances responsible for its antimicrobial, antioxidant, antileukemic and leishmanicidal activities, as well as its palynological profile. The samples of propolis were collected in Igarassu-PE, in natura, in May 2012 in two apiaries. They were submitted to palynological analyses to identify the pollen types and their frequency in the samples. Then, samples in natura were powdered, extracted with 96% ethanol and concentrated to obtain the crude ethanol extract. This extract was dissolved in a mixture of methanol:water (1:1, v/v) and partitioned with hexane and ethyl acetate, obtaining the hexane, ethyl acetate and hydroalcoholic fractions. The acetate fraction was submitted to column chromatography with Sephadex LH20 for isolation of the compounds. The propolis in natura was subjected to preliminary phytochemical screening. The ethanol extract was evaluated for identification of compounds by HPLC-MS. The propolis in natura, ethanol extract, hexane fraction, ethyl acetate and hydroalcoholic were submitted to HPLC analysis for identification and quantification of phenolic compounds. A total of 28 different pollen types belonging to 16 families and 30 genera were found in the samples. The most frequent were: Serjania and Dalbergia (sample 1 April 2011), Fabaceae 1 and Dalbergia (sample 2 April 2011), Stigmaphyllon (sample 1 and 2 May 2012). It was found the presence of flavonoids and steroids in propolis in natura. Twenty five compounds were identified in the crude ethanol extract of the samples 1 and 2. The major compounds belong to the class of flavonols, flavanas, isoflavones and prenylated benzophenones pterocarpans, demonstrating the usefulness of the technique of LC - Orbitrap - FTMS. The chemical profile of samples 1 and 2 of propolis are characterized by the presence of benzophenone. In propolis in natura, ethanol extract, hexane fraction, ethyl acetate and hydroalcoholic, we were able to identify and quantify 8 substances, 1 phenolic acid and 7 flavonoids. In the ethyl acetate fraction of sample 1 the isoflavone formononetin was isolated. It is observed that during the fractionation, starting from propolis in natura crushed to formononetin isolated substance, there was an increase in fungistatic power. It is observed that with fractionation, starting from propolis in natura to formononetin isolated substance, there was an increase in fungistatic power. Regarding antioxidant activity against DPPH radical, it was observed that all samples showed antioxidant power, with the exception of isolated formononetin. In descending order, in relation to antioxidant power, the most nonpolar samples had higher activity than polar samples. Both propolis in natura as crude ethanol extract showed strong activity against Leishmania promastigotes of L. amazonensis. The antileukemic activity on the cell line HL- 60 also increased with fractionation. / A própolis é uma mistura heterogênea de compostos e é produzida por abelhas a partir de vegetais encontrados próximos às colmeias. É classificada de acordo com a origem botânica e a composição química que pode variar entre as regiões. Estudos têm demonstrado que a própolis vermelha possui características físico-químicas e biológicas diferenciadas. No estado de Pernambuco, até o momento são poucos os trabalhos realizados com a própolis vermelha, e não há na literatura estudos com a própolis vermelha de Igarassu PE, com isso sua origem botânica, caracterização química e suas atividades farmacológicas, ainda não estão definidas. O objetivo deste estudo foi realizar um fracionamento biomonitorado de duas amostras de própolis vermelha, coletadas em Igarassu PE, a fim de determinar os compostos responsáveis pelas atividades antimicrobiana, antioxidante, antileucêmica e antileishmania, além de traçar um perfil palinológico. As amostras de própolis vermelha foram coletadas em Igarassu-PE, na forma in natura, em maio de 2012, em dois apiários. Foram submetidas à análise palinológica, para identificação dos grãos de pólen e dos tipos polínicos presentes. Em seguida, as amostras in natura foram trituradas, extraídas em etanol 96% e concentradas obtendo-se o extrato etanólico bruto seco. Esse extrato foi suspenso em uma mistura de metanol-água (1:1) e fracionado por separação líquido-líquido com hexano e acetato de etila, obtendo-se as frações hexânica, acetato de etila e hidroalcoólica. A fração acetato foi refracionada em coluna de Sephadex LH-20 para isolamento dos compostos. A própolis in natura foi submetida ao screening fitoquimico preliminar. O extrato etanólico foi avaliado para identificação dos compostos por CLAE-EM. A própolis in natura, extrato etanólico, frações hexânica, acetato de etila e hidroalcoólica foram submetidas a análise do perfil cromatográfico por CLAE, análise do perfil fenólico, identificação e quantificação de compostos fenólicos e avaliação das atividades farmacológicas. Nas amostras in natura, foram encontrados 28 tipos polínicos, pertencentes a 16 famílias e 30 gêneros botânicos. Os tipos polínicos que apareceram em maior frequência foram: Serjania e Dalbergia (amostra 1- abril de 2011), Fabaceae 1 e Dalbergia (amostra 2-abril de 2011), Stigmaphyllon (amostra 1 e 2-maio de 2012). Verificou-se a presença de flavonoides e esteroides na própolis in natura. Foram identificados 25 compostos no extrato etanólico bruto das amostras 1 e 2 de própolis vermelha, onde as principais substâncias identificadas pertencem à classe dos flavonols, flavanas, isoflavonas, pterocarpanos e benzofenonas preniladas, demonstrando a utilidade da técnica de LC - Orbitrap - FTMS. O perfil químico das amostras 1 e 2 de própolis vermelha são caracterizados pela presença de benzofenonas. Na própolis in natura, extrato etanólico, frações hexânica, acetato de etila e hidroalcoólica, foram identificadas e quantificadas 8 substâncias, sendo 1 ácido fenólico e 7 flavonoides. Na fração acetato de etila da amostra 1, foi isolada a isoflavona formononetina. Observa-se que ao longo do fracionamento, partindo da própolis in natura triturada até a substância isolada formononetina, houve um aumento no poder fungistático. Em relação a atividade antioxidante, medida pelo método de DPPH, observou-se que todas as amostras apresentaram poder antioxidante, com exceção da substância isolada. Em ordem decrescente, em relação ao poder antioxidante, as amostras mais apolares tiveram maior atividade que as amostras polares. Tanto a própolis in natura triturada assim como o extrato etanólico bruto apresentaram forte atividade antileishmania sobre as formas promastigotas de L. amazonensis. A atividade antileucêmica também aumentou ao longo do fracionamento, sobre a linhagem celular HL-60.

Os compostos lipofílicos da própolis vermelha brasileira (PVB) têm recebido atenção especial devido a interessantes relatos referentes às suas atividades biológicas. Neste contexto, este estudo teve três etapas: a primeira objetivou investigar a atividade do extrato bruto etanólico da PVB e respectivas frações (obtidas com solventes de polaridade crescente, por meio de maceração em temperatura ambiente) contra cepas de Candida não-albicans (CNA) - C. krusei, C. glabrata, C. tropicalis e C. parapsilosis. A concentração inibidora mínima (CIM) foi determinada pelo método de microdiluição em caldo, com concentrações variando entre 1,9 a 500 μg/mL. Dentre as frações testadas, a fração hexânica (HEX) apresentou maior potencial antifúngico, alcançando valor de CIM de 1,95 μg/mL contra espécies de C. parapsilosis. Para cepas de C. glabrata, C. krusei e C. tropicalis, os valores de CIM obtidos foram variáveis (1,95-250 μg/mL). Ensaio colorimétrico de MTT foi utilizado para confirmar o dano celular e os resultados variaram de 80,66 a 94,44%, com extensa morte celular causada pela HEX, incluindo efeitos contra cepas resistentes de CNA, principalmente C. glabrata e C. parapsilosis. Esta potencial capacidade antifúngica está relacionada com compostos lipofílicos, provavalmente benzofenonas polipreniladas (BPPs), anteriormente descritas para PVB. A segunda etapa teve como objetivo avaliar a composição química do extrato hexânico da PVB (HEXred) por CLUE-DAD-EM. A investigação química resultou, principalmente, na identificação de BPPs (oblongifolina A, gutiferona E e/ou xantochimol). Após, um método de CLAE-UV isocrático foi validado para a determinação do teor total de BPPs (a 260 nm) expresso como garcinol, um diasterorisômero da gutiferona E disponível comercialmente. O método mostrou ser específico, exato, preciso e linear (0,1 a 10 μg/mL) para a determinação de BPPS na HEXred e na nanoemulsão (NE) contendo HEXred, bem como em amostras de pele e mucosa suínas, após estudos de permeação/retenção. O efeito matriz foi determinado para todas as matrizes complexas, demonstrando baixo efeito durante a análise. A estabilidade do método foi verificada por meio da exposição da HEXred às condições de estresse ácida, alcalina, oxidativa e térmica. Não houve interferência dos produtos de degradação durante a análise, indicando que o método analítico/bioanalítico proposto provou ser simples e confiável para a determinação de BPPs na presença de diferentes matrizes. Como terceiro passo nós buscamos otimizar a incorporação de BPPs em NE destinada ao tratamento de infecções fúngicas mucocutâneas. A otimização da NE foi realizada por meio de experimento de Box-Behnken, que permitiu avaliar simultaneamente a influência das concentrações do fosfolipídeo da lecitina de gema de ovo, do lípido catiónico DOTAP e das BPPs nas propriedades físico-químicas da NE, bem como na eficiência de associação (EA) das BPPs. Utilizando o software Mini-Tab®, a formulação ótima foi selecionada com base no menor tamanho de gotícula e maiores potencial zeta e eficiência de associação, exibindo um tamanho médio de 140,56 ± 5,22 nm, potencial zeta de + 60,72 ± 3,07 e 99,55 ± 1,09% de EA. Células de difusão do tipo Franz foram usadas para avaliar a distribuição das BPPs através da pele e mucosa suínas, sendo encontradas BPPs nas camadas de ambos os tecidos (principalmente na derme). Uma maior quantidade de BPPs (até 3 vezes) foi detectada na pele e mucosa lesadas o que demonstra o efeito da integridade do tecido na distribuição das BPPs, como sugerido por imagens de microscopia confocal de fluorescência. As BPPs foram detectadas no fluido receptor apenas quando a mucosa esofágica foi lesada. A atividade antifúngica das formulações foi investigada contra espécies de CNA - C. krusei, C. glabrata, C. tropicalis e C. parapsilosis. Os valores de CIM variaram de 0,654 a 2,617 μg/mL, com dano celular superior a 78% como verificado por ensaio de MTT. Tais resultados sugerem que a NE otimizada possui potencial promissor para ser utilizada topicamente para o tratamento de infecções fúngicas mucocutâneas causadas por espécies de CNA. / Lipophilic compounds of Brazilian red propolis (BRP) have received increasing attention due to some interesting findings regarding their biological activities. This study had three steps: first we aimed to investigate the activity of BRP crude ethanolic extract and their fractions (obtained with increasing polarity solvents, through maceration at room temperature) against non-albicans Candida (NAC) strains. Minimal inhibitory concentration (MIC) was determined by the broth microdilution method, with concentrations ranging from 1.9 to 500 μg/mL. Among the tested fractions, n-hexane fraction (HEX) showed higher antifungal potential, achieving MIC values of 1.95 μg/mL against C. parapsilosis strains. On C. glabrata, C. krusei and C. tropicalis strains, variable MIC values were obtained (1.95 to 250 μg/mL). MTT colorimetric assay was employed to confirm the cell damage and the results ranged from 80.66 to 94.44%, with extensive cell death caused by HEX, including the effects against NAC resistant strains, mainly C. glabrata and C. parapsilosis. This potential antifungal capacity showed by HEX is related to the lipophilic compounds, probably polyprenylated benzophenones (PPBs), previous described for BRP. In the second step we aimed to evaluate the chemical composition of BRP n-hexane extract (HEXred) by UPLC-PDA-MS. Chemical investigation mainly resulted in the identification of PPBs in this extract, named oblongifolin A, guttiferone E, and/or xanthochymol. After that, an isocratic HPLC-UV method was validated for the determination of total content of PPBs (at 260 nm) expressed as garcinol, a commercially available guttiferone E diastereoisomer. The method showed to be specific, precise, accurate, and linear (0.1 to 10 μg/mL) for the determination of PPBs in HEXred, BRP-loaded nanoemulsions (NE), as well as, in porcine skin and mucosa samples after permeation/retention studies. The matrix effect was determined for all complex matrices, demonstrating low effect during the analysis. The stability-indicating method was verified by submitting HEXred to acidic, alkaline, oxidative, and thermal stress conditions. No interference of degradation products was detected during analysis, indicating that the proposed analytical/bioanalytical method proved to be simple and reliable for the determination of PPBs in the presence of different matrices. As third step we aimed to optimize the incorporation of PPBs into NE intended for the treatment of mucocutaneous fungal infections. The optimization of NE was performed by means of a Box-Behnken Design, which allowed evaluating simultaneously the influence of the phospholipid egg-lecithin, the cationic lipid DOTAP and PPBs concentrations on the physicochemical properties of NE, as well as on the association efficiency (AE) of PPBs. By using the Mini Tab® software, the optimal formulation was selected based on the smallest droplet size and highest zeta potential and AE, exhibited a mean average size of 140.56±5.22 nm, zeta potential of +60.72±3.07 and AE of 99.55±1.09%. Franz-type diffusion cells were used to evaluate PPBs distribution through porcine skin and mucosa being PPBs found in both mucosa and skin layers (mainly in the dermis). A higher amount of PPBs (up to 3-fold) was detected in impaired skin and mucosa demonstrating the effect of the integrity of the tissue on PPBs distribution, as suggested by confocal fluorescence microscopy images. PPBs were detected in the receptor fluid only when esophageal mucosa was impaired. The antifungal activity of the formulations was investigated against NAC species – C. krusei, C. glabrata, C. tropicalis and C. parapsilosis. MIC values varied from 0.654 to 2.617 μg/mL, with cell damage higher than 78 % as verified by MTT assay. Such results suggest that the optimized NE have promising potential to be used topically for the treatment of mucocutaneous fungal infections caused by NAC strains.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Leishmania is the etiological agent of leishmaniasis. are protozoan trypanosomes genus, obligatory intracellular parasite of the phagocytic system cells mononuclear, with a flagellate form (promastigote), found in the intestinal tract of the insect vector and other intracellular aflagellate (amastigote). In leishmaniasis chemotherapy, pentavalent antimonial are used as first choice drugs. Other drugs such as pentamidine and amphotericin B have been used as alternative drugs. However, these drugs require parenteral administration in the long-term and exhibit serious side effects. Thus, the high toxicity, costs and associated resistance treatments available make it increasingly a search for new substances which can be used in therapy, especially those obtained from natural sources. The objective of this study was to evaluate the chemical profile and the leishmanicide effect in vitro red propolis extracts and Dalbergia ecastophyllum in promastigotes forms of Leishmania chagasi and Leishmania amazonensis. Red Propolis samples and Dalbergia ecastophyllum were collected in the low São Francisco River in Sergipe state, Brazil. The chemical characterization of hydroethanolic extract of propolis was made by Reverse Phase High-performance liquid chromatography (HPLC-FR). Leishmanicidal effect of red propolis extracts and D. ecastophyllum were made in promastigotes of Leishmania chagasi and Leishmania amazonensis by using the Alamar Blue staining method. The cytotoxicity of the propolis extract was evaluated in human macrophages J774 line using the MTT method. By chemical analysis could be identified in red propolis extracts the following phenolic compounds: Vanillic Acid, Ferulic Acid, Rutin, Isoliquiritigenin, Formononetin and Biochanin A, whereas the D. ecastophyllum extract were identified: vanillic acid, Isoliquiritigenin, Formononetin and Biochanin A. As the viability assessment, the obtained ICs50 for red propolis were: 21.54 μg/mL for L. chagasi and 9.73μg/mL for L. amazonensis. For the extract of D. ecastophyllum the ICs50 obtained were 70.47 μg/mL for L. chagasi and 53.42 μg/mL for L. amazonensis. The CC50 of propolis extract in macrophages was 72.63 μg/mL. These results show that the red propolis extract of the low São Francisco has the D. ecastophyllum as botanical origin and it presents leishmanicide potential, with low toxicity. / Os agentes etiológicos da leishmaniose são protozoários tripanossomatídeos do gênero Leishmania, parasito intracelular obrigatório das células do sistema fagocítico mononuclear, com uma forma flagelada (promastigota), encontrada no tubo digestivo do inseto vetor e outra aflagelada intracelular (amastigota). Na quimioterapia da leishmaniose, são utilizados os antimoniais pentavalentes como fármacos de primeira escolha. Outros medicamentos tais como pentamidina e anfotericina B, têm sido empregados como drogas alternativas. Entretanto, estas drogas necessitam de administração parenteral em longo prazo e exibem efeitos secundários graves. Logo, a elevada toxicidade, os custos e a resistência associada aos tratamentos disponíveis fazem com que seja crescente a busca por novas substâncias que possam ser utilizadas na terapia, especialmente aquelas obtidas de fontes naturais. O Objetivo deste trabalho foi avaliar o perfil químico e o efeito leishmanicida in vitro de extratos da própolis vermelha e Dalbergia ecastophyllum, em formas promatigotas de Leishmania chagasi e Leishmania amazonensis. As amostras de própolis vermelha e Dalbergia ecastophyllum foram coletadas na região do baixo São Francisco em Sergipe, Brasil. A caracterização química do extrato hidroetanólico da própolis e D. ecastophyllum foi feita por Cromatografia líquida de alta eficiência em fase reversa (CLAE-FR). A efeito leishmanicida dos extratos da própolis vermelha e da D. ecastophyllum foi feita em promastigotas de Leishmania chagasi e Leishmania amazonensis utilizando método colorimétrico com Resazurina. A citotoxicidade do extrato de própolis foi avaliada em macrófagos humanos da linhagem J774 utilizando o método do MTT. Pela análise química puderam ser identificados no extrato da própolis vermelha os seguintes compostos fenólicos: Ácido Vanílico, Ácido Ferúlico, Rutina, Isoliquiritigenina, Formononetina e Biochanina A, enquanto que no extrato de D. ecastophyllum foram identificados: ácido vanílico, Isoliquiritigenina, Formononetina e Biochanina A. Quanto a avaliação da viabilidade, as ICs50 obtidas para a própolis vermelha foram: 21,54 μg/mL para promastigotas de L. chagasi e 9,73 μg/mL para L. amazonensis. Para o extrato de D. ecastophyllum as ICs50 obtidas foram 70,47 μg/mL para L. chagasi e 53,42 μg/mL para L. amazonensis. A CC50 do extrato de própolis em macrófagos foi de 72,63 μg/mL. Tais resultados mostram que o extrato da própolis vermelha do Baixo São Francisco tem a D. ecastophyllum como origem botânica e que o mesmo apresenta potencial leishmanicida, com baixa toxicidade.

The red propolis of state of Alagoas was highlighted by having a different chemical constitution and to outperform biological activities compared to other types of propolis, which was given geographical indication seal. Lately has been growing the search for products that promote skin protection, associating beyond the effect sunscreen other biological benefits, called multifunction products and among the many biological functions of propolis, we highlight those that provide skin protection. The microparticles facilitate manipulation of certain formulations where spray drying is one of methods to obtaining it. The objective was to develop microparticles propolis-polymer for evaluation of photoprotective activities, antioxidant, antimicrobial and healing in topical preparations. Was obtained hydroalcoholic extract and propolis fractions were the highlight compounds where identifying using HPLC. Was evaluated the Sun Protection Factor-SPF in vitro, antioxidant activity, healing activity in vivo, antimicrobial activity in vitro and toxicity in vivo. Were obtained microparticles by spray drying using biocompatible polymers. This microparticles were analyzed for markers, and characterization analyzes evaluating moisture content, particle size and Scanning Electron Microscope-SEM. The biological activities were also analyzed in microparticulate. The hydroalcoholic extract and propolis fractions were presented as a complex mixture of substances, which have been identified: gallic acid, feluric acid, daidizein, quercetin and formononetin. The Medium-High Polarity Fraction (MHFP) showed the best SPF 2,32 in 1% of concentration and it was better than controls in the healing tests. Topical treatment did not alter glycemic, lipid, renal profile, ion concentration, total proteins and fractions, alkaline phosphatase or lactate dehydrogenase. There was also no change of thyroid or pituitary hormones. The samples showed bacteriostatic/bactericidal and antioxidant activity. It was possible to obtain microparticles of MHFP with chitosan with smooth and uniform suface that was 1 e 3 μm with low moisture content. There was no loss in formononetin content for microparticulate and the biological activities have been preserved. Thus, it was possible to obtain microparticles of MHFP using chitosan polymer with photoprotective action, antioxidant, antimicrobial and wound healing which can be used for cosmetic purposes to prevent skin damage as a multifunctional product. / A própolis vermelha de Alagoas ganhou destaque por possuir uma constituição química diferenciada e superioridade em relação às atividades biológicas quando comparada a outros tipos de própolis, a qual foi conferida selo de indicação geográfica. Ultimamente vem crescendo a busca por produtos que promovam a proteção da pele, associando além do efeito fotoprotetor outros benefícios biológicos, chamados de produtos multifuncionais e dentre as muitas funções biológicas da própolis, destacam-se aquelas que proporcionam a proteção da pele. As micropartículas facilitam a manipulação de certas formulações onde spray drying é um dos métodos de obtenção que vem se destacando. O objetivo do trabalho foi desenvolver micropartículas própolis-polímero para avaliação das atividades fotoprotetora, antioxidante, cicatrizante e antimicrobiana em preparações de uso tópico. Foi obtido extrato hidroalcoólico e frações de própolis onde foram determinados os marcadores utilizando cromatografia líquida de alta eficiência. Foi avaliado o fator de proteção solar (FPS) in vitro, atividade antioxidante, atividade cicatrizante in vivo, atividade antimicrobiana in vitro e toxicidade in vivo. Utilizando o polímero quitosana pela técnica spray drying foram obtidas micropartículas as quais foram avaliadas quanto aos marcadores, teor de umidade, granulometria, FPS in vitro, atividade antioxidante e atividade antimicrobiana in vitro. O extrato hidroalcoólico e frações de própolis apresentaram-se como uma mistura complexa de substâncias, das quais foram identificadas: ácido gálico, ácido felúrico, daidizeína, quercetina e formononetina. A fração de média alta polaridade (FMAP) apresentou melhor FPS, 2,32 na concentração de 1% e desempenho superior na atividade cicatrizante quando comparada aos controles. O tratamento tópico não alterou perfil glicêmico, lipídico, renal, concentração de íons, proteínas totais e frações, fosfatase alcalina nem lactato desidrogenase. Também não houve alteração dos hormônios tireoidianos nem hipofisários. Foi evidenciada atividade bacteriostática/bactericida e antioxidante. Foi possível obter micropartículas da FMAP com quitosana com superfície uniforme, lisas, tamanho predominante entre 1 e 3μm e baixo teor de umidade. Não houve perda no teor de formononetina para os microparticulados e as atividades biológicas foram preservadas. Assim, foi possível obter micropartículas da FMAP utilizando o polímero quitosana com ação fotoprotetora, antioxidante, cicatrizante e antimicrobiana que podem ser utilizadas para fins cosméticos na prevenção de injúrias na pele como um produto multifuncional.

Arterial hypertension it is the leading risk factor for cardiovascular disease. Its prevalence appears to be about 30-45% of the general population. Despite current knowledge the long-term adherence to cardiovascular drugs is still low in hypertension treatment. The Brazilian red propolis has a large content of phenols compounds such as isoflavones, this have been reported to exert beneficial effects in cardiovascular disease, including hypertension. Therefore the objective of this study was to investigate cardiovascular effects from a red propolis gastroretentive system (ESPV, patents register numbers BR 10 2012 013590-6 A2 and WO 2014/186851) in spontaneously hypertensive rats (SHR). The HPLC-UV analysis showed in ESPV chemical composition the presence propolis chemical markers: daidzein, biochanin A, liquiritigenin, pinobanksin, isoliquiritigenin, formononetin and pinocembrina. The cytotoxicity from ESPV was evaluate on macrophage J774 by MTT assay and exhibited IC50 = 72.86 μg/mL. Intravenous injection of ESPV caused a hipotensive dose-dependent effect at 0.1, 0.5, 1, 5 and 10 mg/kg, unchanges heart rate in conscious SHR. The hypotensive effect was not affected by anesthesia. In intact rings of rat mesenteric artery pre-contracted with 10 μM phenylephrine, ESPV induced relaxations (Emax = 100 ± 0.4 %; pD2 = 1.08 ± 0.02 μg/mL) that were affected by endothelium removal, (Emax = 56.7 ± 2 %; pD2 = 1.37 ± 0.04 μg/mL). In an antihypertensive study, ESPV (75 and 150 mg/kg) was orally administered to Juvenile (11-week-old) and young adult (24-week-old) SHRs, and the systolic pressure were measured using the tail-cuff method before and 7, 14, 21 and 28 days after beginning of treatment. Was observed a significant antihypertensive effect from 14th day of treatment only in young adult SHR, with decreased by 56 mmHg compared with baseline systolic blood pressure. Furthermore, the treatment reduced left ventricular hypertrophy in young adult SHR as evident by myocardial morphometry. The vascular function of mesenteric arteries was also investigated at the end of the treatment with ESPV in young adult SHR, the endothelium-independent relaxations to sodium nitroprusside (10-3 to 3.10-4 M) was unchanged compared to control. For other hand, endothelium-dependent relaxations to acetylcholine (10-3 to 3.10-4 M) was markedly improve (Emax = 76.4 ± 3.8% e pD2 = -8.72 ± 3.8 M). We therefore investigated vascular reactivity to acetylcholine (10-3 to 3.10-4 M) also in the presence of the nonspecific NOS inhibitor L-NAME (3.10-3 M), in order to assess NO-dependent relaxation. In these, relaxation response was abolished (Emax = 18.9 ± 1.65% e pD2 = -5.12 ± 0.33 M). Similary, the acetylcholine relaxation in the presence of L-NAME plus a cyclooxygenase antagonist, indomethacin (10-3 M), was too antagonized (Emax = 15.90 ± 1.32 % e pD2 = -5.39 ± 0.24 M), indicating that the response to ESPV treatement involves the enhancement of the nitric oxide via NOS relaxations. These results disclosed that ESPV is effective to lower blood pressure only of young adult SHR, its antihypertensive effect is associated with lowering left ventricular hypertrophy and probably by decrease peripheral vascular resistance, improving endothelial function and increasing the NO-dependent relaxation via NOS. / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Estima-se que hipertensão arterial é o principal fator de risco para doença cardiovascular. Sua prevalência parece ser cerca de 30-45% da população mundial. Contudo, apesar do conhecimento atual, a adesão ao tratamento da hipertensão a longo prazo ainda é baixa. A própolis vermelha brasileira apresenta grande teor de compostos fenólicos em sua constituição química, dentre os quais destacam-se as isoflavonas, metabólitos com efeitos benéficos para doenças cardiovasculares, incluindo hipertensão. Desta forma, o objetivo deste estudo foi investigar os efeitos cardiovasculares de um sistema gastrorresistente de própolis vermelha (ESPV, patentes registradas BR 10 2012 013590-6 A2 e WO 2014/186851) em ratos espontaneamente hipertensos (SHR). A análise HPLC-UV demonstrou a presença dos marcadores químicos para propolis na composição química do ESPV: daidzeína, biochanina A, liquiritigenina, pinobanksina, isoliquiritigenina, formononetina e pinocembrina. A avaliação da citotoxicidade de ESPV, em macrófagos J774 através do ensaio de MTT, revelou IC50 = 72,86 μg/mL. A injeção intravenosa de ESPV causou um efeito hipotensor dependente de dose (0,1; 0,5; 1; 5 e 10 mg/kg), sem alterar a freqüência cardíaca em SHR consciente. O efeito hipotensor não foi afetado pela anestesia. Em anéis de artéria mesentérica pré-contraídos com fenilefrina 10 μM, ESPV induziu vasorrelaxamento (Emax = 100 ± 0,4%; pD2 = 1,08 ± 0,02 μg/mL) que foi afetado pela remoção do endotélio (Emax = 56,7 ± 2%; PD2 = 1,37 ± 0,04 μg/mL). Na avaliação do efeito anti-hipertensivo, o ESPV (75 e 150 mg / kg) foi administrado oralmente a SHRs jovens (11 semanas de idade) e adultos jovens (24 semanas de idade), a pressão sistólica foi então avaliada através do método de medida indireta de pressão arterial tail-cuff antes e 7, 14, 21 e 28 dias após o início do tratamento. Desta forma, observou-se um efeito anti-hipertensivo significativo a partir do 14º dia de tratamento apenas em SHR de adultos jovens, com diminuição de 56 mmHg em comparação com a pressão arterial sistólica basal. Além disso, o tratamento reduziu a hipertrofia ventricular esquerda em SHR de adultos jovens como evidenciado pela morfometria miocárdica. Além disso, a função vascular das artérias mesentéricas de SHR tratados com SHR também foi investigada, o relaxamento independente do endotélio foi avaliado através de uma curva concentração-resposta para nitroprussiato de sódio (10-3 – 3.10-4 M), e sob estas condições permaneceram inalteradas em comparação ao controle. Por outro lado, o relaxamento dependentes do endotélio à avaliado através da curva para acetilcolina (10-3 – 3.10-4 M) apresentou melhorara significativa (Emax = 76,4 ± 3,8% e pD2 = -8,72 ± 3,8 M). Por conseguinte, para avaliar o relaxamento dependente de NO, investigou-se a reatividade vascular à acetilcolina (10-3 – 3.10-4 M) na presença do inibidor inespecífico de NOS, L-NAME (3.10-3 M). Nestas condições, a resposta relaxante foi abolida (Emax = 18,9 ± 1,65% e pD2 = -5,12 ± 0,33 M). Resultados similares, foram obtidos ao avaliar o relaxamento da acetilcolina na presença de L-NAME mais um antagonista da ciclo-oxigenase, a indometacina (10-3 M) (Emax = 15,90 ± 1,32% e pD2 = -5,39 ± 0,24 M), indicando que a resposta ao tratamento com ESPV envolve o aumento do relaxamento dependente de óxido nítrico via NOS. Estes resultados revelaram que o ESPV é eficaz para promover redução da pressão arterial apenas de SHR adultos jovens, que o efeito anti-hipertensivo está associado com a redução da hipertrofia ventricular esquerda e provavelmente pela diminuição da resistência vascular periférica, melhorando a função endotelial e aumentando o relaxamento dependente de NO através da NOS.

Orientador: Alexandra Christine Helena Frankland Sawaya / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-24T09:51:06Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Lopez_BegonaGimenez-Cassina_M.pdf: 5145110 bytes, checksum: e91f0a5d069796983ac9064ccc7af78c (MD5) Previous issue date: 2014 / Resumo: A palavra própolis tem origem Grega: pro significa em defensa de, e polis significa comunidade. A própolis é usada pelas abelhas para fortalecer as paredes da colmeia e para cobrir as paredes internas e por devido a sua atividade antimicrobiana. A composição química da própolis é variável segundo a biodiversidade e a origem geográfica. A própolis vermelha, encontrada no nordeste e norte do Brasil, apresenta promissoras atividades biológicas: atividade antimicrobiana, antiparasitária, antioxidante, citotóxica, antiinflamatória, analgésica, efeitos antiobesidade, contra psoríase e hepatoprotetores. A composição química da própolis vermelha, relatada na literatura, parece variar qualitativa e quantitativamente, inclusive entre amostras coletadas na mesma região. Isto pode ser devido a variações sazonais, a flora direitamente ao redor das colméias ou aos métodos de análise. A maioria das classes de substâncias já identificadas pode ser analisada adequadamente por espectrometria de massas com ionização por eletrospray e cromatografia líquida. Os constituintes de média e alta polaridade (como fenólicos, flavonóides e benzofenonas) são responsáveis por muitas das atividades biológicas reportadas à própolis vermelha. A cromatografia líquida de ultra-eficiência acoplada à espectrometria de massas (UHPLC-MS) é um método moderno, rápido e sensível. Permite avaliar os perfis químicos das amostras e determinar sua composição qualitativamente, comparando os espectros de massas (MS/MS) dos componentes das amostras com informações na literatura. Portanto UHPLC-MS é a ferramenta mais adequada para a avaliação da composição de matrizes complexas como a própolis. A comparação do perfil químico de diversas amostras de própolis vermelha brasileira e a avaliação de sua atividade antimicrobiana e antioxidante permitirá identificar substâncias que possam estar contribuindo para sua bioatividade, e levar á identificação de marcadores químicos para o controle de qualidade destas amostras, bem como possibilitará definir se há um ou vários tipos de própolis vermelha / Abstract: The word, propolis is of Greek origin: pro means in defense of and polis means community. Propolis is used by bees to strengthen the hive walls and cover the inner walls for its antimicrobial activity. The chemical composition of propolis varies depending on the biodiversity and geographic origin. Red propolis from the north and northeast of Brazil shows promising biological activity: antimicrobial, antiparasitic, antioxidant, cytotoxic, anti-inflammatory, analgesic, antiobesity, antipsoriasic and hepatoprotective effects. The chemical composition of red propolis reported in literature seems to vary qualitatively and quantitatively, even between samples collected in the same region. This may be due to seasonal variations, the flora directly around the hives or differences in the analytical methods. Most of the compounds already identified can be analyzed by mass spectrometry with electrospray ionization and liquid chromatography. These compounds of medium and high polarity (phenolics, flavonoids and benzophenones) are responsible for most of the biological activities reported. Ultra efficient liquid chromatography coupled with mass spectrometry (UHPLC-MS) is a modern, fast and sensitive method. It allows the characterization of the chemical profile of the samples and determines their qualitative composition, by comparison of the mass spectra (MS/MS) of the compounds with data from literature. Therefore it is the most adequate tool to evaluate the composition of complex matrixes such as propolis. The comparison of the chemical profile of diverse red propolis samples and evaluation of their antimicrobial and antioxidant activities allow us to identify the compounds responsible for these activities, indicate the marker compounds and define if there is one type, or several types, of red propolis / Mestrado / Fármacos, Medicamentos e Insumos para Saúde / Mestra em Ciências

Este trabalho teve por objetivo o desenvolvimento, padronização e avaliação da atividade antioxidante e antimicrobiana de extratos secos nebulizados de Dalbergia ecastaphyllum. Para que os objetivos propostas fossem alcançadosforam desenvolvidas metodologias analíticas capazes de avaliar a qualidade da matériaprima vegetal durante os processos de transformação (extração de compostos ativos, secagem, produto final, etc). A solução extrativa foi obtida a partir das folhas de D. ecastaphyllum empregando-se a extração por maceração dinâmica onde se avaliou fatores como: proporção planta:solvente, tempo e temperatura de extração através de um planejamento composto central (PCC). A solução extrativa otimizada foi avaliada quanto a presença de metabólitos secundários, atividade antioxidante/ antimicrobiana e foi submetida à secagem por nebulização onde foram investigados parâmetros de secagem e adjuvantes tecnológicos sobre o desempenho do equipamento e nas características morfológicas, físico-químicas e farmacológicas do produto. Os extratos secos foram submetidos a um estudo de estabilidade; sendo também utilizados para o desenvolvimento de formulações semi-sólidas cuja estabilidade foi avaliada em estudo acelerado. Pretende-se que os resultados advindos desse trabalho possam servir de base para a padronização de extratos de outras plantas medicinais com interesse terapêutico, bem como contribuir para o aprimoramento dos conhecimentos envolvidos no desenvolvimento tecnológico de produtos fitoterápicos. / This work aimed the development, standardization and evaluation of antioxidant and antimicrobial activity of spray dried extracts from Dalbergia ecastaphyllum. Analytical methodologies for evaluating the quality of the vegetable raw material during processing procedures (such as extraction of active compounds, drying, final product, etc.) were developed in order to achieve the proposed objectives. The extraction solution was obtained from the leaves of D. ecastaphyllum by dynamic maceration. In this stage, some factors were evaluated such as: the plant: solvent ratio, extraction time and temperature using a central composite design (CCD). The optimized extraction solution was evaluated for the presence of secondary metabolites and antioxidant / antimicrobial activity. It was also subjected to spray drying. In this process, the effects of the drying parameters and processing aids on the equipment performance and the morphological, physicochemical and pharmacological properties of the product were investigated. The dry extracts were subjected to a stability study; and were used for the development of semi-solid formulations, also evaluated in an accelerated stability study. It is intended that the results from this work can provide a basis for further standardization of extracts of other medicinal plants with therapeutic interest, as well as to contribute to the enhancement of the knowledge involved in the technological development of herbal products.

Este trabalho teve por objetivo o desenvolvimento, padronização e avaliação da atividade antioxidante e antimicrobiana de extratos secos nebulizados de Dalbergia ecastaphyllum. Para que os objetivos propostas fossem alcançadosforam desenvolvidas metodologias analíticas capazes de avaliar a qualidade da matériaprima vegetal durante os processos de transformação (extração de compostos ativos, secagem, produto final, etc). A solução extrativa foi obtida a partir das folhas de D. ecastaphyllum empregando-se a extração por maceração dinâmica onde se avaliou fatores como: proporção planta:solvente, tempo e temperatura de extração através de um planejamento composto central (PCC). A solução extrativa otimizada foi avaliada quanto a presença de metabólitos secundários, atividade antioxidante/ antimicrobiana e foi submetida à secagem por nebulização onde foram investigados parâmetros de secagem e adjuvantes tecnológicos sobre o desempenho do equipamento e nas características morfológicas, físico-químicas e farmacológicas do produto. Os extratos secos foram submetidos a um estudo de estabilidade; sendo também utilizados para o desenvolvimento de formulações semi-sólidas cuja estabilidade foi avaliada em estudo acelerado. Pretende-se que os resultados advindos desse trabalho possam servir de base para a padronização de extratos de outras plantas medicinais com interesse terapêutico, bem como contribuir para o aprimoramento dos conhecimentos envolvidos no desenvolvimento tecnológico de produtos fitoterápicos. / This work aimed the development, standardization and evaluation of antioxidant and antimicrobial activity of spray dried extracts from Dalbergia ecastaphyllum. Analytical methodologies for evaluating the quality of the vegetable raw material during processing procedures (such as extraction of active compounds, drying, final product, etc.) were developed in order to achieve the proposed objectives. The extraction solution was obtained from the leaves of D. ecastaphyllum by dynamic maceration. In this stage, some factors were evaluated such as: the plant: solvent ratio, extraction time and temperature using a central composite design (CCD). The optimized extraction solution was evaluated for the presence of secondary metabolites and antioxidant / antimicrobial activity. It was also subjected to spray drying. In this process, the effects of the drying parameters and processing aids on the equipment performance and the morphological, physicochemical and pharmacological properties of the product were investigated. The dry extracts were subjected to a stability study; and were used for the development of semi-solid formulations, also evaluated in an accelerated stability study. It is intended that the results from this work can provide a basis for further standardization of extracts of other medicinal plants with therapeutic interest, as well as to contribute to the enhancement of the knowledge involved in the technological development of herbal products.