Orientador: Élio Hitoshi Shinohara / Banca: Wilson Roberto Poi / Banca: Renato Yassutaka Faria Yaedú / Resumo: O beta fosfato tricálcio (β-TCP) é um biomaterial que possui excelente osteocondução, biocompatibilidade por ser química e cristalograficamente similar ao tecido ósseo humano, além de possuir rápida reabsorção o que diminui reações biológicas. O β-TCP vem sendo utilizado em cirurgias de enxertia óssea, principalmente em regiões superiores de maxila no intuito de favorecer a reabilitação protética com implantes. O objetivo desse trabalho foi avaliar a reparação tecidual de um biomaterial a base de beta fosfato tricálcio o β-TC em levantamento de membrana de seios maxilares de coelhos, através de análises histológica, histomorfométrica e imunoistoquimica. Vinte coelhos Albinus foram submetidos à cirurgia de elevação da membrana do seio maxilar bilateral, onde o seio maxilar do lado direito foi preenchido por coágulo e do lado esquerdo por β-TCP. Após períodos de 3, 7, 15 e 45 dias os animais sofreram eutanásia e tiveram sua maxila removida para processamento e análises histológica, histométrica e imunoistoquímica. Houve formação óssea para ambos os grupos somente a partir do período de 15 dias. Foi aplicado o teste estatístico de Tukey, e houve diferença estatística (p<0,01) entre o grupo controle e o grupo β-TCP. O melhor índice de formação óssea foi para o grupo β-TCP no perído 45 dias (0,0294 ± 33,011 %) em comparação ao grupo controle (1,824 ± 30,502%). Houve também diferença significativa dos grupos entre si, em relação aos períodos estudados. Sendo assim, comprovamos que o βTCP foi um substituto ósseo competente em relação à neoformação óssea e manutenção de área de defeitos clínicos, desejados para uma correta reabilitação oral / Abstract: The beta tri calcium phosphate (β-TCP) is a biomaterial with excellent osteoconductive properties, biocompatibility by being chemically and crystallographically similar to the human bone tissue as well as having rapid reabsorption which reduces biological reactions. The β-TCP has been used in bone grafting surgery, especially in the upper regions of the maxilla in order to facilitate the prosthetic rehabilitation with implants. The aim of this study is to evaluate the healing of a biomaterial-based beta tri calcium phosphate, β-TC in sinus lifting of rabbits, using histological, histomorphometric and immunohistochemistry. Twenty Albinus rabbits underwent surgery to the bilateral maxillary sinus lift, where the right maxillary sinus was filled with blood clot and the left by β-TCP. After periods of 3, 7, 15 and 45 days the animals were euthanized and their jaw removed for processing and histological, immunohistochemistry and histometric analysis. There was bone formation for both groups only from the period of 15 days. The Tukey statistical test was applied, and there was statistical difference (p <0.01) between the control group and the β-TCP group. The best index of bone formation was for the β-TCP group in period prescribed 45 days (33,011 ± 0.0294%) compared to the control group (30.502 ± 1.824%). There were also significant differences among groups in relation to the studied periods. Thus, we proved that the βTCP was a competent bone substitute in relation to bone formation and maintenance area, allowed for proper oral rehabilitation clinical defects / Mestre

O tratamento de defeitos ósseos tem sido um grande obstáculo para as áreas de ortopedia e odontologia, motivando inúmeros estudos na busca por técnicas ou substitutos ósseos adequados. Especificamente na odontologia, um problema comum é o crescimento do epitélio juncional da gengiva, que possui velocidade de proliferação maior que os tecidos constituintes do periodonto de sustentação (osso alveolar, ligamento periodontal e cemento), prejudicando a regeneração desses tecidos. No sentido de contornar essa dificuldade foi proposto a utilização de membranas ou barreiras biológicas para impedir o epitélio de proliferar e ocupar o espaço onde se deseja a regeneração periodontal, caracterizando a técnica denominada de Regeneração Tecidual Guiada (RTG). Nosso propósito foi avaliar histológica e bioquimicamente a resposta celular e absorção da membrana obtida de osso cortical bovino desmineralizado, impregnada ou não com tetraciclina, colocada em subcutâneo de ratos. Os períodos analisados foram de 1, 3, 7, 15, 30 e 60 dias após a colocação do material, usando um total de 120 animais. Os resultados histológicos mostraram para ambas membranas, uma resposta inflamatória de moderada à intensa nos períodos iniciais (1 e 3 dias), moderada nos períodos de 7 e 15 dias, e que diminuiu marcadamente nos dois períodos finais (30 e 60 dias). A reabsorção da membrana foi observada à partir de 15 dias pós-implantação, sendo que após 60 dias, apenas resquícios foram detectados em alguns animais. Os resultados da atividade enzimática mostrou diferenças entre os dois grupos nos períodos iniciais (1, 3 e 7 dias) indicando que a tetraciclina influenciou a resposta celular à membrana modificando a atividade das enzimas lisossomais. Concluímos que a membrana Gen-derm® mostrou-se bem tolerada pelos tecidos sendo completamente reabsorvida após 30-60 dias por células mononucleadas e células gigantes multinucleadas que desaparecem ao final do processo. A impregnação da membrana com tetraciclina não provocou nenhuma mudança histológica aparente, mas modificou significativamente a atividade específica das enzimas analisadas nos períodos iniciais, em particular das enzimas lisossomais. / Guided tissue regeneration, the procedure in witch a barrier is used to keep the epithelium away from root surfaces, has been shown to partially regenerate lost periodontal tissue with new bone, periodontal ligament, and cementum. Several materials, both nonabsorbable and biosorbable barriers have been develop in an attempt to achieve complete periodontal regeneration. More recently, the membrane barriers have also been applied for regenerating bone surrounding peri-implant defects, in the so-called guided bone regeneration. Despite the actual knowledge on the collagen-derived membranes, little information about cellular response to bovine demineralized bone membranes is available. The aim of this study was to evaluate the cellular response and to verify the enzymatic active to organic membrane derived from bovine bone implanted in rat subcutaneous. 120 rats were killed 1, 3, 7, 15, 30 and 60 days post membrane implantation. Microscopic analysis focused the inflammatory response and the membrane integrity during the experimental time. At 7 and 15 days after implantation was observed a moderate inflammatory response, which decreased to the end of experiment. Membrane bioabsorption started 15 days post implantation and just few small pieces last after 60 days. Sparse multinucleated macrophages were observed during the periods, almost disappearing after 60 days. Lisossomal enzyme markers (lisossomal acid phosphatase, arylsulfatase and b-hexosaminidase) and alkaline phosphatase were more active during the first 3 days post-implantation and are not involved in the membrane aborption. The membrane derived from demineralized bovine bone did not induce an immunologic or allergic response and was almost completely absorbed after 60 days.

O estudo de biomateriais aplicados à cicatrização levou à modalidade do tratamento chamada de regeneração tecidual guiada (RTG). A RTG reconstitui novos tecidos usando membranas como barreira de proteção da área defeituosa, impedindo a invasão de outros tecidos, especialmente dos tecidos conjuntivos fibrosos. Em outras palavras, a RTG é uma forma de isolar o tecido ósseo do tecido mole, resultando dessa forma em uma ótima condição para a formação óssea. Atualmente, mais de 20 tipos diferentes de polímeros são usados em aplicações biomédicas, e entre eles está o colágeno, polímero ao qual, pela sua hidrólise parcial pode-se obter a gelatina. A gelatina é um polipeptídeo biodegradável, biocompatível, que apresenta anti-genicidade, plasticidade e elasticidade. A prata tem seu efeito antimicrobiano bem conhecido, com utilidade em diferentes campos da medicina, odontologia e biomateriais. Nesse contexto, este trabalho desenvolve e estuda o comportamento das membranas de gelatina e membranas de gelatina com prata para aplicações em RTG. As Membranas de gelatina foram obtidas com concentração de 4% em massa e as membranas de gelatina com prata foram obtidas nas concentrações de 0,01%, 0,05% e 0,1% da solução. Na etapa de reticulação, as membranas secas foram imersas em solução tampão de fosfato de sódio com concentrações de glutaraldeído (GTA) a 0,5%, 1% e 2%, 24 horas. O ensaio de intumescimento foi realizado em membranas reticuladas e não reticuladas, pesadas e imersas em solução tampão de fosfato pH 7,4 por períodos de 5 minutos, 15 minutos, 30 minutos, 1 hora, 3 horas, 22 horas e 24 horas e durante 8 semanas. Obteve-se membranas de gelatina com prata mediante a metodologia de adição da solução de Ag compravada pelas técnicas de DRX, FTIR, MEV e pelo teste de halo de inibição. As membranas reticuladas apresentaram menor valor de porcentagem de intumescimento quanto maior foi a concentração do agente reticulante, com exceção das amostras com concentração de 0,1M de prata. Além da atuação do GTA a prata também interfere no processo de intumescimento, aspecto e comportamento das membranas de gelatina. O efeito bactericida foi avaliado utilizando ensaio de cultura de bactérias - Teste de halo de inibição, onde as membranas de gelatina com Ag apresentaram efeito bacteriostático contra bactéria Gram positiva e Gram negativa. / The study of biomaterials applied to healing led to the treatment modality called guided tissue regeneration (GTR). The RTG reconstruct new tissue using the membranes as a barrier to protect the defective area, preventing the invasion of other tissues, especially connective tissue fibers. In other words, the RTG is a way of isolating the bone tissue of the soft tissue, thereby resulting in an excellent condition for bone formation. Currently, more than 20 different types of polymers are used in biomedical applications, and among them is the collagen polymer to which, by its partial hydrolysis can get the gelatin. Gelatin is a polypeptide biodegradable, which has antigenicity, plasticity and elasticity. Silver has antimicrobial effect well known, are useful in different fields of medicine, dentistry and biomaterials. In this context, this paper develops and studies the behavior of membranes of gelatin and gelatin silver membranes for applications in RTG. Membranes were obtained with gelatin concentration of 4% by weight and gelatin silver membranes were obtained at concentrations of 0.01%, 0.05% and 0.1% of the solution. In the crosslinking step, the dried membranes were immersed in sodium phosphate buffer to concentrations of glutaraldehyde (GTA) at 0.5%, 1% and 2% 24 hours. The swelling test was performed on crosslinked and uncrosslinked membranes, weighed and immersed in phosphate buffer pH 7.4 for a period of 5 minutes, 15 minutes, 30 minutes, 1 hour, 3 hours 22 hours and 24 hours, and for 8 weeks. Obtained gelatin membranes with silver by the method of adding the solution of Ag proven by XRD techniques, FTIR, SEM and the zone of inhibition test. The crosslinked membranes had lower percentage of swelling the higher the concentration of crosslinking agent, except for the samples with a concentration of 0.1 M silver. In addition to operating the GTA silver also interferes with the process of swelling, appearance and behavior of gelatin membranes. The bactericidal effect was evaluated by bacterial culture test - Test of inhibition zone, where the gelatin membrane with Ag Ag exhibited bacteriostatic effect exhibited against Gram positive and Gram negative.

Orientadores: Maria Lourdes Barjas-Castro, Joyce Annicchino Bizzacchi / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciencias Medicas / Made available in DSpace on 2018-08-05T09:45:37Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Correa_MariaElviraPizzigatti_D.pdf: 882619 bytes, checksum: 8e4b1e53b229c75c79f183dde30c420e (MD5) Previous issue date: 2005 / Resumo: Os adesivos teciduais são produtos originários de proteínas do plasma humano, utilizados como agentes hemostáticos em diferentes procedimentos cirúrgicos. Objetivos: avaliar a influência da cola de fibrina como agente hemostático local após extrações dentárias em pacientes hemofílicos. Analisar a influência dos adesivos nos processos de reparação tecidual em pele e em alvéolo dentário em modelo animal. Capítulo I Pacientes e Métodos: Foram realizadas extrações dentárias em 31 pacientes hemofílicos, sem prévia terapia de reposição de fatores de coagulação. Os pacientes receberam antifibrinolítico oral (Ipsilon® - 200mg/kg, VO, 8/8 horas, por 7 dias). Foi realizada a avaliação da saúde bucal através dos índices: Gengival (IG); Índice de Placa (IP) e através do Índice CPOD (dentes cariados, perdidos e obturados). Após as extrações os alvéolos foram preenchidos com cola de fibrina autóloga. Os pacientes foram avaliados 24 horas após o procedimento. Resultados: em seis procedimentos (19,4%) foram observados sangramentos que foram controlados com reaplicação da cola de fibrina e dose única de fator de coagulação (um hemofílico grave, 3 hemofílicos moderados e em 2 hemofílicos leves). As médias dos índices IG, IP e CPOD foram, no grupo que sangrou, 1,7; 1,8; e 18 e, no que não apresentou sangramento, 1,8; 1,8; e 19, respectivamente. Conclusão: A cola de fibrina foi efetiva como agente hemostático local após extrações dentárias em pacientes hemofílicos, reduzindo significantemente a terapia de reposição de fatores de coagulação. As condições de saúde bucal, refletidas pelos resultados obtidos através da avaliação dos índices IG, IP e CPOD, demonstraram não haver influência desses fatores na eficácia da cola de fibrina autóloga como agente hemostático local. Capítulo II - Material e Métodos: Vinte e cinco ratos Wistar foram submetidos a duas incisões em dorso de pele após anestesia intramuscular. Na incisão do lado direito, foram inseridas esponjas embebidas em Selante de Fibrina associado ao fator XIII e aprotinina (Beriplast P® - Aventis Beringher) e, na incisão do lado esquerdo, foram inseridas esponjas sem adesivos, como controle. Os animais foram divididos em cinco grupos e sacrificados nos dias 1, 7, 14, 21, e 28 após a cirurgia. O tecido do dorso do animal foi dissecado e preparado blocos para análise microscópica (HE). O estudo histomorfométrico foi realizado em microscópio KS400 (40x - Zeiss, Jena). A composição celular do tecido de granulação foi analisada randomicamente, em 20 campos de cada amostra. Os dados foram estatisticamente analisados usando o Wilcoxon signed rank test. Os resultados mostraram um elevado número de células inflamatórias na periferia do grupo com Selante de Fibrina comparado com o controle. Esses dados sugerem que o Selante de Fibrina induziu uma intensa e prolongada resposta inflamatória no processo cicatricial e que o Selante de Fibrina persistiu até 28 dias após a cirurgia.Capítulo III: Material e Métodos: Setenta e cinco ratos Wistar foram submetidos a extração do incisivo superior após anestesia intramuscular. Os ratos foram divididos em 3 diferentes grupos e os adesivos foram aplicados nos alvéolos. O primeiro grupo (25 ratos) recebeu cola de fibrina, o segundo grupo (25) Selante de Fibrina (Beriplast P® - Aventis Beringher) e o terceiro (25) foi considerado como grupo controle. Os animais foram sacrificados por inalação de éter nos dias 1, 7, 14, e 28 após a cirurgia. Os crânios foram dissecados, submetidos a descalcificação e preparados para análise microscópica (HE). O estudo histomorfométrico foi realizado pelo sistema KS400 (Zeiss,Jena). Neoformação óssea foi cuidadosamente delimitada em quatro regiões alveolares. Os dados foram analisados estatisticamente usando regressão múltipla, ANOVA e Turkey test. Os resultados mostraram que a neoformação óssea (µm2) no grupo controle e com Selante de Fibrina foram estatisticamente similar, entretanto o alvéolo que recebeu a cola de fibrina apresentou menor área de formação óssea comparada com o grupo que recebeu o Selante (p=0,0034). Concluindo, os adesivos defibrina não influenciaram no processo de cicatrização óssea / Abstract: Fibrins adhesives are plasma protein derivate and it has been used in different surgical procedures as a local hemostatic agent. Objectives: Evaluate the autologous fibrin glue as a local hemostatic agent after tooth extraction in hemophilia patients. Analyze the influence of the fibrin adhesives in a tissue healing process in skin and alveolar bone in an animal model. Chapter I: Patients and Methods: Thirty-one hemophilic patients were submitted to teeth extractions using autologous fibrin glue and an oral antifibrinolytic drug (epsilon-aminocaproic acid). Oral health indexes (plaque-PI, gingival-GI and decay-missing-filling-teeth-DMFT index) were evaluated before tooth extraction. Results: Post-surgical bleeding episodes were observed in 6 hemophilic patients (1 severe, 3 moderate and 2 mild type). The media of PI and GI in the bleeding group were 1.8 and 1.7, respectively and in the non-bleeding group 1.8 for both (PI: p=0.8; GI: p=0.56). The global DMFT index was 18 in the bleeding group and 19.6 in the non-bleeding group (p=0.67). Conclusion: The autologous fibrin glue was efficient as a local hemostatic agent after tooth extraction in hemophilia patients. The status of oral health did not interfere in the dental extraction bleeding of hemophilic patients. Chapter II: Material and Methods: Twenty-five Wistar rats were submitted to intramuscular anesthesia. Two incisions were realized on animal back and subcutaneous ventrally pockets were made. Into the right side a vegetal sponge imbibed in FS associated to factor XIII and aprotinina (BeriplastP®-Aventis- Beringher) was introduced and in the left side the sponge without FS was insert as control. Animals were divided in 5 groups and they were sacrificed on days 1, 7, 14, 21 and 28 after the surgery. Animal back tissues were dissected and blocks were prepared for light microscopy study (H&E). The morphometric study was performed by microscopy (KS400)-40x. Twenty randomized fields from each sponge were analyzed and the cellular composition of the granulation tissue was examined with regard to its content of capillaries, granulation tissue cells and inflammatory cells. The data were statistically analyzed using the Wilcoxon signed rank test for the weight differences between the numbers of inflammatory cells for each animal in both groups. The results showed a high number of inflammatory cells in the peripheral area of the FS group comparing with the controls. The results suggest that the FS induced an intense and prolonged inflammatory response in wound healing, and the FS persisted up to 28 days after surgery. Chapter III: Material and Methods: Seventy-five Wistar rats were submitted to a superior incisor extraction after intramuscular anesthesia. The rats were divided into tree different groups and the sealants were introduced into the alveolar bone. The first group (25) received human homemade fibrin glue, the second group (25) FS associated to factor XIII and aprotinin(Beriplast®¿Aventis-Beringher) and the third group (25) was the control. Animals were sacrificed by prolonged diethyl inhalation on days 1, 7, 14 and 28 after surgery. Animal craniums were dissected and submitted to a decalcification, and preparated for H&E light microscopy. The morphometric study was performed by means of an interactive computerized image analysis system KS400(Zeiss, Jena). New bone formation was carefully delimited in four different alveolar regions of each specimen. The data were statistically analyzed using multiple regression, ANOVA and Tukey's test. Results showed that the amount of alveolar bone formation(µm2) in the control group and commercial sealant was statistically similar. However, alveolus receiving homemade sealant presented less amount of new bone formation comparing to commercial sealant and control group (p=0.0034). The present study demonstrated that fibrin adhesives did not influence on the alveolar healing process / Doutorado / Clinica Medica / Doutor em Clínica Médica

Orientador: Enilson Antonio Sallum / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Odontologia de Piracicaba / Made available in DSpace on 2018-08-26T23:34:09Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Franca_IsabelaLima_M.pdf: 1330190 bytes, checksum: 6782efacdca31e69f907222817356c7c (MD5) Previous issue date: 2015 / Resumo: O objetivo deste estudo foi avaliar, clinicamente, a utilização do Retalho Semilunar Posicionado Coronariamente (RSPC) para tratamento de recessões gengivais, com ou sem associação à proteína derivada da matriz do esmalte (EMD). Foram selecionados 30 pacientes, que foram randomizados e alocados em dois grupos: teste (RSPC + EMD) e controle (RSPC sozinho). Para serem incluídos no estudo, os indivíduos deveriam apresentar recessões gengivais vestibulares localizadas classe I de Miller com altura maior ou igual a 2,0mm e menor que 4,0 mm, em caninos ou pré-molares superiores. Parâmetros clínicos avaliados: altura da recessão gengival (ARG), largura da recessão gengival (LRG), nível de inserção clínica (NIC), profundidade de sondagem (PS), altura de tecido queratinizado (ATQ), espessura de tecido queratinizado (ETQ) e altura (AP) e largura (LP) das papilas mesial e distal, além de índice de placa (IPL) e índice gengival (IG). Estes parâmetros foram medidos nos seguintes períodos: baseline, 90 dias e 180 dias após o procedimento cirúrgico. Nenhuma diferença estatisticamente significante foi observada entre os grupos em relação à redução da retração gengival com 6 meses de acompanhamento, embora tenha sido encontrada maior porcentagem de cobertura radicular no grupo RSPC+EMD (91%), quando comparado ao RSPC (87%) (p>0,05). Cobertura radicular completa foi obtida em 60% dos sítios no RSPC enquanto no grupo RSPC+EMD foi observada em 66,67% dos sítios. Dentro dos limites do presente estudo pôde-se concluir que o RSPC, associado ou não a EMD, levou a redução da recessão gengival, sem diferença estatística entre os grupos, após 6 meses de acompanhamento pós-operatório / Abstract: The aim of this study was to evaluate clinically the use of the Semilunar Coronally Positioned Flap (SCPF) for the treatment of gingival recessions, with or without Enamel Matrix Derivative (EMD). Thirty patients were selected, randomized and allocated in two groups: test (SCPF + EMD) and control (SCPF alone). To attend the study, subjects should present buccal Miller class I gingival recessions with height greater than or equal to 2.0 mm and less than to 4.0 mm in maxillary canines or premolars. Clinical parameters evaluated: gingival recession height (GRH), gingival recession width (GRW), clinical attachment level (CAL), probing depth (PD), height (HKT) and thickness (TKT) of keratinized tissue and papillas height (HP) and width (LP), as well as plaque and gingival index. These data were collected at baseline, 90 days and 180 days after surgery. No statistically significant difference was observed between the groups regarding the reduction of gingival recession after 6 months of follow-up, although a higher percentage of root coverage was found in SCPF + EMD group (91%), when compared to the SCPF (87%) (p> 0.05). Complete root coverage was observed in 60% of the sites of the control group (SCPF alone) and in 66,67% of the sites of the test group (SCPF+EMD). Within the limits of this study it was concluded that SCPF, associated or not with EMD may provide a reduction in gingival recession, with no statistical difference between groups / Mestrado / Periodontia / Mestra em Clínica Odontológica

Orientador: Rondinelli Donizetti Herculano / Resumo: O látex de natural, extraído da seringueira Hevea brasiliensis, pode estimular a regeneração tecidual, isso ocorre pela formação de capilares sanguíneos que aumentam a vascularização no local de sua aplicação. No entanto, a aplicação do látex natural encontra desafios como o aumento do exsudato quando aplicado em feridas diabéticas, a necessidade de remoção cirúrgica quando utilizado como implante, entre outros. Portanto, é necessário o desenvolvimento de matrizes que apresentem a característica do látex natural de estímulo da regeneração tecidual, aliada à outras propriedades, tais como a absorção de fluídos em aplicações no tratamento de lesões exsudativas, aumento da degradabilidade do material em tratamentos onde o implante é necessário, e o fornecimento de nutrientes que auxiliem na regeneração dos tecidos. O presente trabalho apresenta os resultados do desenvolvimento e caracterização membranas composta por látex natural, alginato e colágeno. Por meio de técnicas padrões de caracterização de biomateriais, foi observado que, devido às suas propriedades mecânicas, químicas e biológicas, membrans híbridas compostos por bNRL, alginato e colágeno mostram uma grande promessa para o tratamento de feridas dérmicas como úlceras diabéticas. A biocompatibilidade das membrans e a capacidade de criar um ambiente favorável ao redor do leito da ferida são características-chave que contribuem para o seu valor em facilitar e acelerar a regeneração de tecidos. / Abstract: Natural latex from the rubber tree Hevea brasiliensis can stimulate tissue regeneration, this occurs by the formation of blood capillaries that increase vascularization at the site of its application. However, the application of natural latex faces challenges such as increased exudate when applied to diabetic wounds, the need for surgical removal when used as an implant, among others. Therefore, it is necessary to develop matrices that have the characteristic of natural latex to stimulate tissue regeneration, combined with other properties, such as fluid absorption in applications in the treatment of exudative lesions, increased material degradability in treatments where the implant it is necessary, and the supply of nutrients that assist in tissue regeneration. The present work presents the results of the development and characterization of membranes composed of natural latex, alginate, and collagen. Through standard techniques for characterizing biomaterials, it was observed that, due to their mechanical, chemical, and biological properties, membranes composed of bNRL, alginate, and collagen show great promise for the treatment of dermal wounds such as diabetic ulcers. The biocompatibility of the membranes and the ability to create a favorable environment around the wound bed are key characteristics that contribute to its value in facilitating and accelerating tissue regeneration. / Doutor

O princípio da regeneração tecidual guiada (RTG) baseia-se na utilização de membranas biocompatíveis com a finalidade de impedir a migração dos tecidos conjuntivo e epitelial para a ferida, permitindo que células do ligamento periodontal repovoem a superfície radicular e regenerem o aparato de inserção do dente. A RTG tem sido utilizada em diversas situações clínicas para facilitar o reparo de defeitos ósseos e periodontais, sendo as membranas de politetrafluoretileno expandido (e-PTFE) as mais utilizadas. O objetivo deste estudo foi avaliar a biocompatibilidade in vitro de uma nova membrana do compósito de poli(vinilideno-trifluoretileno)/titanato de bário (P(VDF-TrFE)/BT). Para isso, osteoblastos, fibroblastos e queratinócitos, células com as quais a membrana entrará em contato durante o processo de RTG, foram cultivados sobre membranas de P(VDF-TrFE)/BT e PTFE (controle). Os seguintes parâmetros foram avaliados: 1) adesão celular por contagem em hemocitômetro; 2) proliferação celular por MTT e 3) adesão e morfologia celular por fluorescência, para as linhagens osteoblástica, fibroblástica e de queratinócitos; 1) medida do conteúdo de proteína total; 2) medida da atividade de fosfatase alcalina (ALP) e 3) formação de matriz mineralizada, para as linhagens osteoblástica e fibroblástica; 1) imunolocalização de ALP por fluorescência; 2) detecção histoquímica in situ da atividade de ALP e 3) expressão dos genes Runx2, Colágeno I (COL I), Ostepontina (OPN), ALP, Sialoproteína óssea (BSP), Osteocalcina (OC), Bax, Bcl-2 e Survivina (SUR) por PCR em tempo real, para a linhagem osteoblástica; 1) expressão dos genes Periostin (PRT), Periodontal Ligament Specific 17 (PDLs17), Calcium-binding protein (S100A4), Fibromodulina (FBM), Bax, Bcl-2 e SUR por PCR em tempo real, para a linhagem fibroblástica e 1) expressão dos genes Involucrina (IVL), Queratina 1 (QRT-1), Queratina 10 (QRT-10), Queratina 14 (QRT-14), Bax, Bcl-2 e SUR por PCR em tempo real, para a linhagem de queratinócitos. Os dados quantitativos foram submetidos ao teste estatístico Mann-Whitney (nível de significância: 5%). A adesão de células osteoblásticas foi semelhante entre P(VDF-TrFE)/BT e PTFE em 30 min, 2 e 4 h (p>0,05). A proliferação de células osteoblásticas foi maior em culturas crescidas sobre o P(VDF-TrFE)/BT em 1, 7 e 10 dias (p<0,05). A epifluorescência indicou que as células osteoblásticas estavam aderidas e mais espraiadas sobre o P(VDF-TrFE)/BT em 30 min, 4 e 24 h. A imunofluorescência revelou presença de ALP apenas em culturas crescidas sobre o P(VDF-TrFE)/BT em 7 e 14 dias. O conteúdo de proteína total foi semelhante entre as duas membranas em 10 dias (p>0,05) e maior sobre o P(VDF-TrFE)/BT em 7 e 14 dias (p<0,05). Não houve diferença estatisticamente significante para atividade de ALP em 7 dias (p>0,05), entretanto em 10 e 14 dias (p<0,05) a atividade de ALP foi maior em culturas sobre o P(VDFTrFE)/ BT. A detecção histoquímica in situ revelou atividade de ALP apenas em culturas crescidas sobre o P(VDF-TrFE)/BT, tanto aos 7 quanto aos 14 dias. A formação de matriz mineralizada ocorreu apenas em culturas crescidas sobre o P(VDF-TrFE)/BT. A expressão dos genes Runx2, COL I, OPN, ALP, BSP, OC, Bax e SUR foi maior em células cultivadas sobre o P(VDF-TrFE)/BT em 7 e 14 dias (p<0,05). Não houve expressão de Bcl-2 em culturas sobre as duas membranas. A adesão de células fibroblásticas foi semelhante entre P(VDFTrFE)/ BT e PTFE em 30 min (p>0,05) e maior sobre o P(VDF-TrFE)/BT em 2 e 4 h (p<0,05). A proliferação de células fibroblásticas foi estatisticamente semelhante entre as duas membranas em 3 dias (p>0,05) e maior em culturas crescidas sobre o P(VDF-TrFE)/BT em 1 e 7 dias (p<0,05). Os ensaios de fluorescência direta revelaram que as células fibroblásticas estavam aderidas sobre as duas membranas, porém em estágios mais avançados de espraiamento sobre o P(VDF-TrFE)/BT em 30 min, 2 e 4 h. O conteúdo de proteína total foi maior sobre o P(VDF-TrFE)/BT em 10, 14 e 21 dias (p<0,05). Não se observou atividade de ALP em culturas fibroblásticas sobre as membranas de P(VDF-TrFE)/BT e PTFE aos 7 dias. Contudo, em 14 dias (p>0,05) a atividade de ALP foi semelhante entre as duas membranas e em 21 dias (p<0,05) foi estatisticamente significante em culturas crescidas sobre o P(VDF-TrFE)/BT. Aos 21 dias não se notou formação de matriz mineralizada em ambas as membranas. A expressão dos genes PRT, PDLs17, S100A4, FBM, Bax e SUR foi maior em culturas sobre o P(VDF-TrFE)/BT em 7 e 14 dias (p<0,05). A expressão de Bcl-2 foi maior em células fibroblásticas cultivadas sobre o PTFE em 7 e 14 dias (p<0,05). A adesão de queratinócitos foi semelhante entre P(VDF-TrFE)/BT e PTFE em 30 min, 2 e 4 h (p>0,05). A proliferação de queratinócitos foi estatisticamente semelhante entre as duas membranas em 4, 7, 10 e 14 dias (p>0,05) e maior sobre culturas crescidas sobre P(VDF-TrFE)/BT em 1, 17 e 21 dias (p<0,05). Por fluorescência direta notou-se que células cultivadas sobre ambas as membranas exibiam morfologia predominantemente arredondada em 30 min, 4 e 24 h. A expressão do gene IVL foi semelhante em culturas crescidas sobre as duas membranas em 7 dias (p>0,05) e maior sobre o P(VDF-TrFE)/BT em 14 dias (p<0,05). Os genes QRT-1, QRT -10 e QRT -14, Bax e SUR estavam mais expressos em culturas sobre o P(VDF-TrFE)/BT em 7 e 14 dias (p<0,05). A expressão de Bcl-2 foi maior em queratinócitos crescidos sobre o PTFE em 7 dias (p<0,05) e semelhante entre as duas membranas em 14 dias (p>0,05). Por favorecer eventos relacionados ao desenvolvimento tecidual, como a adesão, proliferação e diferenciação celular, a membrana de P(VDF-TrFE)/BT pode representar uma boa alternativa ao PTFE para procedimentos de RTG. / The principle of guided tissue regeneration (GTR) is based on the use of physical barrier to isolate periodontal defects of the gingival connective and epithelial tissues so that bone, periodontal ligament, and cementum can be regenerated from their own cells. RTG procedure has been used in many clinical situations to promote bone and periodontal regeneration. Membranes of expanded polytetrafluoroethylene (e-PTFE) are the most commonly used material for GTR. However, several membranes have been tested to be applied in GTR. The purpose of this study was to evaluate the in vitro biocompatibility of the membrane of poly(vinylidene-trifluoroethylene/barium titanate (P(VDF-TrFE)/BT) composite. For that, osteoblasts, fibroblasts and keratinocytes, cells that will interact with the membrane during RTG, were culture P(VDF-TrFE)/BT and PTFE (control) membranes for up to 21 days. The following parameters were evaluated: 1) cell adhesion by counting in hemocytometer, 2) cell proliferation and 3) cell morphology by fluorescent labeling, for osteoblastic, fibroblastic and keratinocyte lineages; 1) total protein content; 2) alkaline phosphatase (ALP) activity and 3) mineralized bone-like nodule formation, for osteblastic and fibroblastic lineages; 1) immunolocalization of ALP by fluorescent labeling; 2) histochemistry detection in situ of ALP activity and 3) gene expression of Runx2, Collagen I (COL I), Ostepontin (OPN), ALP, Bone Sialoprotein (BSP), Osteocalcin (OC), Bax, Bcl-2 and Survivin (SUR) by real-time PCR, for osteoblastic lineage; 1) gene expression of Periostin (PRT), Periodontal ligament specific (PDLs17), Calcium-binding protein (S100A4), Fibromodulin (FBM), Bax, Bcl-2 and SUR by real-time PCR, for fibroblastic lineage; 1) gene expression of Involucrin (IVL), Keratin-1 (QRT-1), Keratin-10 (QRT-10), Keratin-14 (QRT- 14), Bax, Bcl-2 and SUR days by real-time PCR, for keratinocyte lineage. Data were submitted to Mann-Whitney test (level of significance: 5%). The adhesion of osteoblastic cells was similar between P(VDF-TrFE)/BT and PTFE at 30 min, 2 and 4 h (p>0.05). Cell proliferation was higher in ostegenic cultures grown on P(VDF-TrFE)/BT at 1, 7 and 10 days (p<0.05). Epifluorescence showed that osteoblastic cells grown on P(VDF-TrFE)/BT were more adhered and spread compared to PTFE at 30 min, 4 and 24 h. Immunofluorescence revealed the presence of ALP only in osteogenic cultures grown on P(VDF-TrFE)/BT at 7 and 14 days. Total protein content was similar between the membranes at 10 days (p>0.05) and higher on the P(VDF-TrFE)/BT at 7 and 14 days (p<0.05). There was no differences in ALP activity at 7 days (p>0.05). However, ALP activity was higher in osteogenic cultures on the P(VDF-TrFE)/BT at 10 and 14 days (p<0.05). The histochemistry reveals that only ostegenic cultures grown on P(VDF-TrFE)/BT had ALP activity in situ at 7 and 14 days. Bone-like nodule formation occurred only in cultures on the P(VDF-TrFE)/BT at 21 days. Gene expression of Runx2, COL I, OPN, ALP, BSP, OC, Bax and SUR was higher in cultures grown on P(VDF-TrFE)/BT at 7 and 14 days (p<0.05). There was no expression of Bcl-2 in cultures on both membranes. The adhesion of fibroblastic cells was similar between P(VDFTrFE)/ BT and PTFE at 30 min (p>0.05) and greater in fibroblastic cultures on P(VDFTrFE)/ BT at 2 and 4 h (p<0.05). Cell proliferation was similar in fibroblastic cultures grown on both membranes at 3 days (p>0.05) and higher in cultures on P(VDF-TrFE)/BT at 1 and 7 days (p<0.05). Epifluorescence showed that fibroblastic cells grown on P(VDF-TrFE)/BT were more adhered and more spread compared to PTFE at 30 min, 4 and 24 h. Total protein content was greater on P(VDF-TrFE)/BT at 10, 14 and 21 days (p<0.05). There was no ALP activity in fibroblastic cultures grown on both membranes at 7 days. The ALP activity was similar between P(VDF-TrFE)/BT and PTFE at 14 day (p>0.05) and higher on P(VDFTrFE)/ BT at 21 days (p<0.05). Bone-like nodule formation was not observed in fibroblastic cultures on both membranes at 21 days. Gene expression of PRT, PDLs17, S100A4, FBM, Bax and SUR was higher in cultures on the P(VDF-TrFE)/BT at 7 and 14 days (p<0.05). Bcl- 2 expression was higher in fibroblastic cultures on the PTFE at 7 and 14 days (p<0.05). Keratinocyte adhesion was similar for P(VDF-TrFE)/BT and PTFE at 30 min, 2 and 4 h (p>0.05). Keratinocyte proliferation was statistically similar on both membranes at 4, 7, 10 and 14 days (p>0.05) and higher in cultures grown on P(VDF-TrFE)/BT at 1, 17 and 21 days (p<0.05). Keratinocytes displayed a round morphology and was not observed any evidence of cell spreading at 30 min, 4 and 24 h. The gene expression of IVL was similar in cultures grown on P(VDF-TrFE)/BT and PTFE at 7 days (p>0.05) and higher on the P(VDF-TrFE)/BT at 14 days (p<0.05). Genes expression of QRT-1, QRT-10, QRT-14, Bax and SUR was greater in keratinocytes grown on P(VDF-TrFE)/BT at 7 and 14 days (p<0.05). Bcl-2 expression was higher in keratinocytes cultured on PTFE at 7 days (p<0.05) and similar on both membranes at 14 days (p>0.05). Our study indicates that P(VDF-TrFE)/BT membrane promote events related to tissue development/regeneration, such as cell adhesion, proliferation and differentiation. Thus, the membrane of P(VDF-TrFE)/BT could be used as an advantageous alternative to PTFE in GTR procedures.

Nesta tese, foram produzidas e estudadas membranas de gelatina e quitosana com nanopartículas de prata, visando obter sinergia em suas propriedades para aplicações em engenharia de tecidos. Os materiais foram escolhidos por suas propriedades e aplicações similares. A gelatina é um polipeptídio biocompatível e biodegradável, obtido do colágeno de animais. A quitosana, um polímero encontrado na parede celular de alguns organismos do reino fungi, pode ser obtida da desacetilação da quitina. É biocompatível, biodegradável, e pode ter efeito antimicrobiano. Nanopartículas de prata também têm efeito antimicrobiano. As membranas foram preparadas por método de casting, e as nanopartículas de prata (AgNPs) foram sintetizadas com o método de Turkevich adaptado (TK-AgNPs) e outro similar com adição de ácido tânico (AT-AgNPs). Membranas com diferentes composições foram fabricadas: de gelatina apenas, de quitosana, e blendas de gelatina com quitosana (GQ), com adição de diferentes concentrações de AT-AgNPs ou TK-AgNPs, reticuladas com glutaraldeído (Gta) ou não. O objetivo era identificar uma composição com boa capacidade antimicrobiana e baixa toxicidade para células humanas. As membranas eram visualmente homogêneas, e a incorporação de nanopartículas foi comprovada por difração de raios X e espectroscopia no infravermelho. As AT-AgNPs eram menores e mais monodispersas do que as TK-AgNPs. As membranas contendo apenas quitosana e gelatina não apresentaram atividade antimicrobiana. As que continham AgNPs foram tóxicas para a bactéria Gram- positiva Staphylococcus aureus segundo testes de halo de inibição, com toxicidade dependente da concentração de AgNPs. As mais eficazes foram as membranas quitosana/TK- AgNPs/Gta, GQ 0,05% AT-AgNPs e GQ 0,1% AT-AgNPs. Nenhuma das membranas apresentou toxicidade contra células de fibroblastos humano. Tais resultados confirmam a possibilidade de aplicação dos materiais estudados como curativos para regeneração tecidual. / In this thesis, gelatin and chitosan membranes with silver nanoparticles were produced and studied, aiming at obtaining synergy in their properties for tissue engineering applications. The materials were chosen for their similar properties and applications. Gelatin is a biocompatible and biodegradable polypeptide derived from animal collagen. Chitosan, a polymer found in the cell wall of some fungi, can be obtained from the deacetylation of chitin. It is biocompatible, biodegradable, and may have antimicrobial effect. Silver nanoparticles also have antimicrobial effect. The membranes were prepared using the casting method, and the silver nanoparticles (AgNPs) were synthesized with an adapted Turkevich method (TK- AgNPs) and a similar one with addition of tannic acid (AT-AgNPs). Membranes with different compositions were made: gelatin only, chitosan, and blends of gelatin and chitosan (GQ), with the addition of different concentrations of AT-AgNPs or TK-AgNPs, crosslinked with glutaraldehyde (Gta) or not. The objective was to identify a composition with good antimicrobial capacity and low toxicity to human cells. The membranes were visually homogeneous, and the incorporation of nanoparticles was confirmed by X-ray diffraction and infrared spectroscopy. The AT-AgNPs were smaller and more monodisperse than the TK- AgNPs. Membranes containing only chitosan and gelatin had no antimicrobial activity. Those containing AgNPs were toxic to the Gram-positive Staphylococcus aureus bacterium according to halo tests, with AgNP concentration-dependent toxicity. The most effective were the chitosan/TK-AgNPs/Gta membranes, 0.05% GQ AT-AgNPs and 0.1% GQ AT-AgNPs. None of the membranes showed toxicity against human fibroblast cells. These results confirm the possibility of application of the membranes as curatives for tissue regeneration.

Made available in DSpace on 2013-08-07T19:05:22Z (GMT). No. of bitstreams: 1 000418546-Texto+Completo-0.pdf: 3263858 bytes, checksum: 98405799e09a5518c35fdb38c15ba169 (MD5) Previous issue date: 2009 / Tissue engineering and regeneration involves the use of multipotent precursor cells associated with biomaterials that are capable of providing these cells with a threedimensional environment similar to the extracellular matrix found in living organisms. The objective of this study was to enhance a hydroxypropyl methylcellulose (HPMC) hydrogel with two scaffold properties, via independent processes, so as to produce a hydrogel capable of being molded or favorable for three-dimensional cell adhesion. Previously described methods were employed to develop effective elastic (moldable) properties through the synthesis of silane on HPMC (Si-HPMC). This synthesis caused the hydrogel to acquire a gelatin state, moldable according to the defect to be corrected, as a result of pH-controlled auto-cross-linking. In a parallel experiment, following another trend in the development of hydrogel scaffolds, HPMC was synthesized with RGDS (arginine-glycine-aspartic acid-serine) adhesion peptides through esterification (RGDS-HPMC). This process provided the hydrogel with adhesion sites, aimed at allowing its interaction with cells in a three-dimensional environment. Next, the viability of human adipose-derived adherent stromal (hADAS) cells cultured in two-dimensional environments in the presence of pure HPMC, Si-HPMC, and RGDS-HPMC hydrogels was tested to assess cytotoxicity (MTT assay – ISO 10993-5). A comparison was performed between the groups and also with negative (NC) and positive controls (PC) after incubation for 24, 48 and 72 hours. No impact was recorded on cell viability (% MTT activity) at the three incubation times with any of the hydrogels when compared to PC (p < 0. 001). Cells cultured in contact with hydrogels showed viability results similar to those of NC. Despite being nontoxic in contact with twodimensional cell cultures, three-dimensional cytotoxicity tests should be performed to confirm the effectiveness of Si-HPMC and RGDS-HPMC hydrogels as suitable scaffolds for use in tissue engineering and regeneration. / A regeneração e engenharia de tecidos passam pela aplicação de células precursoras multipotentes associadas a biomateriais, os quais devem oferecer a elas um ambiente tridimensional análogo à matriz extracelular existente nos organismos vivos. Aprimorar um hidrogel de hidroxipropilmetilcelulose (HPMC), agregando a ele duas funções características de scaffolds, isto é, ser moldável ou favorável à adesão celular tridimensional, para o uso em regeneração e engenharia de tecidos foi a intenção do presente estudo. O desenvolvimento de uma propriedade moldável foi obtido baseado em experiências da literatura que citam a síntese de HPMC com silano (HPMC-Si). Esta síntese permitiu que o hidrogel assumisse o aspecto de gelatina, através de autorreticulação em função do pH, moldável de acordo com o defeito a ser corrigido. Paralelamente, seguindo outra tendência no desenvolvimento de scaffolds compostos por hidrogéis, sintetizou-se HPMC com peptídeos R-G-D-S (arginina- glicina- ácido aspártico- serina), através de reação por esterificação. Isto conferiu ao hidrogel sítios de adesão, visando a sua interação com células dentro de um contexto tridimensional.A partir das sínteses, avaliou-se a viabilidade de células aderentes adiposoderivadas humanas (CAADh), cultivadas em 2D na presença dos hidrogéis HPMC pura, HPMC-Si e HPMC-RGDS, para se determinar a citotoxicidade dos mesmos (ensaio MTT – de acordo com a ISO 10993-5), comparando-os entre si e com grupos-controle negativo (CN) e positivo (CP), em 24, 48 e 72h. Os três hidrogéis presentes nas culturas não interferiram na viabilidade das células (% de atividade MTT), durante os 3 momentos observados, quando comparados com o grupo CP (P< 0,001). Ao mesmo tempo, as células cultivadas em contato com os géis demonstraram viabilidade semelhante ao grupo CN. Entretanto, ainda que sejam atóxicos em contato com culturas de células em monocamada, testes de citotoxicidade em 3D devem confirmar a efetividade dos hidrogéis aprimorados HPMC-Si e HPMC-RGDS como scaffolds aplicáveis em regeneração e engenharia de tecidos.

Submitted by Reginaldo Soares de Freitas (reginaldo.freitas@ufv.br) on 2017-03-14T17:21:19Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 2096818 bytes, checksum: edfc338541cbd517cdc3d9a342b6fbb7 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-03-14T17:21:19Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 2096818 bytes, checksum: edfc338541cbd517cdc3d9a342b6fbb7 (MD5) Previous issue date: 2016-07-28 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / A bioengenharia tecidual busca a aplicação de princípios e métodos da engenharia e das ciências da saúde para assistir e acelerar a regeneração e o reparo de tecidos defeituosos ou danificados, superando as limitações dos tratamentos convencionais vigentes. Assim, os biomateriais são utilizados em interface com sistemas biológicos para avaliar, tratar, aumentar ou substituir tecidos, órgãos ou funções no organismo e são cada vez mais utilizados para o tratamento de lesões. O benefício exercido por estes na regeneração tecidual in vivo está relacionado diretamente a diversas características como a biocompatibilidade, porosidade, e topografia de superfície complexa. Portanto, este trabalho teve por objetivo, caracterizar os compósitos de hidroxiapatita e fibroína de seda quanto a suas propriedades físico-químicas e biocompatibilidade in vitro e in vivo. Para isso, foram realizados testes in vitro onde os biomateriais foram colocados em contato com linhagens de fibroblastos de camundongo (NIH/3T3) e posteriormente avaliados com microscopia eletrônica de varredura, para avaliação de adesão celular, e a microscopia ótica para avaliação da citotoxidade por contato direto. A cristalinidade da hidroxiapatita e da fibroína de seda foram avaliados por difração de Raios – X. O teste in vivo compreendeu a implantação de três biomateriais na região dorsal de coelhos. Posteriormente, o material foi coletado e envolveu pele, tecido subcutâneo, compósito, se houver, e tecido muscular e foram encaminhados para o processamento e análise histológica. Os compósitos analisados apresentaram elevada cristalinidade, superfície complexa e porosa com grânulos de hidroxiapatita na superfície, in vitro, observou-se, a ausência de citotoxicidade, além da adesão e proliferação celular na superfície e em torno das placas de hidroxiapatita e fibroína de seda. Além de demonstrarem biocompatibilidade in vivo incitando respostas toleráveis do organismo. Os resultados indicam que o biomaterial é um candidato à aplicação como suporte para o crescimento celular na regeneração tecidual. / Tissue bioengineering seeks the application of engineering and health sciences principles and methods in order to support and speed up the regeneration and repair of damaged or flawed tissue, overcoming the limitations of current conventional treatment practices. This way, biomaterials are used in interface with biological systems to assess, treat, expand or replace tissue, organs or specific functions of organs in organisms, and are being increasingly employed in the treatment of injuries. The benefit held by that practice in tissue regeneration in vivo is directly related to many characteristics, such as biocompatibility, porosity, and topography of complex surfaces.Thus, the goal of the present work is to characterize hydroxyapatite and silk fibroin composites regarding their physicochemical properties and biocompatibility in vivo and in vitro. In order to achieve that, tests in vitro were conducted where biomaterials were put in contact with fibroblast lines of rats (NIH/3T3), and then evaluated by scanning electron microscopy in order to assess cell adhesion, and by optical microscopy to assess the cytotoxicity via direct contact. The crystallinity of the hydroxyapatite and silk fibroin was assessed by X-Ray diffraction. The test in vivo consisted in the implementation of three types of biomaterials in the dorsal region of rabbits. Afterwards, the material was collected and it was composed by skin, subcutaneous tissue, composite, in case it exists, and muscular tissue, and then submitted to processing and histological analysis. The analyzed composites presented increased crystallinity, complex and porous surfaces with hydroxyapatite granules on its surface. In vitro, it was possible to observe the absence of cytotoxicity, and also cellular adhesion and proliferation on the surface and around the hydroxyapatite and silk fibroin plaques. It also demonstrated biocompatibility in vivo, driving the organism to tolerable responses. The results point out that the biomaterial is a viable candidate to the application as a support for cellular growth in tissue regeneration.