Made available in DSpace on 2015-06-17T19:34:40Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2014-12-08. Added 1 bitstream(s) on 2015-06-18T12:47:16Z : No. of bitstreams: 1 000830398_20160310.pdf: 112220 bytes, checksum: eec50147cf047427bc8ea95f93fd39b0 (MD5) Bitstreams deleted on 2016-03-11T14:06:55Z: 000830398_20160310.pdf,. Added 1 bitstream(s) on 2016-03-11T14:07:36Z : No. of bitstreams: 1 000830398.pdf: 1275187 bytes, checksum: 8547f733167cd9ca10a7f85e869a3850 (MD5) / A cartilagem articular é um tecido que possui capacidade limitada de reparo após uma lesão aguda, e a eficácia dos tratamentos atuais geralmente resulta em alívio dos sintomas, e não em regeneração do tecido lesado. Incidindo sobre esta problemática, o objetivo do presente trabalho, foi avaliar o efeito da terapia com células-tronco mesenquimais (CTM) autólogas na regeneração da cartilagem articular de joelhos de coelhos submetidos a osteoartrite experimental. Foram utilizados 24 coelhos da raça Nova Zelândia Branca, os quais foram divididos aleatoriamente em quatro grupos: GC (grupo controle); GPRP (grupo plasma rico em plaquetas); GCTM (grupo células-tronco mesenquimais autólogas indiferenciadas); GCTMdif (grupo células-tronco mesenquimais autólogas diferenciadas em condrócitos. Todos os animais foram induzidos a osteoartrite por meio da aplicação de solução de colagenase, e após quatro semanas receberam os tratamentos propostos para cada grupo. Após sessenta dias da terapia, os animais foram eutanasiados e as superfícies articulares foram submetidas a avaliações macroscópicas e histomorfológicas. Paralelamente foram realizadas diferenciações adipogênicas, condrogênicas e osteogênicas das CTM, caracterizações das mesmas por meio de análise citométrica, e avaliações de danos citogenéticos pelo Teste do Cometa. Os resultados dos exames macroscópicos e histomorfológicos revelaram um melhor tecido de reparação nos grupos tratados com CTM. As análises citométricas apresentaram resultados de imunomarcações positivos para CTM, e as diferenciações revelaram que as CTM foram capazes de se diferenciar em adipócitos, condrócitos e osteoblastos. Por meio do Teste do Cometa, foi possível notar que os danos citogenéticos aumentaram após a segunda passagem das CTM. Conclui-se que há efeitos benéficos da associação de CTM derivadas do tecido adiposo e plasma rico em plaquetas na regeneração ... / The articular cartilage is a tissue that has limited capacity for repair after an acute injury, and the efficacy of current treatments usually results in relief of symptoms, and not in regeneration of damaged tissue. Focusing on this issue, the aim of this work was to evaluate the effect of therapy with autologous mesenchymal stem cells (MSC) in the regeneration of rabbits articular cartilage submitted to experimental knee osteoarthritis. Twenty four adult New Zealand White rabbits were randomly divided into four groups: GC (control group); GPRP (platelet rich plasma group); GCTM (undifferentiated autologous mesenchymal stem cells group); GCTMdif (chondrocyte differentiated autologous mesenchymal stem cells group). All animals were osteoarthritis-induced by application of collagenase solution, and four weeks after induction, they received the specific treatments to each group. After sixty days of therapy, the animals were sacrificed and articular surfaces were submitted to macroscopic and histomorphological evaluations. At the same time were performed adipogenic, chondrogenic and osteogenic differentiation of MSC, characterizations through cytometric analysis, and evaluation of cytogenetic damage by the Comet Assay. The macroscopic and histomorphological examinations revealed a better repair tissue in the groups treated with MSC. Cytometric analyzes showed positive results for MSC immunostaining, and differentiation showed that MSC were able to differentiate into adipocytes, chondrocytes and osteoblasts. Through the Comet Assay, it was noticeable that the cytogenetic damage increased after the second passage of the MSC. It was concluded that there are beneficial effects of the combination of MSC derived from adipose tissue and platelet-rich plasma in the regeneration of articular cartilage in knees of rabbits undergoing experimental osteoarthritis, and there is no difference when MSC are used undifferentiated or differentiated into ...

Orientador: Áureo Evangelista Santana / Coorientador: Elenice Deffune / Banca: Fernando De Biasi / Banca: Raimundo Souza Lopes / Banca: Luis Gustavo Gosuen Gonçalves Dias / Banca: Paola Castro Moraes / Resumo: A cartilagem articular é um tecido que possui capacidade limitada de reparo após uma lesão aguda, e a eficácia dos tratamentos atuais geralmente resulta em alívio dos sintomas, e não em regeneração do tecido lesado. Incidindo sobre esta problemática, o objetivo do presente trabalho, foi avaliar o efeito da terapia com células-tronco mesenquimais (CTM) autólogas na regeneração da cartilagem articular de joelhos de coelhos submetidos a osteoartrite experimental. Foram utilizados 24 coelhos da raça Nova Zelândia Branca, os quais foram divididos aleatoriamente em quatro grupos: GC (grupo controle); GPRP (grupo plasma rico em plaquetas); GCTM (grupo células-tronco mesenquimais autólogas indiferenciadas); GCTMdif (grupo células-tronco mesenquimais autólogas diferenciadas em condrócitos. Todos os animais foram induzidos a osteoartrite por meio da aplicação de solução de colagenase, e após quatro semanas receberam os tratamentos propostos para cada grupo. Após sessenta dias da terapia, os animais foram eutanasiados e as superfícies articulares foram submetidas a avaliações macroscópicas e histomorfológicas. Paralelamente foram realizadas diferenciações adipogênicas, condrogênicas e osteogênicas das CTM, caracterizações das mesmas por meio de análise citométrica, e avaliações de danos citogenéticos pelo Teste do Cometa. Os resultados dos exames macroscópicos e histomorfológicos revelaram um melhor tecido de reparação nos grupos tratados com CTM. As análises citométricas apresentaram resultados de imunomarcações positivos para CTM, e as diferenciações revelaram que as CTM foram capazes de se diferenciar em adipócitos, condrócitos e osteoblastos. Por meio do Teste do Cometa, foi possível notar que os danos citogenéticos aumentaram após a segunda passagem das CTM. Conclui-se que há efeitos benéficos da associação de CTM derivadas do tecido adiposo e plasma rico em plaquetas na regeneração ... / Abstract: The articular cartilage is a tissue that has limited capacity for repair after an acute injury, and the efficacy of current treatments usually results in relief of symptoms, and not in regeneration of damaged tissue. Focusing on this issue, the aim of this work was to evaluate the effect of therapy with autologous mesenchymal stem cells (MSC) in the regeneration of rabbits articular cartilage submitted to experimental knee osteoarthritis. Twenty four adult New Zealand White rabbits were randomly divided into four groups: GC (control group); GPRP (platelet rich plasma group); GCTM (undifferentiated autologous mesenchymal stem cells group); GCTMdif (chondrocyte differentiated autologous mesenchymal stem cells group). All animals were osteoarthritis-induced by application of collagenase solution, and four weeks after induction, they received the specific treatments to each group. After sixty days of therapy, the animals were sacrificed and articular surfaces were submitted to macroscopic and histomorphological evaluations. At the same time were performed adipogenic, chondrogenic and osteogenic differentiation of MSC, characterizations through cytometric analysis, and evaluation of cytogenetic damage by the Comet Assay. The macroscopic and histomorphological examinations revealed a better repair tissue in the groups treated with MSC. Cytometric analyzes showed positive results for MSC immunostaining, and differentiation showed that MSC were able to differentiate into adipocytes, chondrocytes and osteoblasts. Through the Comet Assay, it was noticeable that the cytogenetic damage increased after the second passage of the MSC. It was concluded that there are beneficial effects of the combination of MSC derived from adipose tissue and platelet-rich plasma in the regeneration of articular cartilage in knees of rabbits undergoing experimental osteoarthritis, and there is no difference when MSC are used undifferentiated or differentiated into ... / Doutor

Orientador: Irene Gyongyver Heidemarie Lorand Metze, Ângela Cristina Malheiros Luzo / Tese (doutorado) - Universidade Estadual de Campinas, Faculdade de Ciências Médicas / Made available in DSpace on 2018-08-24T20:21:23Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Pereira-Cunha_FernandaGoncalves_D.pdf: 2398726 bytes, checksum: 1eeb61b74ea6dfdcea43770d6371aae0 (MD5) Previous issue date: 2014 / Resumo: O sangue de cordão umbilical (SCU) é uma fonte de células-tronco para terapia celular e transplante de medula óssea. Devido a grande extensão territorial do Brasil, muitas vezes acontecem problemas logísticos na coleta de inúmeras unidades de SCU (USCU). Nosso objetivo foi estudar a mudança de proporções e a viabilidade dos diversos subtipos celulares do SCU, especialmente das células-tronco CD34+ até 96 horas após a coleta de amostras mantidas à temperatura ambiente (T.A.). Avaliamos ainda a modificação destes dados após o descongelamento das amostras. Cada subtipo celular foi identificado fenotipicamente usando citometria de fluxo. A viabilidade celular foi estudada utilizando o corante 7-aminoactinomicina (7-AAD). A funcionalidade das células-tronco CD34+ foi examinada através de ensaios clonogênicos. Num primeiro estudo foram analisadas trinta e seis USCU em 24, 48 e 96 horas após a coleta. As células-tronco CD34+ e os linfócitos T maduros aumentaram a porcentagem durante o período de estocagem. Os linfócitos B maduros e as células mesenquimais diminuiram, mantendo a viabilidade. Os granulócitos diminuíram a porcentagem com perda da viabilidade. Os monócitos e precursores B mantiveram-se estáveis. Os ensaios clonogênicos demonstraram diminuição no número de unidades formadoras de colônias (CFU) nas USCU estocadas até 96 horas (média 194/ 24 horas e 168/ 96 horas), mas todas as USCU apresentaram bom número de colônias. No segundo estudo foram analisadas vinte USCU em 24 e 96 horas após a coleta. Essas amostras foram congeladas e descongeladas após seis meses para serem reavaliadas. Os resultados das amostras pré-congelamento foram semelhantes aos encontrados no primeiro estudo. Os resultados pós-descongelamento demonstraram que as células CD34+ diminuíram, mas não significativamente, quando comparamos amostras estocadas 24 e 96 horas antes de processar. As células-tronco mesenquimais, precursores B, linfócitos B maduros e monócitos não apresentaram alterações estatísticas significantes. Os linfócitos T e granulócitos diminuíram significativamente. Houve crescimento de CFU em todas as amostras, embora o número de colônias tenha sido menor nas amostras estocadas 96 horas pré-congelamento quando comparadas às processadas após 24 horas (mediana 68 x 57; p <0.0001). No entanto, a maior diminuição foi observada pós-descongelamento (mediana 36 x 27 respectivamente). A diminuição do número de CFU estocadas 96 horas apresentou correlação com a porcentagem de células CD34+ inviáveis pré-congelamento. As células-tronco CD34+ e mesenquimais apresentaram boa viabilidade até 96 horas à T.A., mesmo pós-descongelamento. O processo de descongelamento diminuiu a porcentagem, mas não a viabilidade dessas células. O crescimento de CFU durante todo o período analisado comprovou a funcionalidade das células CD34+. A manutenção da viabilidade e funcionalidade das células-tronco do SCU estocados até 96 horas após a coleta à T.A., provendo número considerável de CFU mesmo após o congelamento e descongelamento poderá possibilitar a coleta de USCU de lugares mais distantes dos Bancos Públicos de SCU (BSCUP), o que seria muito importante para seu armazenamento. Portanto, as USCU poderiam ser manipuladas até 4 dias após a coleta quando necessário. Isto aumentaria consideravelmente o recrutamento de bolsas de SCU nos BSCUP, mantendo a segurança da fonte de células-tronco para uso na medicina regenerativa / Abstract: Umbilical cord blood (UCB) is a good source of stem cells for cell therapy and has been successfully used for bone marrow transplantation. In 2004, the Brazilian Public Network of Cord Blood Banks was founded. However, because our country is large, logistic problems could hamper the collection of numerous samples. Our aim was to evaluate the variation in proportion and viability of several UCB cell subsets, especially CD34+ stem-cells and their viability until 96 hours after collection of samples stored at room temperature. We evaluated also all cell subtypes and their viability and functionality kept frozen for 6 months and then thawed. Each cell subtype was identified by immunophenotyping and the viability was studied by 7-AAD incorporation and CD34+ stem-cell functionality was studied by clonogenic assay. In the first study we analysed thirty-six UCB units at 24, 48 and 96 hrs after collection and we demonstrated that CD34+ stem cells and mature T lymphocytes percentages increased during this period. Mature B lymphocytes and mesenchymal stem cells (MSCs) decreased, maintaining viability. Granulocytes decreased with loss of viability. Monocytes and immature B lymphocytes remained stable. Clonogenic assays showed a decrease in colony-forming unit (CFU) number in UCB units stored for 96 hours. But even so, an acceptable number CFU was maintained. In the second study we analysed twenty UCB units at 24 and 96 hrs after collection, frozen for 6 months and thawed for reevaluation. Pre freezing (PF) results were similar to those found in the first study. Post-thaw (PT) results showed that the number of CD34+ cells tended to decrease in kept 96 hrs at room temperature before processing. PT /24 and 96 hrs results of MSCs, immature and mature B cells and monocytes had no significant variation. T lymphocytes and granulocytes had a significant decrease. CFU growth was observed in all samples. Delay of 96 hrs PF was associated with a decrease in CFU number (median 68 x 57; p <0.0001). Moreover, a larger decrease was observed in PT samples (median 36 x 27 respectively). CFU loss at 96 hrs PF showed a correlation with the proportion of non-viable CD34+ before processing. CD34+ and MSCs stem-cells remained viable until 96 hrs after collection at room temperature even after freezing and thawing. CFU growth during all period analyzed confirming CD34+ functionality. The maintenance of viability and functionality of UCB stem cells stored until 96 hrs after collection at room temperature, providing a good number of colonies even after freezing and thawing could possibly allow the collection of UCBUs from places far away from UCB Banks, which would be of great value for increasing the number of Units in Umbilical Cord Blood Banks / Doutorado / Clinica Medica / Doutora em Clínica Médica

Submitted by Marco Antônio de Ramos Chagas (mchagas@ufv.br) on 2015-11-09T15:12:55Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 1008959 bytes, checksum: 3d46e11fde8d7a6ac33eb226467cf41f (MD5) / Made available in DSpace on 2015-11-09T15:12:55Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 1008959 bytes, checksum: 3d46e11fde8d7a6ac33eb226467cf41f (MD5) Previous issue date: 2014-07-24 / A popularidade das células-tronco mesenquimais (MSCs) vem desde a descoberta de células aderentes, com formato fibroblastoide e capazes de se auto-renovar, formar colônias, além de originar diferentes tecidos como cartilagem, osso, gordura e músculos, sendo então objeto de estudos principalmente na medicina regenerativa. Diante disso, há uma busca constante por fontes de MSCs, sendo a medula óssea a principal fonte dentro da terapia celular, no entanto, rejeição, co-morbidades associadas a coleta e número limitado de doadores estimularam a busca por novas fontes deste tipo celular. O objetivo desse trabalho é descrever a obtenção, o cultivo e a caracterização de células obtidas a partir da digestão enzimática do tecido perivascular do cordão umbilical (UC) de cães, na esperança de estabelecer uma nova fonte deste tipo celular para as espécies canina e humana, através do modelo animal. Para isso, UCs obtidos a partir de cesarianas terapêuticas foram submetidos ao protocolo de digestão enzimática com colagenase e hialuronidase. As células obtidas a partir desse procedimento foram submetidas a três diferentes protocolos de cultivo a fim de estabelecer o melhor meio para esse tipo celular. Estabelecido o melhor meio, através da curva de crescimento e do tempo de duplicação, as células foram submetidas a ensaios de diferenciação para comprovação de sua multipotência. Foram obtidas culturas aderentes e com morfologia fibroblastoide a partir de todos os UCs utilizados, com um número inicial de células de 4,8x105 por UC. A curva de crescimento mostrou uma fase estacionária (lag) de 0 a 24 horas, seguida por uma fase de crescimento de 24 a 168 horas e, então, uma fase de decaimento celular. O tempo de duplicação foi mantido em torno de 15 horas até a sexta passagem, a partir do qual houveram indícios de senescência celular. O ensaio de diferenciação demonstrou a capacidade das células em diferenciar-se em osteoblastos, condrócitos e adipócitos quando submetidos aos meios de indução. Diante dos resultados, acredita-se que as células obtidas a partir do tecido perivascular dos vasos sanguíneos do cordão umbilical de cães após sua digestão enzimática sejam células-tronco, com potencial de uso na terapia celular, necessitando da comprovação de linhagem mesenquimal. / The popularity of mesenchymal stem cells (MSCs) comes from the discovery of adherent cells with fibroblastic shape, ability of self-renewal, form colonies and give rise to different tissues such as cartilage, bone, fat and muscle, therefore is the object of studies mainly in regenerative medicine. There is a constant search for sources of MSCs, with the bone marrow being the major source for cell therapy. However, rejection, co- morbidities associated with collection and limited number of donors stimulated the search for new sources of this cell type. The aim of this paper is to describe the harvesting, culture and characterization of cells obtained from enzymatic digestion of dogs umbilical cord perivascular tissue, hoping to establish a new source of this cell type to canine and human species through the animal model. For this, umbilical cords (UCs) obtained from therapeutic caesarean section were submitted to the protocol of enzymatic digestion with collagenase and hyaluronidase. Cells obtained from this procedure were subjected to three different protocols of culture in order to establish the best medium to that cell type. Established the best media through the growth curve and doubling time, cells were tested for differentiation as evidence of their multipotency. Adherent cells with fibroblastic shape were obtained from all UCs used, with an initial cell number of 4.8 x10 5 by UC. The growth curves showed a lag from 0 to 24 hours, followed by a phase of growth of 24 to 168 hours, and then a mobile phase of decay. The doubling time was kept around 15 hours until the sixth passage, from which there were signs of cellular senescence. The differentiation assay demonstrated the ability of cells to differentiate into osteoblasts, adipocytes and chondrocytes when subjected to the induction means. Given the results, it is believed that the cells obtained from the perivascular tissue of the blood vessels of the umbilical cord of dogs after enzymatic digestion are stem cells, with potential uses in cell therapy, requiring that their mesenchymal lineage is proven.

Células-tronco humanas derivadas da polpa dental (hDPSCs) e células-tronco humanas derivadas de tecido adiposo (AhSCs) são células multipotentes capazes de diferenciação osteogênica in vitro e in vivo, e promissoras fontes de células para a engenharia de tecido ósseo, dada a sua facilidade de expansão, isolamento e diferenciação. É de grande interesse compreender qual é o melhor tipo celular para diferenciação osteogênica, assim, o objetivo deste estudo foi comparar o potencial de diferenciação osteogênica in vitro e in vivo entre hDPSCs e hASCs. Foram isoladas e estabelecidas seis populações de células-tronco de hDPSCs (entre 7-12 anos) e seis da hASC (de indivíduos com idade entre 30-49 anos). Após a indução in vitro, a diferenciação osteogênica foi comprovado através das colorações de fosfatase alcalina (9 dias) e vermelho de alizarina (14 e 21 dias). A quantificação da mineralização da matriz após 21 dias de diferenciação osteogênica revelou 2,24 mais ossificação das hDPSCs em relação às hASCs. Para realizar o experimento in vivo, foram triados seis biomateriais para verificar qual melhor biomaterial para o nosso modelo, defeito crítico em calvária de Ratos Wistar não imunossuprimidos, com três amostras de hDPSCs. Após 45 dias, CellCeram(TM) exibiu a melhor neoformação óssea in vivo, e foi selecionado para comparar os potenciais osteogênicos in vivo entre hDPSCs e hASCs. Células (10e6) foram associadas a discos de 4,5 mm CellCeram(TM), grupo controle foi realizado através do transplante do biomaterial livre de células. Neoformação óssea foi mensurada 45 dias após a cirurgia através da coloração histológica de hematoxilina / eosina. A formação óssea total foi quantificada através da análise de imagens de todas as ilhas de ossificação. A associação entre hDPSCs e CellCeram(TM) promoveu 7,24 vezes mais neoformação óssea quando comparado com a associação entre esse mesmo material e hASCs (p <0,0001). A utilização de células-tronco adultas para regeneração óssea é uma ótima abordagem para uso terapêutico, e calcular ou predizer o potencial osteogênico das células utilizadas é extremamente importante e necessário para futura aplicação em novas estratégias de bioengenharia de tecido ósseo / Human dental pulp stem cells (hDPSCs) and human adipose-derived stem cells (AhSCs) are multipotent cells capable of undergoing osteogenesis in vitro and in vivo, and promising cell-source populations for bone tissue engineering given their easiness of isolation, expansion and differentiation. It is of great interest to understand which is the best cell type for osteogenic differentiation, thus the aim of this study is to compare the in vitro and the in vivo osteogenic differentiation potentials between DPSCs and ASCs. We isolated six stem cell populations from DPSCs (aged 7-12 years) and six from ASCs (from subjects aged 30-49 years) and cell culture was established. After in vitro induction the populations were able to undergo osteogenic differentiation, as evidenced by alkaline phosphatase (9 days) and alizarin red S (14 and 21 days) stainings. Quantification of matrix mineralization after 21 days of osteogenic differentiation revealed an enhancement of 2.24-fold increase between hDPSCs and hASCs differentiation. To perform the in vivo experiment, we promoted a screening of six scaffolds to find out which would be best scaffold to our model, a calvarial critical-sized defect in Wistar non-immunosuppressed rats, with three different culture samples of hDPSCs. After 45 days, CellCeram(TM) displayed the best in vivo bone neoformation, and was used to compare the in vivo osteogenic potentials between hDPSCs and hASCs. Cells (10e6) were associated to 4.5 mm CellCeram(TM) discs, and control groups were performed transplanting the biomaterial free of cells. Bone healing was measured through histological hematoxylin/eosin staining 45 days after surgery. Newly formed bone was also evaluated by total bone island surface quantification through image analysis. The association between hDPSCs and CellCeram(TM) induced a mean of 7.24 times more bone formation when compared to the association between this same material and hASCs (p<0.0001). The use of adult stem cells for bone regeneration is a robust therapeutic option, and calculate or predicts the osteogenic potential of the cell used are extremely important and necessary to future application, and translation to new strategies in bone tissue engineering

Hoy en día, la estética dental se ha convertido en un área de gran repercusión, debido a la importancia que los individuos atribuyen a su sonrisa, por eso, realizar tratamientos que causen el mínimo impacto sobre la estética del paciente es esencial para dar por exitoso un tratamiento odontológico. La endodoncia regenerativa es uno de los desarrollos más interesantes en la odontología actual constituyendo una nueva frontera en la especialidad de la endodoncia. Mediante ella, se pretende reponer tejidos perdidos aplicando principios de ingeniería tisular, siendo la “revascularización pulpar”, la técnica más usada. Ésta, que se realiza en piezas dentales que han sufrido necrosis y aún no han completado su formación, consiste en revascularizar el conducto con sangre procedente de la papila dental apical para que las células madre recolonicen el conducto, regeneren la pulpa y, con ello, completen la maduración de la raíz. El principal problema recae en que ciertos materiales usados durante esta técnica pueden generar tinción en el diente. Por un lado, están los preparados antibióticos inyectados dentro del conducto para controlar la infección y, por otro, los cementos utilizados como barrera cervical que permanecen en contacto con la dentina y la sangre. Atendiendo a estas dos situaciones, el principal objetivo de la presente investigación es evaluar la capacidad de tinción, sobre dientes anteriores, que tiene, por un lado, el preparado de pasta triantibiótica (TAP) más utilizado para esta técnica (compuesto principalmente de Ciprofloxacino, Metronidazol y Minociclina) y, por otro lado, el Biodentine (un cemento a base de silicato de calcio de reciente aparición) utilizado como barrera cervical en contacto con sangre. Como objetivo secundario se propuso la aplicación de un agente blanqueador con el fin de evaluar el efecto de recuperación del color según la procedencia de la tinción. Para realizar los experimentos, se utilizaron treinta dientes intactos de origen humano a los cuales se les cortaron los ápices y se les ensanchó el conducto, para reproducir dientes inmaduros con ápice abierto. Tras realizar la preparación, éstos se dividieron en 3 grupos, de diez especímenes cada uno y se conservaron hasta el inicio de los ensayos en cámara de humedad 100% y 37ºC, para simular el entorno bucal. Los experimentos se dividieron en dos fases: la primera de ellas comprendió la etapa en la que los especímenes recibieron tratamientos de revascularización pulpar y la segunda, la etapa en la que los especímenes recibían blanqueamientos dentales. Durante la fase l al grupo 1 se le inoculó sangre de origen humano, como grupo control, por un total de 3 semanas, durante las cuales se tomaron registros colorimétricos en la semana 1,2 y 3. Al grupo 2 se le aplicó TAP durante 3 semanas para después removerla e inocular sangre hasta completar los 3 meses. En este grupo se tomaron registros colorimétricos en la semana 2, 3, 4, 6, 8 y 12. Al grupo 3 se le inoculó sangre y se realizó un sellado cervical con Biodentine durante 3 meses, durante los cuales se tomaron registros colorimétricos en la semana 2, 4, 8 y 12. En la fase 2 se realizaron tres sesiones de blanqueamiento a los grupos 2 y 3, por un total de 3 semanas, durante las cuales se tomaron registros colorimétricos en la semana 1, 2 y 3. Para las mediciones de color se utilizó un Telespectroradiómetro (CS-2000 Minolta) y los especímenes fueron colocados en una cabina de luz Verivide CAC 150 bajo luz fluorescente simuladora de luz diurna D65. El dispositivo registró los valores de reflectancia espectral de cada uno y, tras realizar la división entre el estímulo espectral correspondiente a la muestra por el estímulo espectral del blanco patrón, los datos se analizaron en CIE-L*a*b* y CIEDE2000. Los resultados mostraron variación de color perceptible ( 3,7) durante la primera fase en todos los grupos, siendo el grupo 2 el que más tinción mostró ( 26,12), seguido del grupo 1 ( 15,49) y por último el grupo 3, con un valor dos veces menor que el alcanzado en el grupo 3 ( 13,48). El atributo que más influyó al cambio de color fue el cambio de claridad y después el del croma ( ), siendo la variación tonal ( ) prácticamente constante durante todo el proceso. Durante la segunda fase, los grupos 2 y 3 lograron recuperar gran parte del color perdido ( 8,31 y 7,26 respectivamente), siendo ligeramente mejores los resultados del grupo 3. Hay que reseñar que el grupo 2, partiendo con cierta desventaja frente al grupo 3 ya que al finalizar el tratamiento sus especímenes estaban más teñidos, consiguió reducir de forma considerable su tinción y acercarse a cifras parecidas a las del grupo 3. Con todo, algunos especímenes del grupo 2 conservaban un halo de tinción en la zona del tercio incisal más gingival. De estos resultados se puede concluir que el uso de TAP produce tinción en la dentina y que el empleo de Biodentine como material sellador, aunque en menor medida, no impide que exista tinción. Por otro lado, el uso de agentes blanqueadores a base de peróxido de hidrógeno al 50%, hidróxido amónico al 0,4% y perborato de sodio monohidratado al 15% puede ayudar a devolver gran parte del color perdido en revascularización pulpar, pero no su totalidad. Se requieren más estudios que investiguen sobre otras formas de controlar la infección sin que generen tinción en la dentina, al igual que otros donde se comprueben nuevos CSC para poder usar en revascularización pulpar y que sean estables en presencia de sangre.

Apesar do grande potencial de regeneração do tecido ósseo, em algumas situações a extensão da lesão impede que o tecido se repare completamente. Como uma alternativa em relação aos tratamentos convencionais, a terapia celular tem sido considerada como promissora para o reparo de defeitos ósseos. No entanto, poucos estudos investigaram a terapia celular utilizando osteoblastos, portanto, avaliamos o efeito da injeção direta de osteoblastos na regeneração do tecido ósseo. Como os osteoblastos têm origens embrionárias diferentes, foi comparado in vitro o potencial osteogênico de osteoblastos derivados da crista neural, do mesoderma e de ambas as origens embrionárias. Considerando a necessidade de grande número de células para a terapia, foi comparado o efeito de uma subcultura, como meio de aumentar a quantidade de células, no potencial osteogênico dos osteoblastos. Para avaliação da regeneração dos defeitos, osteoblastos foram injetados diretamente nesses defeitos. Osteoblastos foram obtidos da calvária de ratos recém-nascidos (Wistar), sendo que os derivados da crista neural foram isolados dos ossos frontais (OB-CN); os do mesoderma isolados dos ossos parietais (OB-MS); e de ambas as origens embrionárias isolados de toda a calvária (OB-Cal). O efeito da subcultura no potencial osteogênico foi avaliado em OB-Cal ou na primeira passagem dessa cultura (OB-Cal P1). Após até 14 dias em cultura, foram avaliadas a proliferação celular, atividade de fosfatase alcalina (ALP), formação de matriz extracelular mineralizada e a expressão dos genes marcadores osteoblásticos: fator de transcrição runt-related 2 (RUNX2), ALP, osteocalcina (OC) e sialoproteína óssea (BSP). Para avaliar a regeneração do tecido ósseo, foram criados defeitos de 5 mm de diâmetro na calvária de ratos Wistar, que após 2 semanas foram tratados com 5 x 106 osteoblastos derivados de OB-Cal P1, por meio de injeção local. Ao final de 4 semanas, a formação óssea foi avaliada por microtomografia computadorizada e análise histológica. Os dados foram comparados por ANOVA, seguido do teste de Student-Newman-Keuls, ou teste t, quando apropriado, considerando o nível de significância de 5%. A comparação do potencial osteogênico em relação à origem embrionária mostrou que, os OB-MS apresentaram maior proliferação mas não houve diferença entre as culturas no evento final da diferenciação osteoblástica, que é a formação de matriz mineralizada. No entanto, como as culturas de OB-Cal apresentaram maior expressão gênica de marcadores iniciais, intermediários e finais dessa diferenciação; e considerando que, essas culturas são aquelas nas quais é possível obter o maior número de células, optamos por utilizar essas culturas na avaliação da formação óssea induzida pela terapia celular. Além disso, os resultados mostraram que os OB-Cal P1 tem seu potencial osteogênico reduzido, mas considerando que a subcultura permite a obtenção de maior número de células, são uma boa escolha para a terapia celular. Tanto que, ao avaliar in vivo a capacidade regenerativa das OBCal P1 no reparo dos defeitos ósseos, as análises microtomográficas e histológicas mostraram que que a terapia celular com injeção local de osteoblastos obtidos de fragmentos ósseos da calvária constitui uma estratégia adequada para estimular o reparo ósseo / Despite of the great potential of regeneration of the bone tissue, in some situations the extension of the lesion prevents the tissue from repairing completely. As an alternative to conventional treatments, cell therapy has been considered a promising strategy for the repair of bone defects. However, few studies investigated cell therapy using osteoblasts, therefore, we evaluated the effect of direct injection of osteoblasts on the regeneration of bone tissue. Since osteoblasts have different embryonic origins, the osteogenic potential of osteoblasts derived from neural crest, mesoderm and both embryonic origins was compared in vitro. Considering the need for a large number of cells for the therapy, the effect of a subculture, a common way to increase the amount of cells, on the osteogenic potential was also compared. Then, osteoblasts were injected directly into bone defects to evaluate the regeneration of bone tissue. Osteoblasts were obtained from the calvaria of newborn rats (Wistar), the neural crest derivatives were isolated from the frontal bones (OB-CN); those of the mesoderm isolated from the parietal bones (OB-MS); and from both embryonic origins isolated from the entire calvaria (OB-Cal). The effect of the subculture on the osteogenic potential was evaluated in OB-Cal and in its firstpassage (OB-Cal P1). After up to 14 days, all cultures were assayed for cell proliferation, alkaline phosphatase activity (ALP), mineralized extracellular matrix formation and the expression of the osteoblastic marker genes: runtrelated transcription factor 2 (RUNX2), ALP, osteocalcin (OC) and bone sialoprotein (BSP). To evaluate the effect of cell injection on bone regeneration, defects of 5 mm diameter were created in the calvaria of Wistar rats, that after 2 weeks were injected with 5 x 106 OB-Cal P1-derived osteoblasts. Vehicle injections were used as control. At the end of 4 weeks, the bone formation was evaluated by computerized microtomography and histological analysis. Data were compared by ANOVA, followed by the Student-Newman-Keuls test, or ttest, when appropriate, and the level of significance was set at 5%. The comparison of the osteogenic potential related to the embryonic origin showed that the OB-MS presented a greater proliferation but there was no difference between the cultures in the final event of the osteoblastic differentiation, that is the formation of mineralized matrix. However, as OB-Cal cultures showed greater gene expression of initial, intermediate and final markers of this differentiation; and considering that these cultures are those in which it is possible to obtain the largest number of cells, we selected these cultures for evaluating the bone formation induced by the cell therapy. In addition, the results showed that OB-Cal P1 still holds its osteogenic potential and despite being lower than that of OB-Cal as the subculture allows obtaining more cells, it has been considered as a good choice for cell therapy. In agreement with this, OB-Cal P1-derived osteoblasts injected into the bone defects were capable of inducing more bone formation than control, as revealed by microtomographic and histological analyzes. Therefore, it supports the idea that cell therapy with local injection of osteoblasts obtained from calvarial bone fragments is an adequate strategy to stimulate bone formation

Apresenta-se uma retrospectiva histórica do conhecimento e aplicação da engenharia biomédica/bioengenharia no Brasil; no período do século XX, enfocando a história da arte brasileira com relação à engenharia biomédica/bioengenharia, evidenciando perspectivas de desenvolvimento deste interessante campo de conhecimento. Por razões metodológicas e didáticas dividirão a engenharia biomédica/bioengenharia em áreas de aplicação: cardiologia, ortopedia, odontologia, oftalmologia, medicina regenerativa coadunando as áreas de ciências exatas e da terra onde, por exemplo, os conhecimentos das propriedades dos materiais utilizados, são evidenciados como composição química, estrutura, propriedades e aplicações, contextualmente definida como aplicação da engenharia biomédica/bioengenharia na medicina, de forma transitória ou permanente pelos diversos tecidos dos organismos dos seres vivos. Eles são utilizados como um todo ou parte de um biológico que trata, restaura ou substitui algum tecido, órgão ou função do corpo humano ou ainda como um material não viável utilizado em um dispositivo médico, com a intenção de interagir com o sistema biológico. A definição de bioengenharia foi encarada nessa dissertação de forma a direcionar a pesquisa de campo em empresas e núcleos que desenvolvem biomateriais, entrevistas com pessoas que vivenciaram o desenvolvimento da bioengenharia no Brasil, preparando um compêndio da história da bioengenharia no Brasil, no século XX / Show up a historical retrospective of knowledge and appliance of biomedic engineering in Brazil, on period of XX century, focus the history of brazilian art with relation of biomedic engineering, connecting perspective of development of this interesting knowledge filld. For methodological and didactic reasons biomedic engineering was divide in areas of appliance cardiologic, orthopedic, odontology, ophthalmology, regenerate medicine connecting areas of exact science and earth where, for example, the knowledge of property of material used, are evidence like chemistry composition, structure, properties and appliances contextualmente defined like appliance of biomedic engineering in medicine, on transitory or permanent form by several tissues of creature organisms. They are used as a whole or a part of a biological than treat, repair or replace some tissue, organ or function of human body or even like a material not possible to use in a medical gadget, with purpose of interragir with a biological system. The definition of bioengineering was look at in that dissertation so that direction to research field in enterprises and centers that development biomaterials, interview with peoples that live the development of bioengineering in Brazil, make compêndio of brazilian bioengineering history, on XX century

O fator de crescimento transformante beta tipo 1, TGF-&#946;1, é uma proteína extracelular homodimérica secretada por vários tipos celulares, que pode ter ação parácrina ou endócrina. Essa proteína está envolvida em processos celulares de diferenciação, proliferação, mobilidade e formação de matriz extracelular. Além disso, é parte importante dos processos de regeneração tecidual, atuando, de maneira decisiva, no reparo, atraindo macrófagos e fibroblastos para o local da injúria e estimulando a angiogênese. Assim, considerando o papel desse peptídeo no processo regenerativo, o uso de TGF-&#946;1 como proteína terapêutica na área de Bioengenharia Tecidual é bastante promissor. Apesar disso, a venda dessa proteína, para fins terapêuticos, é inexistente no mercado e a proteína recombinante vendida, que só pode ser utilizada em pesquisas científicas, não é produzida nacionalmente e chega a custar R$200.000,00/mg. Nesse contexto, o objetivo do presente trabalho é desenvolver uma metodologia de produção do fator recombinante TGF-&#946;1 em células de ovário de hamster chinês (CHO), visando à obtenção de níveis altos de rendimento, e, futuramente, a transferência da tecnologia de produção para a iniciativa privada, tornando possível seu uso na Medicina Regenerativa, sozinho ou em combinação com outros fatores de crescimento. O cDNA de TGF-&#946;1 foi amplificado a partir de um banco de cDNA humano e clonado no vetor proprietário pNU1 de expressão de mamífero. A construção pNU1/TGF-&#946;1 foi utilizada para transfectar estavelmente células CHO DG44 e uma estratégia de co-amplificação foi utilizada para selecionar células transfectantes com maior número de cópias da sequência correspondente a TGF-&#946;1. Estas culturas foram submetidas ao processo de amplificação gênica com concentrações crescentes de metotrexato. Ensaios de Western Blot e ELISA foram realizados utilizando-se o meio condicionado pelas populações selecionadas e por clones superprodutores. Entre os 41clones obtidos, cinco apresentaram maiores níveis de produção de TGF-&#946;1, entre 1.000 e 2.000 ng/mL. Estes clones foram selecionados para a realização de testes de atividade in vitro utilizando-se células A549, que permitem avaliar a transição epitélio-mesênquima. Um ensaio de cicatrização de feridas em peles do dorso de camundongos foi padronizado e utilizado para avaliar a atividade in vivo do clone que apresentou melhor resultado in vitro. A proteína TGF-&#946;1 foi parcialmente purificada por HPLC em uma coluna de afinidade. Portanto, a proteína TGF-&#946;1 humana recombinante foi produzida, apresentando atividade biológica in vitro e in vivo, sendo capaz de reparar eficientemente feridas cutâneas. Essa iniciativa pode oferecer aos pacientes uma alternativa para o tratamento de lesões teciduais, acelerando a cicatrização de feridas e o reparo de tecidos. / The transforming growth factor beta 1, TGF-&#946;1, is a homodimeric extracellular protein secreted by several cell types, which may have paracrine or endocrine action. This protein is involved in cellular processes of differentiation, proliferation, mobility and formation of extracellular matrix. In addition, it is an important part of the tissue regeneration processes, acting decisively on repair, attracting macrophages and fibroblasts to the site of injury and stimulating angiogenesis. Therefore, considering the role of this peptide in the regenerative process and the use of TGF-&#946;1 as a therapeutic protein in the field of Tissue Bioengineering is very promising. Despite this, the sale of this protein for therapeutic purposes is nonexistent in the market and the recombinant protein available in the market, which can only be used in scientific research, is not produced nationally and the costs are in the order of R$ 200,000.00/mg. In this context, the objective of the present work is to develop a methodology for the production of the TGF-&#946;1 recombinant factor in Chinese hamster ovary (CHO) cells, aiming at obtaining high yields, and, in the future, transfering the production technology to the private initiative, allowing its use in Regenerative Medicine, alone or in combination with other growth factors. The TGF-&#946;1 cDNA was amplified from a human cDNA library and cloned into the proprietary pNU1 mammalian expression vector. The pNU1/TGF-&#946;1 construct was used to stably transfect CHO DG44 cells, and a co-amplification strategy was used to select transfectant cells with the largest number of gene copies. These cultures were subjected to the process of gene amplification with methotrexate. Western Blot and ELISA were used to assay the conditioned medium obtained from the selected cell populations and from overproducing cell clones. Among the 41 clones obtained, five presented higher levels of TGF-&#946;1 production, between 1,000 and 2,000 ng/mL. These clones were selected for in vitro activity testing using A549 cells to evaluate the epithelial-mesenchymal transition. Awound healing assay on mouse dorsal skin was standardized and used to evaluate the in vivo activity of the cell clone which displayed the highest result in vitro. The TGF-&#946;1 protein was partially purified by HPLC on an affinity column. Therefore, the recombinant human TGF-&#946;1 protein was produced and shown to display biological activity both in vitro and in vivo, being able to eficiently repair cutaneous wounds. This initiative may provide patients with an alternative treatment for tissue damage, accelerating wound healing and tissue repair.

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Diversos estudos j? mostraram o potencial osteog?nico dos polissacar?deos sulfatados (PSs) extra?dos de macroalgas marinhas. Entre eles, o fucoidan, isolado da alga marrom Fucus vesiculosus, ? o mais estudado, sendo j? comercializado por algumas empresas. As algas verdes tamb?m s?o fonte de PSs, mas estas s?o ainda pouco exploradas para aplica??es na regenera??o ?ssea. Em geral, as aplica??es cl?nicas dos PSs extra?dos de algas ainda s?o limitadas devido ? escassez de estudos sobre os seus efeitos, como por exemplo, o potencial genot?xico ? desconhecido na maioria dos casos. Assim, neste trabalho avaliamos a atividade osteog?nica 1) do Fucoidan de F. vesiculosus (um extrato comercializado pela Sigma), 2) das amostras ricas em PSs obtidas do subfracionamento do fucoidan comercial, e 3) do extrato rico em PSs extra?dos da alga verde Caulerpa sertularioides usando como modelo c?lulas-tronco humanas isoladas da geleia de Wharton de cord?es umbilicais (CTMH-GW). Estudou-se tamb?m o potencial genot?xico dos extratos totais de F. vesiculosus e C. sertularioides e posteriormente, da subfra??o do fucoidan que apresentou maior potencial osteog?nico, utilizando do ensaio de micron?cleo com bloqueio da citocinese (CBMN) na linhagem CHO-K1. Os ensaios de redu??o do MTT evidenciaram que as amostras ricas em PSs n?o apresentaram citotoxicidade significativa ao longo de 72 h, at? 10 ?g.mL-1. Os ensaios de atividade da fosfatase alcalina (ALP) e de mineraliza??o sugerem que as amostras ricas em PSs possuem atividades osteog?nicas diferentes: a subfra??o do fucoidan FUC 0.5 (5 ?g.mL-1) foi a que apresentou melhor resultado, aumentando 124% a atividade da ALP em rela??o ao controle positivo (c?lulas mantidas em meio osteog?nico). J? o extrato total de C. sertularioides (5 ?g.mL-1) aumentou 192% a atividade da ALP. Adicionalmente, todas as amostras testadas induziram o ac?mulo de c?lcio na matriz extracelular. Quanto ? genotoxicidade, os resultados do ensaio CBMN sugerem que, nas condi??es testadas, estas amostras n?o s?o genot?xicas, indicando que podem ser uma alternativa para terapias de regenera??o ?ssea. / Problems related with bone defects continue to motivate the search for more effective therapies. Thus, the combination of biomaterials, stem cells and bioactive molecules is part of the tools used by regenerative medicine to achieve this goal. Several studies have already shown the osteogenic potential of sulfated polysaccharides (SPs) extracted from marine macroalgae. Among them, fucoidan, isolated from brown algae Fucus vesiculosus, is the most studied, and is already commercialized by some companies. Green algae are also a source of SPs, but these are even more unexploited in the scope of bone regeneration. In general, the clinical applications of SPs from algae are very limited, because studies on their effects are scarce, for example, their genotoxic effects are unknown in most cases. Thus, in this work, we evaluated the osteogenic activity of Fucoidan from F. vesiculosus (an extract commercialized by Sigma), 2) SPs-rich samples obtained from subfractionation of commercial fucoidan, and 3) SPs-enriched extract from green algae Caulerpa Sertularioides, using human mesenchymal stem cells isolated from the Wharton jelly of umbilical cords (CTMH-GW) as cell model. It was also studied the genotoxic potential of the total extracts of F. vesiculosus and C. sertularioides, using the cytokinesis block micronucleus assay (CBMN) in the line CHO-K1. The genotoxicity of fucoidan?s subfraction that presented greater osteogenic potential was also evaluated. The MTT reduction assays showed that SPs-enriched samples did not show significant cytotoxicity over 72 h, up to 10 ?g.mL-1. Alkaline phosphatase (ALP) activity and mineralization assays suggest that SPs-enriched samples have different osteogenic activities: fucoidan subfraction FUC 0.5 (5 ?g.mL-1) showed the best result, increasing 124% the ALP activity in relation to the positive control (cells maintained in osteogenic medium). The total extract of C. sertularioides (5 ?g.mL-1) increased the ALP activity by 192%. In addition, all samples tested induced calcium accumulation in the extracellular matrix. Concerning to genotoxicity, CBMN assay results suggest that, under the tested conditions, these samples are not genotoxic, indicating their potential as alternative bone regeneration therapy.