INTRODUÇÃO: O valor prognóstico dos marcadores biológicos tumorais relacionados ao câncer tem sido vastamente pesquisado. O gene de reparo ERCC1 (Excision Repair Cross Complementation Group 1) está envolvido na resistência individual à cisplatina. O objetivo deste trabalho é avaliar o valor prognóstico do polimorfismo G19007A de ERCC1, da metilação desse gene, e da expressão imunoistoquímica de sua proteína em pacientes portadores de carcinoma espinocelular de cabeça e pescoço (CECP) submetidos à radioterapia. PACIENTES E MÉTODOS: Trata-se de um estudo retrospectivo envolvendo a análise de dados de 84 pacientes portadores de CECP, operados e submetidos à radioterapia adjuvante. Foram elegíveis pacientes com tumores de cavidade oral, orofaringe, hipofaringe ou laringe, que não apresentavam metástases à distância ou sinais de recidiva da doença e que não foram submetidos à quimioterapia. O polimorfismo do gene ERCC1 (G19007A) foi avaliado pela técnica de PCR (reação em cadeia da polimerase) a partir do DNA genômico extraído de tecido tumoral desses pacientes. A metilação do gene ERCC1 foi realizada por MSP-PCR (Methylation-specific PCR), com primers específicos para presença ou ausência de metilação do ERCC1. A expressão da proteína ERCC1 foi avaliada por técnica de imunoistoquímica. Foi utilizado um corte de 30% de células marcadas para classificação em baixa e alta expressão. RESULTADOS: 84 pacientes com idade mediana de 60 anos, numa proporção homem/mulher de 5:1 e 75 (89,5%) em estádios III ou IV. O genótipo GG ocorreu em 17 (20,2%) dos pacientes, o genótipo GA foi observado em 24 (28,6%), e o genótipo AA em 43 (51,2%) dos casos. A variante A para o gene ERCC1 foi observada em 79,8% das amostras, 43 (51,2%) pacientes apresentaram status metilado do ERCC1 e 70 (83,3%) pacientes apresentaram alta expressão imunoistoquímica da proteína ERCC1.Observou-se uma tendência de associação entre o polimorfismo de ERCC1 e a idade dos pacientes (p = 0,059). O status metilado do gene ERCC1 foi superior nas amostras de CECP de pacientes que não apresentaram metástases à distância (OR = 6,67; IC: 1,4033,33; p = 0,019). Pacientes com mais de 45 anos apresentaram uma maior prevalência de amostras de CECP com alta expressão imunoistoquímica (OR = 4,86; IC95%:1,219,7; p = 0,027), assim como pacientes com TNM avançado (OR = 5,04; IC95%:1,0723,7; p = 0,041). A sobrevida global mediana foi de 30 meses. Os pacientes com alta expressão de ERCC1 apresentaram sobrevida predominantemente inferior (p = 0,089). A análise multivariada demonstrou associação significante da sobrevida com as variáveis T (OR = 2,87; IC95%: 1,38 5,97; p = 0,005), N (OR = 1,84; IC95%: 1,013,31; p = 0,044) e M (OR = 3,39; IC95%: 1,647,00; p=0,001), mas não com o grupo de indivíduos não-metilados, que apresentou uma sobrevida global predominantemente superior (OR = 1,66; IC95%: 0,952,89; p = 0,073). CONCLUSÂO: A metilação e alta expressão de ERCC1 foram associadas à pior sobrevida, sem, no entanto, alcançar significância estatística. Indivíduos com mais de 45 anos apresentaram maior prevalência da variante alélica A no genótipo de ERCC1. O status metilado foi mais frequente em pacientes que não desenvolveram metástases à distância, assim como em indivíduos com doença avançada (III/IV). Houve associação entre a expressão de ERCC1 e o estadiamento da doença, revelando uma maior expressão de ERCC1 em pacientes com TNM avançado. Foram identificados como fatores independentes correlacionados à sobrevida, o T, N e M individualmente / INTRODUCTION: The prognostic value of tumor biomarkers related to cancer has been extensively studied. The repair gene ERCC1 (Excision Repair Cross Complementation Group 1) is involved in individual resistance to cisplatin. The aim of this study was to evaluate the prognostic value of ERCC1 G19007A polymorphism, methylation, and immunohistochemical expression of its protein in patients with squamous cell carcinoma of the head and neck (HNSCC) submitted to radiotherapy. PATIENTS AND METHODS: This is a retrospective study involving data analysis of 84 patients with HNSCC, who underwent surgery and adjuvant radiotherapy. Patients with oral cavity, oropharynx, hipopharynx and laryngeal tumors with no distant metastases or signs of disease recurrence and who did not receive chemotherapy were considered eligible for the study. The ERCC1 gene polymorphism (G19007A) was assessed by PCR (polymerase chain reaction) from genomic DNA extracted from the tumor tissue of these patients. Methylation of ERCC1 gene was performed by PCR-MSP (Methylation-specific PCR) using specific primers for the presence or absence of methylation of ERCC1. ERCC1 protein expression was assessed by immunohistochemistry. A cut-off of 30% of stained cells for the classification of low and high protein expression was used. RESULTS: 84 patients with median age of 60 years, a male/female ratio of 5:1 and 75 (89,5%) in stages III or IV. The GG genotype occurred in 17 (20.2%) patients, the GA genotype was observed in 24 (28.6%), and the AA genotype in 43 (51.2%) cases. The A variant of the ERCC1 gene was observed in 79.8% of the samples, methylated status in 43 (51.2%) patients, and 70 (83.3%) showed high immunohistochemical expression of ERCC1 protein. There was a trend for association between polymorphism of ERCC1 and patient age (p = 0.059). The methylated status of the ERCC1 gene was higher in samples of HNSCC patients who did not present distant metastasis (OR = 6.67, CI: 1.40-33.33, p = xviii 0.019). Patients with more than 45 years presented a higher prevalence of HNSCC samples with high immunohistochemical expression (OR = 4.86, 95% CI 1.2-19.7, p = 0.027), as did patients with advanced TNM (OR = 5.04, 95% CI 1.07-23.7, p = 0.041). The median overall survival was 30 months. Survival was predominantly lower in patients with high expression of ERCC1 (p = 0.089). Multivariate analysis demonstrated significant association of survival with the variables T (OR = 2.87, 95% CI: 1.38-5.97, p = 0.005), N (OR = 1.84, 95% CI 1:01-3:31, p = 0.044) and M (OR = 3.39 95% CI: 1.64-7.00, p = 0.001), but not with the group of non-methylated individuals who presented a predominantly higher overall survival (OR = 1.66, 95% CI 0.95-2.89, p = 0.073). CONCLUSIONS: Methylation and high expression of ERCC1 were associated with a lower survival, not reaching, however, statistical significance. Patients with more than 45 years had a higher prevalence of the A variant in the genotype of ERCC1. Methylated status was more frequent in patients who did not evolve with distant metastases, as well as individuals with advanced disease (III/IV). There was an association between the expression of ERCC1 and clinical staging, revealing a higher expression of ERCC1 in patients with advanced TNM. T, N and M individually were identified as independent factors correlated with survival

Mutações em genes da via de reparo de DNA por excisão de nucleotídeo estão associados a doenças genéticas raras, como Xeroderma pigmentosum, Síndrome de Cockayne e Tricotiodistrofia. Este trabalho teve como objetivo identificar mutações responsáveis por essas Síndromes em pacientes brasileiros. Inicialmente o projeto teve como foco o estudo da comunidade de Araras, no interior de Goiás, onde existe uma das maiores incidências de pacientes XP no mundo. Duas mutações foram identificadas no gene POLH, associadas a dois efeitos fundadores independentes na região. Os dezessete pacientes, entre 10 e 80 anos, caracterizados geneticamente apresentam uma grande heterogeneidade das manifestações clínicas, com fenótipos brandos à extremamente agressivos. Esse estudo se estendeu a mais dezessete pacientes de todo o Brasil, incluindo outros grupos de complementação de XP, CS e TTD. Na segunda parte deste trabalho avaliamos a resposta das linhagens XP-V ao tratamento com cisplatina. Foi possível observar que essas linhagens são mais sensíveis aos danos induzidos pela cisplatina, encontram problemas na fase G1/S de replicação e possuem um aumento da marcação high-level para histona gH2AX. / Mutations at DNA repair genes are associated with rare genetic diseases such as Xeroderma pigmentosum, Cockayne syndrome and Trichothiodystrophy. This study aimed to identify mutations responsible for these syndromes in Brazilian patients. Initially the project focused on the study of Araras community in the state of Goiás, where there is one of the densest known areas of XP patients. Two mutations were identified at POLH gene, associated with two independent founders effects in the region. The seventeen patients between 10 and 80, characterized genetically a wide range of heterogeneity of clinical symptoms with mild to extremely aggressive phenotypes. Brazilian patients from other places were studied, including seventeen other patients with XP, CS and TTD phenotypes. In the second part of this work, we evaluated the response of XP-V cell lines treated with cisplatin. It was observed that Pol eta deficient cells are more sensitive to damage induced by cisplatin, as well as encounter problems in the S phase replication after 24 hours of treatment, and have increased high-level fluorescence for gH2AX.

O parasita protozoário Leishmania apresenta um genoma plástico e dinâmico onde a amplificação gênica e translocações cromossomais são fenômenos comuns. Tal plasticidade sugere a necessidade de mecanismos robustos de reparo do DNA e de manutenção do genoma. A célula eucariótica desenvolveu sistemas de controle checkpoint que reconhecem estruturas alteradas de DNA e bloqueiam a progressão do ciclo celular permitindo que o reparo do DNA aconteça. Nestas células, o complexo heterotrimérico formado pelas proteínas Hus1, Rad9, e Rad1 participa nas etapas iniciais de reconhecimento e sinalização do estresse replicativo. Neste trabalho mostramos que a proteína Hus1 homóloga de Leishmania major é uma proteína nuclear que melhora a capacidade do parasito em lidar com o estresse replicativo. A análise de northern e PCR em tempo real mostraram que, após a transfecção do gene, a linhagem selecionada apresenta níveis aumentados dos transcritos LmHUS1. A utilização de um anticorpo anti-LmHus1 demonstrou o aumento nos níveis da proteína nestas células. Ainda, a superexpressão de LmHus1 confere resistência às drogas genotóxicas hidroxiuréia (HU) e metil metanosulfonato (MMS), e a resistência à HU correlaciona-se com a redução de dano no DNA após a expressão da LmHus1. A ruptura de um dos alelos LmHUS1 diminui os níveis do seu produto, compromete o crescimento do parasito e proporciona discreta diminuição na resistência às drogas genotóxicas. Resultados preliminares associam a expressão da LmHus1 ao fenômeno de amplificação gênica em L. major. Além disso, a possível quinase Chk1, efetora da sinalização iniciada em Hus1, foi clonada e transfectada no parasito, o anticorpo anti-Chk1 também foi produzido. Finalmente, considerando que LmHus1 funcione na detecção do dano e controle de defeitos na replicação de DNA, formulamos a hipótese de que o produto deste gene atue na forquilha de replicação e participe no fenômeno de rearranjo do DNA e na formação de amplicons neste parasito. / The protozoan parasite Leishmania presents a dynamic and plastic genome in which gene amplification and chromosome translocations are common phenomena. Such plasticity hints at the necessity of dependable genome maintenance pathways. Eukaryotic cells have evolved checkpoint control systems that recognize altered DNA structures and halt cell cycle progression allowing DNA repair to take place. In these cells, the PCNA-related heterotrimeric complex formed by the proteins Hus1, Rad9, and Rad1 is known to participate in the early steps of replicative stress sensing and signaling. Here we show that the Hus1 homolog of Leishmania major is a nuclear protein that improves the cell capability to cope with replicative stress. Northern analysis and real-time PCR showed that after transfection of the gene, the selected lineage presents increase in the LmHUS1 transcripts levels and overexpression was confirmed using anti-LmHus1. Thus, overexpression of LmHus1 confers resistance to the genotoxic drugs hydroxyurea (HU) and methyl methanesulfonate (MMS) and resistance to HU correlates to reduced net DNA damage upon LmHus1 expression. Preliminary results associate the LmHus1 expression to the gene amplification phenomena in L. major. And a possible Chk1-like kinase was cloned and transfected into the parasite, the anti-Chk1 was also produced. Besides, LmHus1 mutant is presented, and the LmHUS1 gene disruption decreases its product levels, leads to serious effects on growth, and presenting an slight decrease in the resistance to genotoxic drugs. Finally, considering the hypothesis that LmHus1 participates in the damage sensing and in the control of the DNA replication threats, we hypothesized that the product of this gene acts in replication forks and is involved in DNA rearrangement s and in the amplicons generation in this parasite.

Compostos carcinogênicos estruturalmente diversos ligam-se covalentemente ao DNA formando adutos que, se não reparados, provocam mutações. Inicialmente relacionados apenas a compostos exógenos, atualmente há várias evidências de que compostos gerados endogenamente poderiam modificar o DNA gerando adutos. Dentre os compostos endógenos, os produtos carbonílicos α,β-insaturados destacam-se pois reagem como agentes alquilantes bifuncionais com as bases do DNA, formando adutos exocíclicos. O 2,4-decadienal (DDE) é um aldeído α,β-insaturado que além de estar presente em alimentos e poluentes, é um dos mais importantes produtos da lipoperoxidação. Embora há várias indicações sobre a ação genótoxica do DDE, nenhum aduto deste composto com nucleobases havia sido caracterizado. O presente trabalho mostrou que o DDE é um agente alquilante versátil sendo capaz de gerar cinco adutos diferentes. Este estudo também mostrou que o DDE é capaz de gerar os mesmos adutos que outros dois importantes produtos da lipoperoxidação: o 4-0H-nonenal e o 2-octena1. Todos os adutos foram detectados em DNA tratado in vitro com o DDE. Para possibilitar a detecção dos adutos em sistemas mais complexos, foi desenvolvido um método extremamente sensível baseado em HPLC interfaceado com espectrometria de massa em tandem com ionização por electrospray. Foi também desenvolvida uma estratégia de incorporação de um dos adutos (III) em oligonucleotídeos por via química. A estratégia foi utilizada com sucesso na incorporação do aduto em oligonucleotídeos de sequências diversas. Os oligonucleotídeos foram utilizados em ensaios de reparo por excisão de base e replicação in vitro. / Structurally diverse carcinogenic compounds bind covalently to DNA producing adducts that can, if not repaired, lead to mutations. Firstly restricted to exogenous compounds, nowadays there are evidences that compounds endogenously generated can modify DNA forming adducts. Among these endogenous compounds, α,β-unsaturated carbonyl products are of special interest due their reactivity as bifunctional alkylating agents towards DNA bases leading to exocyclic adducts. 2,4-decadienal (DDE) is an α,β-unsaturatedaldehyde that in addition to be present in food and pollutants, it is one of the most important lipid peroxidation products. Despite of many indications about the DDE genotoxic properties, there was no information about adducts produced between this compounds and nucleobases. This work showed DDE as a versatile DNA alkylating agent being able to generate five different adducts. This study also showed that DDE can generate the same adducts produced from two other important lipid peroxidation products: 4-0H-nonenal and 2-octena1. All adducts were detected in DNA treated in vitro with DDE. To allow adduct detection in more complex systems, we developed a highly sensitive method based on HPLC coupled to electrospray/tandem mass spectrometry. A strategy to incorporate one adduct (III) into oligonucleotides was also developed. The strategy was successfully applied in the adduct incorporation into diverse sequences of oligonucleotides. They were utilized in base excision repair and in vitro replication experiments.

O reparo de lesões genômicas tem papel critico na supressão da transformação maligna. Para melanomas, tipo de câncer de pele, lesões causadas por UV são responsáveis pela aquisição do fenótipo maligno. A via de reparo por excisão de nucleotídeos (NER) exerce função importante na correção destas lesões, sendo na proteína XPC um dos seus principais agentes atuantes no reconhecimento das lesões. Enquanto mutações em XPC predispõem à Xeroderma Pigmentosum, modulações na função de XPC podem exercer papel critico na aquisição de mutações UV em melanomas esporádicos. A modulação pode ocorrer por ação transcricional, interação proteica ou também por fatores genéticos que possam interferir com sua expressão e/ou atividade. Para entender o papel da transcrição na modulação do reparo exercido por XPC, verificou-se o papel de p53 neste contexto. Comparando-se linhagens com diferentes status funcionais de p53 frente a lesões UVB, os resultados indicaram seu papel quanto a diferenças na sensibilidade à exposição, expressão de proteínas de reparo e cinética de reparo de lesões CPD. Além disso, caracterizou-se a expressão de proteínas envolvidas com apoptose e a ativação de caspase 3/7, além da expressão de espécies reativas de oxigênio produzidas após UVB, as quais sugeriram um efeito pró-sobrevivência após neutralização destas moléculas. Com relação à modulação de XPC quanto a seu principal partner, hHR23B, procurou-se verificar seu papel na biologia de melanomas. Análise da expressão de hHR23B em amostras de tecido de séries névicas, melanomas primários e metástases, demonstrou grande heterogeneidade de marcação principalmente em nevus e melanomas primários. Dados apresentados demonstraram que hHR23B esta relacionado à estabilidade e acúmulo de XPC, consequentemente alterando a eficiência de reparo de DNA para lesões UVB. O silenciamento de hHR23B modulou a morte celular após UVB de maneira a diminuir sua taxa, porém a longo prazo, tal sobrevivência não foi evidenciada. O silenciamento de hHR23B também afetou a sensibilidade à alguns agentes quimioterápicos. Para os possíveis efeitos genéticos na modulação de XPC, verificou-se o papel de polimorfismos genéticos existentes no gene. Análise de expressão alelo-específica do polimorfismo K939Q não sugeriu diferenças na expressão relacionadas a estas variantes polimórficas. Por fim, verificou-se o papel que p53 e NER poderiam exercer sobre a resposta à cisplatina. Usando as mesmas linhagens utilizadas para a resposta à UVB, verificou-se que, ao contrário, células possuindo atividade funcional de p53 apresentavam maior sensibilidade ao quimioterápico. Esta sensibilidade não se mostrou relacionada diretamente a expressão de proteínas de reparo como XPC e ERCC1, embora XPC tenha demonstrado estar relacionado à sensibilidade quando do uso de siRNA. Além disso, a restauração da atividade de p53 seja por uso de vetores virais ou através de inibidores de HDM-2 como Nutlin-3, demonstraram-se eficazes no intuito de aumentar a sensibilidade ao quimioterápico. Em conjunto, os resultados apresentados evidenciam o papel de diferentes fatores que possam modular a atividade de reparo de DNA frente à UVB e quimioterápicos, principalmente no que se refere ao eixo p53-hHR23B-XPC, pontuando-os como peças importantes na compreensão da biologia de melanomas em processos de carcinogênese, progressão e quimiorresistência / The repair of genomic lesions plays a critical role in the suppression of malignant transformation. For melanoma, a type of skin cancer, lesions caused by UV are responsible for the acquisition of the malignant phenotype. The nucleotide excision repair (NER) pathway has an important role in the repair of these lesions and XPC protein in one of its main active agents in lesion recognition. While mutations in XPC predispose to Xeroderma Pigmentosum, modulations in XPC function may play critical role in the acquisition of UV mutations in sporadic melanomas. The modulation may occur either by transcriptional activity, protein interaction or also by genetic factors that may interfere with their expression and / or activity. To understand the role of the transcription in modulating the DNA repair exerted by XPC, we verified the role of p53 in this context. Comparing cells lines with different p53 functional status after UVB injury, the results indicated its role regarding the differences in sensitivity, expression of repair proteins and DNA repair kinetics of CPD lesions. Moreover, we characterized the expression of proteins involved in apoptosis and the activation of caspase 3/7, besides the analysis of the expression of reactive oxygen species produced after UVB exposure. Such molecules suggested a pró-survival effect after UVB exposure due to results observed after neutralization. Regarding the modulation of XPC by its main partner, hHR23B, we verified its role in the biology of melanoma. HHR23B expression analysis in tissue samples series of nevus, primary melanoma and metastases showed critical heterogeneity stainning, especially in nevi and primary melanomas samples. Results indicated that hHR23B play a role in XPC stability and accumulation, altering the efficiency of DNA repair to UVB injury. Knocking-down of hHR23B by siRNA modulated cell death after UVB by decreasing its rate, but the long-term survival has not been demonstrated so. The knocking-down of hHR23B also affected sensitivity to some chemotherapeutic agents. Regarding the possible genetic effects in the XPC modulation, we verified the role of existing genetic polymorphisms inside the gene. Analysis of allele-specific expression of K939Q polymorphism did not suggest differences in expression related to these polymorphic variants. Finally, it was tested that the role p53 and NER may have on the response to cisplatin. Using the same cell lines used for the response to UVB, it was found that, in contrast, cells having functional activity of p53 showed greater sensitivity to chemotherapy. This sensitivity was not directly related to expression of DNA repair proteins such as XPC and ERCC1, although XPC has shown to be related to the sensitivity when using siRNA. In addition, the restoration of p53 activity by use of viral vectors or by HDM-2 inhibitors, such as nutlin-3, proved to be effective in order to increase the sensitivity to chemotherapy. Overall, the results demonstrate the role of different factors that may modulate the activity of DNA repair against UVB and chemotherapy, especially with regard to p53-hHR23B-XPC axis, selecting them as major players in the understanding of the melanoma biology regarding the processes of carcinogenesis, progression and chemoresistance

Rearranjos subteloméricos submicroscópicos são uma causa importante de malformações congênitas múltiplas e retardo mental. Recentemente, os mecanismos de origem de rearranjos subteloméricos começaram a ser investigados. O seqüenciamento dos pontos de quebra de rearranjos cromossômicos em 1p36 revelou predomínio por mecanismos de reparo não exclusivos. Rearranjos constitucionais em 1p36 são as alterações subteloméricas mais comuns e incluem deleções terminais simples, cromossomos derivados, deleções intersticiais e rearranjos complexos. Estes rearranjos resultam em um padrão específico de malformações e distúrbios do desenvolvimento neuropsicomotor que caracterizam a síndrome de monossomia 1p36. Os genes causativos ainda não foram identificados e a expressão fenotípica pode ser em função da haploinsuficiência de genes contíguos ou pelo mecanismo de efeito de posição. Obesidade e hiperfagia são características descritas em ~15% dos casos. Investigamos por MLPA (Multiplex ligation-dependent probe amplification) a presença de rearranjos no segmento cromossômico 1p36 em um grupo de 154 pacientes com obesidade e hiperfagia e testes genéticos negativos para a síndrome de Prader-Willi (PWS), e outro grupo de 83 pacientes encaminhados para estudos cromossômicos por diversos motivos. A estratégia de MLPA utilizada permitiu identificar em nove pacientes diferentes tipos de rearranjos na região subtelomérica 1p36. Para investigar os mecanismos de quebra, reparo e estabilização cromossômica envolvidos em rearranjos subteloméricos, linhagens celulares de seis pacientes contendo rearranjos constitucionais em 1p36 foram desenvolvidas. A clonagem e seqüenciamento das junções dos pontos de quebra de um rearranjo complexo e três translocações não recíprocas identificaram similaridades nas junções que sugerem o reparo por NHEJ (Nonhomologous end-joining) como o mais provável mecanismo de origem destes rearranjos. Duas deleções terminais aparentemente simples também foram investigadas e o refinamento dos pontos de quebra identificou dois intervalos genômicos distintos contendo duplicações segmentares específicas de 1p36 com 90-98% de homologia. Estas duplicações segmentares podem ter estimulado ou sido usadas como substratos no mecanismo de reparo do DNA. Nossos achados reforçam a associação da monossomia 1p36 com obesidade e hiperfagia e sugerem que estas características estejam freqüentemente associadas com fenótipos atípicos/leves e deleções submicroscópicas com 2-3 Mb de extensão. Sugerimos o uso de MLPA como um método alternativo rápido de diagnóstico para detectar e caracterizar rearranjos em 1p36. / Subtelomeric abnormalities are an important cause of mental retardation and birth defects. The mechanisms involved in the formation of subtelomeric rearrangements are now beginning to be elucidated. Breakpoint sequencing analysis of 1p36 rearrangements has revealed prevalence of different nonexclusive recombination-repair mechanisms. Rearrangements of 1p36 are the most frequently detected subtelomeric abnormalities and include different-sized simple terminal deletions, derivative chromosomes, interstitial deletions and complex rearrangements. These rearrangements have been reported to result in the specific pattern of malformation and neurodevelopmental disabilities that characterizes monosomy 1p36 syndrome. Thus far, no genes have been conclusively determined to be causative. Besides, it is still not known if a mechanism of haploinsufficiency or position effect that influences phenotype expression in this commonest terminal deletion syndrome. Obesity and hyperphagia have been reported to occur in ~15% of cases. We have used multiplex ligation-dependent probe amplification (MLPA) to screen for monosomy 1p36 in a group of 154 hyperphagic and obese, PWS negative patients and in a separate group of 83 patients sent to investigate a variety of other conditions. The MLPA strategy used allowed the identification of a diversity of rearrangements in nine subjects. In order to gain further insights into the mechanisms of chromosome breakage, repair, and stabilization mediating subtelomeric rearrangements in humans, we have used cell lines containing constitutional rearrangements of 1p36 of six patients. Cloning of the breakpoint junctions in a complex rearrangement and three non-reciprocal translocations revealed similarities at the junctions that suggest NHEJ as the most likely mechanism of DNA repair that generated these rearrangements. Additionally, two apparently pure terminal deletions were also investigated and the refinement of the breakpoint regions identified two distinct genomic intervals ~25-kb apart, each containing a series of 1p36 specific segmental duplications with 90-98% identity. These segmental duplications might have been stimulated or used as substrate for a recombination-repair mechanism. Our work reinforces the association between monosomy 1p36 and obesity and hyperphagia, and further suggests that these features might be usually associated with an atypical/mild phenotype in addition to a submicroscopic deletion of ~2 to 3 Mb in size. We suggest the use of MLPA as an alternative method for high-throughput detection and delineation of rearrangements at 1p36.

A leptospirose é uma zoonose de importância mundial, e é causada por bactérias patogênicas do gênero Leptospira, pertencente à ordem Spirochaetales. Os seres humanos são hospedeiros acidentais e os surtos de leptospirose ocorrem em grandes centros urbanos após enchentes contaminadas por urina de ratos. Existem poucas informações a respeito de como Leptospira spp lida com situações de estresse induzidas pelo hospedeiro e pelo ambiente. O ferro é um íon essencial para a maioria dos seres vivos. A regulação de genes envolvidos por seu aporte e estoque na célula bacteriana é mediada por proteínas da família de reguladores transcricionais, Fur (ferric uptake regulator). L. interrogans sorovar Copenhageni possui quatro ortólogos para Fur, que foram alvo de estudo deste trabalho. A caracterização destes genes foi realizada através de estudos evolutivos, determinação do seu padrão de expressão em modelo animal e análise de modelagem estrutural. Durante o andamento do mestrado, ensaios paralelos revelaram resultados promissores na análise de expressão de genes relacionados ao sistema SOS, um mecanismo de resposta bacteriano a danos no material genético. Assim sendo, o estudo de caracterização de expressão em modelo animal suscetível e resistente à doença foi ampliado. Ensaios de qRT-PCR de cDNAs provenientes de pulmão, rim e fígado permitiram a identificação de dois genes que foram expressos quase que constitutivamente ao longo de toda a infecção em todos os órgãos e organismos estudados: fur979 e recA. Os demais foram requeridos em dias específicos da infecção. Quanto aos componentes do sistema SOS, observamos padrão de expressão específico para o rim, no quinto dia após a infecção. Para os estudos evolutivos de Fur foi gerada uma árvore filogenética que revelou o agrupamento de duas sequências da família Fur de Leptospira interrogans sorovar Copenhageni em ramos fechados com sequências muito similares a proteína Fur e Zur de Escherichia coli. Os outros dois ortólogos agruparam com as proteínas correspondentes nas demais espécies de Leptospira. Uma destas sequências apresentou padrão evolutivo específico dentre as espécies patogênicas. A modelagem da estrutura terciária, confirmou o padrão evolutivo obtido em nossa inferência filogenética. / Leptospirosis is a worldwide zoonosis caused by pathogenic bacteria from the genus Leptospira, order Spirochetales. Human beings are accidental hosts, and leptospirosis outbreaks occur in large urban centers after contact with contaminated waterby rodent urine. There are few informations concerning the mechanisms employed by Leptospira sppto deal with the stress induced by the host and the environment Iron is an essential ion to most of living beings. The regulation of genes involved in its uptake and maintenance in the bacterial cell is mediated by the transcriptional regulator family proteins, Fur (ferric uptake regulators). L. interrogans serovar Copenhageni possesses four orthologues for Fur, which were the focus of this work. The characterization of Leptospira Fur genes was done through evolutive studies, determination of their expression pattern on animal model and structural modeling analysis. In parallel, some experiments presented promising results for the expression analysis of genes related to the SOS system, a bacterial response mechanism to DNA damage. Therefore, the gene expression characterization on susceptible and resistant animal model was amplified. qRT-PCR experiments of cDNA from lung, kidney and liver allowed the identification of two genes expressed almost constitutively during the infection in all organs and organisms : fur979 and recA. The others were required in specific days of the infection. Curiously, the SOS system components showed specific expression pattern in the fifth day after inoculation, in kidney. For the Fur evolutive studies, a phylogenetic tree was inferred, revealing the clustering of two Fur family sequences from Leptospira interrogans serovar Copenhageni in closed branches with very similar sequences to Fur and Zur proteins from Escherichia coli. The other two orthologues clustered with corresponding proteins in the other Leptospira species. One of these sequences presented a specific evolutive pattern among pathogenic species. The tertiary structure modeling confirmed the evolutive pattern obtained in our phylogenetic inference.

A natureza heterogênea da Leucemia Mielóide Aguda (LMA) tornou-se um desafio para o sucesso da quimioterapia convencional com o agente Citarabina (Ara-C), especialmente em leucemias com prognóstico desfavorável, como aquelas portadoras do rearranjo MLL. Visto que as células de LMA-MLL são consideradas sensíveis ao Ara-C quando comparadas às leucemias que não apresentam o rearranjo, mas a recaída à doença é frequente, a presente tese propôs estudar a relação entre características biológicas relacionadas às bases da resistêmcia ao Ara-C em LMA-MLL. A abordagem proposta foi a seleção de subpopulações de linhagens celulares portadoras do rearranjo MLL submetidas ao tratamento em longo prazo com Ara-C, comparando-as com as linhagens não expostas à droga. As células foram caracterizadas quanto: 1) ao potencial proliferativo na presença ou ausência de Ara-C; 2) a distribuição das células no ciclo celular; 3) a distribuição de marcadores clássicos de superfície de células-tronco hematopoiéticas, CD34 e CD38; e 4) o perfil de expressão global dos RNAs transcritos. O tratamento em longo prazo selecionou células mais resistentes ao Ara-C que as células parentais. Além disso, quanto ao ciclo celular, as células selecionadas com Ara-C apresentaram apoptose reduzida (fase sub-G1), acúmulo na fase de síntese (fase S) e aumento da capacidade proliferativa após reexposição à droga (fase G2-M). Quanto à análise de marcadores de células-tronco hematopoiéticas, observou-se que após o tratamento em longo com Ara-C, uma das linhagens celulares apresentou distribuição bimodal do marcador CD38. Quando separadas por sorting em citometria de fluxo, observou-se que as subpopulações com níveis distintos de expressão de CD38, denominadas MV-4-11 CD38High e MV-4-11 CD38Low apresentaram resposta distinta ao tratamento com Ara-C. Quando avaliadas quanto ao perfil global de expressão gênica, constatou-se que MV-4-11 CD38High eram mais semelhantes às células parentais, e que MV-4-11 CD38Low formavam um grupo isolado, distinto das outras duas populações celulares. A análise de ontologia gênica (GO) evidenciou que entre as categorias mais representativas de processos biológicos estavam atividades associadas à capacidade proliferativa, ao desenvolvimento e a resposta a estímulos. As análises de agrupamentos hierárquicos mostraram que: 1) o cluster de genes do desenvolvimento HOXA estava mais expresso nas células MV-4-11 CD38Low do que em MV-4-11 CD38High, que apresentaram expressão mais elevada do cluster HOXB; 2) o gene HOX mais diferencialmente expresso foi HOXA13, associado na literatura com prognóstico desfavorável em outros tipos de câncer; 3) dos genes associados a resposta a estímulos, o único relacionado à via de metabolização do Ara-C diferencialmente expresso entre as linhagens foi NME1; 4) aqueles que participam das vias de reparo de pareamento incorreto, reparo por excisão de bases e por excisão de nucleotídeos encontraram-se mais expressos nas células MV-4-11 CD38High que em MV-4-11 CD38Low. Além disso, diversas quinases dependentes de ciclinas (CDKs) também estiveram diferencialmente expressas entre MV-4-11 CD38High e MV-4-11 CD38Low. Sugere-se por fim, que o modelo in vitro proposto neste estudo para simular a situação de resistência ao Ara-C em subpopulações de LMA-MLL, demonstrou que os mecanismos de resposta à Citarabina nesta doença, vão além de alterações na detoxificação e metabolização da droga, e parecem mais associados a vantagens proliferativas e do desenvolvimento das células leucêmicas. Estas vias devem ser exploradas como alvos potenciais na terapia combinada ao Ara-C. / The heterogeneity of Acute Myeloid Leukemia (AML) became a challenge for the success of the conventional chemotherapy agent Cytarabine (Ara-C), especially in leukemias with poor prognosis, as those harboring MLL rearrangement. Since AML-MLL cells are considered sensitive to Ara-C when compared with leukemias that do not carry the rearrangement, but relapse is frequent, the present dissertation proposed to study the relationship between biological characteristics related to the basis of chemoresistance to Ara-C in AML-MLL. We proposed an approach based on the selection of subpopulations of cell lines bearing MLL rearrangement submitted to the long-term treatment with Ara-C, comparing them with the cell lines that were not previously exposed to the drug. The cells were characterized according to: 1) the proliferative potential in the presence and absence of Ara-C; 2) the distribution of the cells in the cell cycle; 3) distribution of hematopoietic stem cell classic surface markers, CD34 and CD38; and, 4) global expression profile of transcribed RNAs. The long-term treatment selected cells that are more resistant to Ara-C than the cells that were not previously treated (parental cells). Besides, according to cell cycle, the cells selected by Ara-C treatment present decreased apoptosis (sub-G1 phase), accumulation in the synthesis phase (S-phase) and increase in the proliferative capability after re-exposition to the drug (G2-M phase). Regarding the hematopoietic stem cell markers, we observed that after Ara-C long-term treatment, one of the cell lines exhibited a bimodal distribution of the CD38 marker. When sorted by flow cytometry, we observed that both subpopulations with distinct levels of CD38 expression, called MV-4-11 CD38High and MV-4-11 CD38Low also showed distinct response to Ara-C. When evaluated regarding to their global gene expression profiles, we verified that MV-4-11 CD38High were more closely related to the parental cells, and MV-4-11 CD38Low made up an isolated group, distinct of the other cell populations. Gene ontology (GO) analysis revealed that among the most representative categories of biological processes, activities associated with proliferative capability, development and response to stimuli were included. The hierarchical clustering analysis showed that: 1) the cluster HOXA of genes of development was more expressed in the MV-4-11 CD38Low than in the MV-4-11 CD38High cells, that presented increased expression of HOXB cluster; 2) the most differentially expressed HOX gene was HOXA13, which according to the literature is associated with poor prognosis in other types of cancer; 3) among the genes associated with response to stimuli, the only one related to Ara-C-metabolizing pathway that was differentially expressed between the cell lines was NME1; 4) those genes that take part in the mismatch repair, base excision repair and nucleotide excision repair pathways were more expressed in the MV-4-11 CD38High than in the MV-4-11 CD38Low cells. Additionally, several cyclin-dependent kinases (CDKs) were also differentially expressed between MV-4-11 CD38High and MV-4-11 CD38Low. Finally, we suggest that the in vitro model proposed in this study to mimic the situation of chemoresistance to Ara-C in subpopulations of AML-MLL, showed that the mechanisms of Ara-C response in this disease, go beyond changes in drug detoxification and metabolization, and seem more associated to proliferative and development advantages of the leukemic cells. These pathways should be explored as potential targets to Ara-C combination therapies.

INTRODUÇÃO: A resposta ao tratamento no carcinoma epidermóide de cabeça e pescoço (CECCP) varia significantemente em diferentes casos e muitos pacientes não respondem ao tratamento e são expostos aos seus efeitos. A cisplatina é o quimioterápico mais utilizado no tratamento de CECCP e a quimioradioterapia é o método terapêutico usado nos carcinomas localmente avançado. Neste trabalho foram estudados possíveis marcadores de resposta a quimioradioterapia e sobrevida em pacientes portadores de CECCP, dentre eles a osteopontina (OPN) que tem sido associada à agressividade tumoral em vários cânceres e também tem sido relacionada a sobrevida, formam estudados também alguns polimorfismos em genes que estão relacionados com a cisplatina, seja na detoxificação deste fármaco, Glutationas S transferase (GSTP1, GSTT1 e GSTM1), seja no reparo dos danos causados no DNA pela via de excisão de nucleotídeos (XPD -751 e ERCC 118). CASUÍSTICA E MÉTODOS: Amostras de 69 pacientes localmente avançados submetidos à quimioterapia adjuvante ou exclusiva com cisplatina tiveram a sua OPN dosada pelo imunoensaio elisa em coletas realizadas antes e depois do término do tratamento. Para a análise dos polimorfismos, amostras de 95 pacientes localmente avançados tratados com quimioradioterapia com cisplatina exclusiva foram analisadas por PCR RFLP. RESULTADOS: Com relação à OPN, dos 69 pacientes estudados, a concentração da OPN antes do início da quimioradioterapia no grupo como um todo, foi de 102,5 ng/mL com uma mediana de 82,1 ng/mL. O correspondente valor da OPN após o tratamento n=46 foi de 104,0 ng/mL e mediana de 92,9 ng/mL. A OPN se mostrou mais elevada nos pacientes com maior tamanho tumoral, p=0,009 (ANOVA). Em análises correlacionado reposta ao tratamento e concentração de OPN, observamos que os pacientes que obtiveram resposta completa apresentaram menores níveis de OPN do que aqueles que não responderam ao tratamento. Quando realizamos uma análise multivariada notamos correlação entre baixa OPN antes do tratamento e uma melhor sobrevida global. Na análise dos polimorfismos (n=95), observamos que para os genes de reparo de DNA, XPD e ERCC, o genótipo mais freqüente foi C/T (n=43) e A/A (n=44), respectivamente. Para a GSTP1 a maior freqüência foi de A/G (47,4%) e para a GSTT1 e M1, vimos que a maioria dos pacientes, 83,2% mostrou ter GSTT1 funcional, enquanto 58,9% tiveram GSTM1 não funcional. Neste grupo de pacientes, não notamos nenhuma associação significante entre os genótipos dos pacientes e a resposta a quimioradioterapia, assim como não foi possível uma correlação entre a sobrevida global e os genótipos. CONCLUSÃO: Em síntese, a OPN após o término do tratamento pareceu estar associada com a resposta ao tratamento e com uma melhor sobrevida no grupo estudado e em relação aos polimorfismos, um aumento do número de amostras possa talvez mostrar alguma associação com resposta ao tratamento e a sobrevida global em pacientes com CECCP localmente avançados. / INTRODUCTION: The response to treatment in head and neck squamous cell carcinoma (HNSCC) varies significantly in different cases and many patients do not respond to treatment and are exposed collateral effects. Cisplatin is a chemotherapeutic used to treat HNSCC and chemoradioterapy is the major strategy used in locally advanced carcinomas. In this work, we studied potential markers for chemoradioterapy response and survival in HNSCC patients, such as osteopontin (OPN), which has been associated with tumor aggressiveness and survival. Furthermore, it was studied some genetic polymorphisms related to cisplatin detoxification (glutathione - S transferase, subtypes GSTP1, GSTT1 and GSTM1), as well genes involved in the repair of DNA damage by nucleotide excision (ERCC and XPD -751 - 118). METHODS: Plasmatic OPN levels, before and end of treatment, were measured in 69 patients with locally advanced tumors submitted to adjuvant chemotherapy with cisplatin only by ELISA. For polymorphism analysis, samples from 95 patients with locally advanced tumors treated with cisplatin alone were analyzed by PCR - RFLP. RESULTS: The OPN levels before the chemoradioterapy in the group (n=69) was 102.5 ng/mL with a median of 82.1 ng/mL. The corresponding value of OPN after treatment (n= 46) was 104.0 ng/mL and a median of 92.9 ng/mL. The OPN was higher in patients with larger tumor size, p = 0.009 (ANOVA). In tests correlated to treatment response and concentration of OPN, we observed that patients who achieved complete response had lower levels of OPN than those who did not respond to treatment. The multivariate analysis revealed that lower OPN levels before treatment significant a better overall survival. In the analysis of the polymorphisms (n = 95) the frequency of genotype for the DNA repair genes (XPD and ERCC), was C / T (n = 43) and A / A (n = 44), respectively. The most frequent genotype for GSTP1 was A/ G (47.4%), in 83.2% of the patients, the GSTT1 was functional, while in 58.9% of patients presented GSTM1 non-functional. In this group of patients, there was no any significant association between the genotypes and chemoradiotherapy response nor overall survival. CONCLUSION: In summary, plasmatic OPN levels after treatment cisplatin seemed to be associated with treatment response and better survival. However, larger sample size would be demonstrating some association with treatment response and overall survival in patients with locally advanced HNSCC.

O Diabetes Mellitus tipo 1 (DM1) resulta de um ataque autoimune contra as células pancreáticas, extinguindo a produção de insulina e levando à hiperglicemia. Evidências indicam uma associação entre o estresse oxidativo (que pode causar danos no DNA) e o DM1, sendo que apenas alguns trabalhos da literatura relataram a expressão de genes relacionados à respostas ao estresse oxidativo e reparo do DNA em DM1. Ainda, os microRNAs (reguladores pós-transcricionais da expressão gênica) estão envolvidos em vários processos biológicos e condições patológicas, mas informação sobre a expressão dos microRNAs em DM1 ainda é escassa. A fim de proporcionar um melhor entendimento sobre as vias de regulação de genes participantes de processos biológicos relevantes para o DM1, o presente estudo consistiu em analisar os perfis de expressão gênica (método de microarranjos) de microRNAs e de mRNAs (bem como de algumas proteínas) provenientes de células mononucleares do sangue periférico (PBMCs, do inglês peripheral blood mononuclear cells) de pacientes DM1 (n=19) em comparação com indivíduos sadios não diabéticos (n=11), dando maior enfoque a genes associados à resposta ao estresse oxidativo e reparo do DNA. Os resultados de expressão obtidos pelo método de microarranjos apontaram 44 microRNAs diferencialmente expressos (35 induzidos e nove reprimidos) nos pacientes DM1 e esses microRNAs apresentaram grande especificidade ao estratificar pacientes DM1 dos controles, incluindo hsa-miR-101, hsa-miR148a, hsa-miR-27b e hsa-miR-424, cujos dados de expressão foram confirmados por qRT-PCR. A análise funcional dos genes-alvo dos microRNAs, tanto dos induzidos quanto dos reprimidos, apontou 22 e 12 vias KEGG significativamente enriquecidas, respectivamente, incluindo vias relacionadas ao câncer. Com relação à análise de expressão de mRNAS, 277 genes diferencialmente expressos foram identificados nos pacientes DM1, sendo que 52% deles são potenciais alvos dos microRNAs diferencialmente expressos nos pacientes DM1. Dentre esses alvos foram encontrados genes candidatos ao desenvolvimento da doença, assim como genes implicados nos processos biológicos resposta ao estresse oxidativo e reparo do DNA, como UCP3, PTGS2, ATF3, FOSB, DUSP1 e TNFAIP3, cujos dados de expressão foram confirmados por qRT-PCR. Já a análise de grupos gênicos identificou 49 e 55 grupos gênicos significativamente expressos e enriquecidos em pacientes DM1, respectivamente, destacando-se vias relacionadas à sinalização apoptótica, resposta ao hidroperóxido, reparo do DNA por recombinação homóloga e resposta ao estresse do retículo endoplasmático. Quanto aos dados de expressão proteica (western blotting), PTGS2 e ATF3 não apresentaram níveis de expressão detectáveis em nenhum dos dois grupos estudados, enquanto que para DUSP1 não foi observada diferença estatisticamente significativa entre os grupos, apesar de os três genes se apresentarem induzidos em pacientes DM1. Os resultados do ensaio do gene repórter da luciferase demonstraram a ocorrência da interação entre hsa-miR-148a e DUSP1 em meio celular. Essa evidência aliada aos dados de western blotting, sugerem a possibilidade de hsa-miR-148a atuar na repressão traducional de DUSP1. Em conjunto, os resultados do presente estudo indicaram perfis distintos de expressão de microRNAs e mRNAs em PBMCs de pacientes DM1 comparados a indivíduos sadios, sendo que adicionalmente, dados inéditos relacionados à interação microRNAs-mRNAs em DM1 foram obtidos, principalmente associados à resposta ao estresse oxidativo e reparo do DNA, sugerindo um distúrbio na rede microRNA-alvo em pacientes DM1. / Type 1 Diabetes Mellitus (T1DM) results from an autoimmune attack against the pancreatic cells, ceasing insulin production, which causes hyperglycemia. Although associations between oxidative stress, which can cause DNA damage, and T1DM have been demonstrated, only a few studies have reported differential expression of genes associated with response to oxidative stress and DNA repair in T1DM patients. Moreover, microRNAs (post-transcriptional regulators of gene expression) are implicated in many biological processes and pathological conditions; however, only scarce information is available in the literature concerning the expression of microRNAs in T1DM. In order to better understand the regulatory pathways involved in biological processes that are relevant to T1DM, we aimed to investigate the microRNA and mRNA transcriptional expression profiles by microarray analysis (as well as expression of selected proteins) in peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) from T1DM patients (n=19) compared with healthy non-diabetic individuals (n=11), emphasizing genes related to response to oxidative stress and DNA repair. Microarray expression results indicated 44 differentially expressed microRNAs (35 up- and nine down-regulated) in T1DM patients, with those microRNAs possessing a discriminatory power to clearly stratify the patients from the controls, including hsa-miR-101, hsa-miR148a, hsa-miR-27b, and hsa-miR-424, whose expression data were confirmed by qRT-PCR. Functional annotation analysis performed on the predicted targets of the differentially expressed microRNAs pointed 22 and 12 annotated KEGG pathways for the overexpressed and repressed microRNAs, respectively, many of them related to cancer. Regarding mRNA microarray results, we detected 277 differentially expressed genes in T1DM patients, with 52% of them being potential targets of the differentially expressed microRNAs in T1DM patients. Among these targets, we identified candidate genes for T1DM as well as genes involved in the biological processes response to oxidative stress and DNA repair, such as UCP3, PTGS2, ATF3, FOSB, DUSP1 and TNFAIP3, whose expression data were confirmed by qRT-PCR. Furthermore, out of the 49 and 55 significantly expressed/enriched gene sets in T1DM patients, respectively, five pathways related to apoptotic signaling, response to hydroperoxide, DNA repair via homologous recombination, and response to endoplasmic reticulum stress were of interest for the present work. Concerning protein expression results (western blotting), PTGS2 and ATF3 expression was not detected for either the patient or the control group, while significant difference in DUSP1 expression was not observed between the two groups, although the corresponding mRNAs of those genes were found induced. Regarding the luciferase assay, our results demonstrated that the interaction between hsa-miR-148a and DUSP1 occurs in the cellular milieu. Therefore, these findings together with those western blotting results suggest that hsa-miR-148a could play a role in DUSP1 translational repression. Altogether, our results indicate distinctive microRNA and mRNA expression profiles in PBMCs from T1DM patients relative to healthy non-diabetic individuals. Furthermore, we have provided novel data regarding microRNA-mRNA interactions in T1DM, in particular involving genes associated with response to oxidative stress and DNA repair, suggesting a perturbation in the microRNA-target network in T1DM patients.